李歆，渠成名，韓英倫,2，劉欣,2，李慶偉,2

研究報告

七鰓鰻分子鑒定、重組表達及免疫學(xué)研究

李歆1，渠成名1，韓英倫1,2，劉欣1,2，李慶偉1,2

1. 遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，七鰓鰻研究中心，大連 116029 2. 大連工業(yè)大學(xué)，海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，大連 116034

高等脊椎動物的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2(SH2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase-2)由基因編碼，催化酪氨酸殘基去磷酸化，與其他能催化酪氨酸磷酸化的蛋白酪氨酸激酶共同調(diào)節(jié)機體內(nèi)多種信號通路的信號傳導(dǎo)。以往研究表明，SHP2在高等脊椎動物T細胞和B細胞的激活與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著重要作用。為了研究無頜類脊椎動物日本七鰓鰻()中與SHP2同源的分子——在免疫應(yīng)答反應(yīng)中的作用，本研究通過PCR 擴增獲取其開放閱讀框序列，并構(gòu)建到原核表達載體 pET-32a中，成功在大腸桿菌中實現(xiàn)重組蛋白表達并制備了其兔源多克隆抗體。用混合菌免疫刺激日本七鰓鰻后，通過實時熒光定量PCR和免疫印跡方法檢測了在日本七鰓鰻免疫相關(guān)組織中mRNA和蛋白水平表達譜。結(jié)果顯示，混合菌免疫刺激后，mRNA和蛋白表達在外周血白細胞和髓樣小體中無顯著變化，而在鰓組織中顯著性上調(diào)(<0.05)，說明Lja-SHP2在混合菌刺激后主要參與了鰓組織的免疫應(yīng)答反應(yīng)。為了進一步探究Lja-SHP2與淋巴細胞亞群免疫應(yīng)答反應(yīng)的相關(guān)性，本研究分別使用B細胞有絲分裂原脂多糖(lipopolysa-ccharide, LPS)和T細胞的有絲分裂原植物凝集素(phytohemagglutinin, PHA)免疫刺激日本七鰓鰻。經(jīng)LPS免疫刺激后，與對照組相比，白細胞中Lja-SHP2蛋白表達顯著上調(diào)，鰓組織和髓樣小體沒有顯著性差異表達；但經(jīng)PHA免疫刺激后，與對照組相比，白細胞、鰓組織和髓樣小體3種組織中Lja-SHP2均有上調(diào)，尤其在白細胞中上調(diào)最為顯著，大約是對照組的2.5倍，說明Lja-SHP2參與了日本七鰓鰻由PHA介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。由于PHA能刺激日本七鰓鰻鰓組織中VLRA+淋巴細胞的活化，這表明Lja-SHP2可能參與了PHA介導(dǎo)的VLRA+淋巴細胞亞群的免疫應(yīng)答反應(yīng)。上述研究結(jié)果為進一步探索Lja-SHP2在七鰓鰻免疫應(yīng)答過程中的功能奠定了基礎(chǔ)，也為揭示SHP2分子家族的系統(tǒng)發(fā)生及探索高等脊椎動物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的早期發(fā)生及其進化歷程提供一定的線索。

日本七鰓鰻；Lja-SHP2；抗體制備；免疫應(yīng)答

蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phospha-tases, PTPs)具有催化蛋白酪氨酸殘基去磷酸化的功能，與能夠催化蛋白酪氨酸磷酸化的蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases, PTKs)作用相反。在兩者的共同作用下，蛋白酪氨酸殘基發(fā)生可逆磷酸化，從而可以調(diào)節(jié)細胞膜酶聯(lián)受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，對生物的生長發(fā)育具有重要意義[1,2]。研究表明PTKs主要與致癌和促腫瘤活性相關(guān)，而PTPs通常在各種人類腫瘤細胞中發(fā)生突變或異?；罨?，表明其正常功能的維持會對腫瘤的發(fā)展起一定的抑制作用[3,4]。蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2 (SH2 domain-containing protein- tyrosine phosphatase-2, SHP2)是PTP家族中的一員，也是第一個被證實的原癌基因，廣泛表達于各種組織中，參與多種生物學(xué)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，是脊椎動物發(fā)育中不可缺少的胞內(nèi)非受體型PTP。人類SHP2蛋白由基因編碼，其氨基酸序列具有一個N端Src同源2 (N-terminal Src homology 2, N-SH2)結(jié)構(gòu)域、一個與N-SH2結(jié)構(gòu)域相鄰的C-SH2結(jié)構(gòu)域和一個跨度比較大的PTP結(jié)構(gòu)域。在SHP2分子的C端有兩個磷酸化位點(Y542與Y580)和一個富含脯氨酸基序的尾部[5~7]。N-SH2結(jié)構(gòu)域是一種構(gòu)象開關(guān)，在正常生理條件下，SHP2的N-SH2結(jié)構(gòu)域與其自身的PTP結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，抑制其磷酸酶活性。然而，SHP2如果通過其SH2結(jié)構(gòu)域與酪氨酸磷酸化生長因子受體或接頭蛋白結(jié)合則會導(dǎo)致這種分子內(nèi)相互作用被破壞，使其PTP結(jié)構(gòu)域上的催化活性中心暴露，從而激活其磷酸酶活性[8]。通過串聯(lián)的SH2結(jié)構(gòu)域識別雙磷酸化的配體是該開關(guān)的組成部分；而C端SH2結(jié)構(gòu)域雖然有助于提高結(jié)合能和特異性，但它被激活后并不能直接起作用[9]。

SHP2是一種分布廣泛的酪氨酸磷酸酶，作為轉(zhuǎn)導(dǎo)因子參與細胞內(nèi)由各種生長因子、激素或細胞因子介導(dǎo)的重要的信號通路[9,10]。如SHP2可以促進小GTP結(jié)合蛋白(Rat sarcoma, Ras)/絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)途徑激活[11]，而Ras/MAPK通路對細胞的增殖、分化和凋亡起著重要作用[12]。當(dāng)細胞受到生長因子的刺激后，SHP2作為正調(diào)控因子促進受體酪氨酸激酶激活的下游細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, Erk)/MAPK信號通路[13,14]，也可以增強由細胞因子IL-21激活的細胞增殖過程中ERK1/2信號傳導(dǎo)活性[15]。體外實驗證明，SHP2也能夠通過正向調(diào)控絲/蘇氨酸蛋白激酶Akt (serine/threonine protein kinases Akt, Akt)和Erk1/2信號傳導(dǎo)促進少突膠質(zhì)細胞的成熟[16]。SHP2在導(dǎo)致Erk激活的各種促有絲分裂信號傳導(dǎo)途徑中起著正調(diào)控作用[17]，但也有研究發(fā)現(xiàn)SHP2在介導(dǎo)細胞外信號調(diào)節(jié)和下游c-Jun氨基端激酶(c-Jun NH2-terminal kinases, JNK)信號通路的激活方面具有負調(diào)控作用。這也是酪氨酸磷酸酶SHP2在介導(dǎo)Erk和JNK、MAPK活化中具有負調(diào)控作用的第一個證據(jù)[18]。另外，SHP2在高等動物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)中也發(fā)揮著重要作用。Hoff等[19]發(fā)現(xiàn)SHP-2在T細胞受體(T cell receptor, TCR)介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中起重要作用，促進炎癥細胞因子的分泌、趨化因子誘導(dǎo)的遷移以及活化細胞的凋亡。

七鰓鰻(Petromyzoniformes)作為目前世界上僅存的最原始無頜類脊椎動物之一，承接了從無脊椎動物到脊椎動物的進化歷程，被稱為“活化石”[20]。由于其在進化上的特殊地位，七鰓鰻成為研究脊椎動物起源與進化的關(guān)鍵物種[21,22]。研究證明，在七鰓鰻體內(nèi)不僅存在著先天性免疫，同時存在著適應(yīng)性免疫，而七鰓鰻的適應(yīng)性免疫不同于高等脊椎動物。高等脊椎動物的適應(yīng)性免疫依賴于免疫球蛋白(Ig)及TCR和B細胞受體(BCR)分子介導(dǎo)，七鰓鰻的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)則是由可變淋巴受體(variable lymphocyte receptors, VLR)介導(dǎo)[23~25]。在無頜類脊椎動物中，其適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中最顯著的特征是使用富含亮氨酸的重復(fù)模塊來組裝可變淋巴細胞受體基因(和)[26]。為了更加清晰地了解無頜類脊椎動物是否存在作為適應(yīng)性免疫應(yīng)答信號傳導(dǎo)的重要調(diào)控因子SHP2，本研究在日本七鰓鰻()中克隆并鑒定了與高等脊椎動物SHP2同源的分子，研究SHP2在日本七鰓鰻免疫應(yīng)答過程中的作用，揭示SHP2家族的系統(tǒng)發(fā)生，為探索高等脊椎動物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的早期發(fā)生及其進化歷程提供一定的線索。

1 材料與方法

1.1 材料

選取捕撈于黑龍江省松花江流域的日本七鰓鰻，后飼養(yǎng)于遼寧師范大學(xué)七鰓鰻研究中心。雄性新西蘭兔()由本實驗室飼養(yǎng)。

RNAiso Plus、DEPC、pMD19-T載體、高保真酶PyrobestTMDNA Polymerase、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA Marker、DH5α感受態(tài)細胞、BL21感受態(tài)細胞、蛋白Marker、限制性內(nèi)切酶d III和R I、膠回收試劑盒、ELISA試劑盒等購于寶生物工程(大連)有限公司；IPTG、組織裂解液、辣根過氧化物酶羊抗兔二抗、辣根過氧化物酶羊抗鼠二抗和兔抗人P38多克隆抗體購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光液購于上海碧云天公司；RNA保護劑、組織凍存液和淋巴細胞分離液購自北京索萊寶公司。

1.2 目的基因PCR擴增

通過對本實驗室前期得到的日本七鰓鰻外周血轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)一條與高等脊椎動物SHP2同源的cDNA序列(命名為)，利用Primer Express軟件設(shè)計擴增引物(表1)。七鰓鰻麻醉處死后，取出髓樣小體裝于離心管中備用，再從髓樣小體中提取總RNA。以提取的RNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成單鏈cDNA。用制備好的cDNA為模板及表1所列引物進行嵌套PCR反應(yīng)，擴增的開放閱讀框(open reading frame, ORF)。擴增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；最后再72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并切膠回收連接T載體，由寶生物工程(大連)有限公司進行測序驗證。

1.3 同源序列對比和進化樹分析

通過NCBI分別搜索并選取脊椎動物各綱代表性物種的SHP1和SHP2分子的氨基酸序列，再通過BioEdit7.0將Lja-SHP2的氨基酸序列和各代表性物種的SHP1和SHP2分子的氨基酸序列進行多重序列比對分析。利用MEGA 6.0軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.4 原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建

利用Primer 5.0軟件設(shè)計帶有R I和d III酶切位點的引物，如表1所示。以克隆有完整的ORF區(qū)序列的T載體為模板進行PCR，對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，將帶有酶切位點的ORF區(qū)目的條帶進行切膠回收?；厥债a(chǎn)物進行R I和d III雙酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收。然后與雙酶切后帶有R I和d III粘性末端的pET-32a載體進行連接(16℃，3 h)，將連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中，并在含氨芐青霉素(ampicillin, AMP)的LB (Luria-Bertani)固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)過夜，挑取陽性菌落，接種到含6 μL AMP的6 mL LB培養(yǎng)基中，180 r/min震蕩培養(yǎng)過夜，集菌，提取質(zhì)粒由寶生物工程(大連)有限公司進行測序驗證。

1.5 重組蛋白提取與純化

取測序正確的重組質(zhì)粒2 μL轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta菌株中，涂平板37℃培養(yǎng)過夜，挑取經(jīng)檢測為陽性的菌落，接入含6 μL AMP的6 mL LB培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min 震蕩培養(yǎng)至對數(shù)期。加入0.1 mmol/L異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D- thiogalactoside, IPTG)誘導(dǎo)劑，22℃誘導(dǎo)4 h，4℃離心收集菌體之后，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate bu-ffer saline, PBS)重懸細胞，進行超聲破碎，分別獲得上清和沉淀，并進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)電泳檢測重組蛋白質(zhì)的可溶性。隨后利用組氨酸標(biāo)簽(Histidine-tag, His-Tag)親和凝膠層析方法進行大量純化。

表1 本研究使用的引物序列

1.6 免疫方法

將捕獲的日本七鰓鰻放置于10℃恒溫水族箱中，適應(yīng)1周后，分兩種方式進行免疫：一種是將健康成體日本七鰓鰻分為對照組和免疫組，每組均為5條，免疫組第一次注射50 μL的混合菌，每毫升混合菌含有白色念珠菌()、大腸桿菌()和金黃葡萄球菌()各1×107個，在注射7 d后進行第二次加強免疫；另一種是將健康的成體日本七鰓鰻分為對照組和脂多糖(lipopo-lysaccharide, LPS)組、植物凝集素(phytohe-magglu-tinin, PHA)組，每組5條，第一次分別注射200 μg LPS和PHA，在7 d后第二次加強免疫。這兩種免疫處理的日本七鰓鰻在第二次加強免疫3 d后再進行第三次加強免疫，免疫后24 h通過麻醉處死，分別斷尾取血分離外周血白細胞，解剖分離鰓組織，髓樣小體等免疫相關(guān)組織置RNA保護劑或者組織凍存液中，超低溫冰箱?80℃保存。

1.7 純化后抗體的制備與效價檢測

免疫前取兔血清作為陰性對照。首次免疫時，將400 μg純化后的重組Lja-SHP2蛋白(命名為rLja-SHP2)與500 μL費氏完全佐劑通過超聲破碎儀進行乳化，對新西蘭兔進行多點皮下注射。兩周后，將200 μg rLja-SHP2與500 μL不完全費氏佐劑進行乳化，同樣皮下注射，以后每隔兩周用同樣劑量的試劑免疫兔子。每隔一周將免疫后的兔子通過耳緣靜脈進行采血，通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme- linked immuno sorbent assay, ELISA)對抗體效價進行檢測，達到標(biāo)準(zhǔn)后，耳動脈取血，37℃孵育1 h后8000 r/min離心15 min分離血清。用Protein G柱進行純化。純化的抗體經(jīng)PBS過夜透析，測定抗體質(zhì)量濃度，加入甘油混勻分裝，–80℃低溫保存。

1.8 實時熒光定量PCR (qRT-PCR)技術(shù)檢測

用RNAiso方法提取外周血白細胞、鰓組織和髓樣小體的總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用表1設(shè)計的-qRT-PCR引物進行實時定量PCR反應(yīng)，以為內(nèi)參，分析在mRNA水平上混合菌刺激前后各組織的表達情況。所需引物見表1。擴增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸20 s，30個循環(huán)；最后再72℃延伸2 min，4℃保存。

1.9 免疫印跡檢測

將日本七鰓鰻斷尾取血之后，分離外周血白細胞、鰓組織和髓樣小體等新鮮組織，在2 mL離心管中加入適量裂解液，用研磨器冰浴勻漿，冰上放置30 min，進行4℃ 12 000 r/min離心，保留上清蛋白，加入上樣緩沖液，熱水煮沸8 min，制備成蛋白樣品。樣品先經(jīng)SDS-PAGE電泳，后轉(zhuǎn)膜75 min至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上，5%的脫脂奶粉封閉3 h，Lja-SHP2抗體按照1:1000的比例4℃孵育過夜，1×TBST緩沖液(Tris緩沖液加0.05% Tween-20)洗膜，每次10 min，共5次。按照1∶5000的比例加二抗(羊抗兔)，37℃孵育1 h，1×TBST緩沖液洗膜，每次10 min，共4次。配制增強化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence, ECL)發(fā)光液，利用FluorChem Q多色熒光、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 5.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)表示，兩組數(shù)據(jù)間比較采用檢驗分析，<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Lja-SHP2開放閱讀框的氨基酸序列比對及SHP家族系統(tǒng)進化分析

利用表1所設(shè)計的引物，通過PCR方法成功克隆并獲得基因完整的ORF區(qū)序列，全長1761 bp (GenBank登錄號：MN340315)，編碼587個氨基酸，分子式為C5114H8407N1823O2089S557，pI值為4.88，不穩(wěn)定系數(shù)為52.03，在溶液中為不穩(wěn)定蛋白。通過NCBI分別搜索并獲取不同物種的SHP1和SHP2的氨基酸序列，再通過BioEdit軟件將Lja-SHP2的氨基酸序列和其他具有代表性物種的氨基酸序列進行多重序列比對分析(附圖1)。結(jié)果顯示，日本七鰓鰻Lja-SHP2序列與人()、雞()、蟒蛇()、爪蟾()和斑馬魚()的SHP2序列一致性均大于65%，而與它們的SHP1序列一致性最高不到60%。通過SMART數(shù)據(jù)庫進行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示該蛋白與SHP2家族其他成員一樣都有兩個SH2結(jié)構(gòu)域、一個PTP結(jié)構(gòu)域和富含脯氨酸基序(SHP1分子沒有)。雖然序列相似度不高，但Lja-SHP2具有SHP2家族成員典型的保守結(jié)構(gòu)域，說明無頜類脊椎動物七鰓鰻中存在SHP2分子。

為了解SHP家族分子的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，本研究在現(xiàn)有的公共數(shù)據(jù)庫中查找各綱代表物種的SHP1和SHP2分子蛋白序列利用MEGA 4.0軟件的最小鄰接法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。結(jié)果顯示，無脊椎動物犬弓首蛔蟲()的SHP1-like以及寄生蛔蟲()的SHP2位于構(gòu)建系統(tǒng)上樹的外側(cè)，而來自脊索動物的44個SHP則位于樹的內(nèi)側(cè)，其中脊椎動物SHP1和SHP2分別聚成兩簇(自展值分別為100和88)，無頜類盲鰻()的SHP2位于脊椎動物SHP2的基部(自展值為92)。然而，該系統(tǒng)樹未能確定頭索動物文昌魚SHP1/2分子、盲鰻SHP1分子以及七鰓鰻Lja-SHP2分子與其他SHP分子的進化關(guān)系(自展值均低于52)。但基于脊椎動物早期進化中其基因組曾發(fā)生過兩輪倍增，以及文昌魚只存在一個基因、而盲鰻中存在兩個基因，本研究推測和基因出現(xiàn)的時間應(yīng)該發(fā)生在無頜類出現(xiàn)之前。

2.2 Lja-SHP2蛋白的重組表達、純化及兔源多克隆抗體制備

為了獲得Lja-SHP2的重組蛋白質(zhì)rLja-SHP2，將序列正確的Lja-SHP2-pET32a(+)重組子質(zhì)粒轉(zhuǎn)化導(dǎo)入Rosstta感受態(tài)細胞中經(jīng)IPTG，22℃誘導(dǎo)表達后進行SDS-PAGE檢測(圖2A)。結(jié)果顯示，在75 kDa附近有特異的蛋白條帶，與預(yù)期的目的蛋白大小一致，并且特異性條帶大部分在表達菌裂解液離心后的上清液中被檢測出來，說明重組表達的目的蛋白主要為可溶蛋白質(zhì)(圖2A)。經(jīng)His-Tag親和凝膠層析的純化后獲得純度較高的重組表達蛋白rLja-SHP2(圖2B)。

利用純化后的rLja-SHP2重組蛋白為抗原，按方法1.7中所描述的免疫方法免疫新西蘭兔，經(jīng)4次加強免疫后成功制備出兔抗Lja-SHP2多克隆抗體。利用親和層析法純化抗體后，使用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測效價，在按照1∶256 000稀釋后抗體效價依然能達到1.077 mg/mL (圖3A)。利用免疫印跡方法檢測抗體的特異性，結(jié)果顯示，兔抗Lja-SHP2多克隆抗體能夠特異性識別重組表達的rLja-SHP2蛋白(圖3B)。

2.3 混合菌刺激后日本七鰓鰻Lja-SHP2mRNA及蛋白在免疫相關(guān)組織中的表達譜

為模擬水生環(huán)境，用混合菌免疫刺激日本七鰓鰻。解剖分離未免疫及混合菌刺激24 h日本七鰓鰻的白細胞、鰓組織和髓樣小體并分別提取總RNA和制備總蛋白樣本。采用qRT-PCR方法檢測混合菌免疫前后mRNA在以上各組織中表達量的變化(圖4A)。結(jié)果表明，mRNA在未免疫日本七鰓鰻的各個組織中均有表達；混合菌免疫刺激后，mRNA在白細胞(0.14)和髓樣小體(0.37)中無顯著變化，而在鰓組織中有顯著性上調(diào)表達(0.041)。采用免疫印跡方法檢測混合菌免疫前后Lja-SHP2蛋白在以上各組織中的差異表達情況(圖4，B和C)。結(jié)果表明，與未免疫組相比經(jīng)過混合菌免疫刺激后，髓樣小體中Lja-SHP2蛋白無顯著變化(0.50)，白細胞中Lja-SHP2蛋白存在顯著性上調(diào)表達(0.03)，而鰓組織中Lja-SHP2蛋白存在極顯著上調(diào)表達(0.0005)。綜上所述，在混合菌免疫刺激后，日本七鰓鰻Lja-SHP2無論在mRNA水平還是在蛋白水平均在鰓組織中出現(xiàn)顯著上調(diào)表達，說明基因可能參與了七鰓鰻鰓組織中由混合菌誘導(dǎo)的的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

2.4 LPS和PHA刺激后日本七鰓鰻Lja-SHP2蛋白在免疫相關(guān)組織中的表達譜

為了進一步探究Lja-SHP2與類T淋巴細胞(VLRA)相關(guān)還是與類B淋巴細胞(VLRB)相關(guān)，參考文獻[27]的方法，本研究使用B細胞有絲分裂原LPS 和T細胞的有絲分裂原PHA免疫刺激日本七鰓鰻。取未免疫組和LPS、PHA刺激24 h日本七鰓鰻白細胞、鰓組織和髓樣小體，制備總蛋白樣本。結(jié)果顯示，經(jīng)LPS免疫刺激后，與對照組相比，Lja-SHP2在白細胞中有顯著的上調(diào)表達(0.036)，而在鰓組織(0.17)和髓樣小體(0.45)內(nèi)均沒有顯著性差異表達；經(jīng)PHA免疫刺激后，與對照組相比，Lja-SHP2在白細胞、鰓組織和髓樣小體中出現(xiàn)顯著性上調(diào)表達，分別為對照組表達量的2.5倍(=0.019)、1.4倍(=0.047)和1.5倍(=0.039) (圖4，D和E)。從圖4C和圖4E中可以看到，日本七鰓鰻Lja-SHP2分子在鰓組織中表達量最多，由于鰓組織中存在VLRA分子發(fā)育的胸腺樣組織，而PHA可以刺激類T (VLRA+)淋巴細胞亞群，以上結(jié)果表明Lja-SHP2分子可能參與了PHA介導(dǎo)的七鰓鰻VLRA+淋巴細胞亞群的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

圖1 SHP蛋白家族系統(tǒng)進化分析

各物種SHP1分子GenBank登錄號如下：，NP 002825.3；，XP 015322644.1；，XP 008527717.1；，NP 035332.1；，JAA21815.1；，XP 021251544.1；，NP 990299.1；，XP 013222199.2；，XP 021400341.1；，XP 010396607.3；，XP 007433583.1；，XP 013909624.1；，XP 006037101.1；，XP 014428393.1；，NP 001116928.1；，NP 001167468.1；，XP 004566999.1；，XP 005720092.1；，XP 024154742.1；，NP 956140.1；，ENSEBUT00000027999.1和，KHN78771.1。各物種SHP2分子GenBank登錄號如下：，NP 002822.2；，NP 001091486.1；，XP 008512219.1；，NP 038573.2；，XP 001163468.2；，XP 021251544.1；，NP 001026655.1；，PKK30453.1；，XP 021404788.1；，XP 010396607.3；，XP 007420474.1；，XP 013926432.1；，KY O39678.1；，XP 006124197.1；，NP 001116928.1；，NP 001167468.1；，XP 004550848.1；，XP 005731960.1；，XP 024123570.1；，NP 956254.1；，ENSEBUT00000028304.1；，MN340315；，Bb_155480R和，KRZ35185.1。

圖2 SDS-PAGE檢測Lja-SHP2的重組表達、可溶性及純化結(jié)果

A：Lja-SHP2的重組表達及可溶性檢測。M：蛋白Marker；1：轉(zhuǎn)化有pET32a(+)質(zhì)粒的表達菌裂解液(30℃培養(yǎng)4 h未添加IPTG誘導(dǎo))；2：轉(zhuǎn)化有Lja-SHP2-pET32a(+)重組質(zhì)粒的表達菌裂解液(30℃培養(yǎng)4 h未添加IPTG誘導(dǎo))；3：轉(zhuǎn)化有Lja-SHP2-pET32a(+)重組質(zhì)粒的表達菌裂解液(30℃培養(yǎng)4 h添加0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo))離心后上清液；4：轉(zhuǎn)化有Lja-SHP2-pET32a(+)重組質(zhì)粒的表達菌裂解液(30℃培養(yǎng)4 h添加0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo))離心后沉淀懸浮液；5：轉(zhuǎn)化有Lja-SHP2-pET32a(+)重組質(zhì)粒的表達菌裂解液(22℃培養(yǎng)4 h添加0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo))離心后上清液；6：轉(zhuǎn)化有Lja-SHP2-pET32a(+)重組質(zhì)粒的表達菌裂解液(22℃培養(yǎng)4 h添加0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo))離心后沉淀懸浮液。B：重組表達蛋白rLja-SHP2純化結(jié)果。M：蛋白Marker；1：Bsa標(biāo)準(zhǔn)蛋白；2：純化前表達菌裂解液；3：純化后rLja-SHP2重組蛋白。箭頭指示重組蛋白rLja-SHP2的位置。

圖3 Lja-SHP2多克隆抗體效價與特異性檢測

A：Lja-SHP2多克隆抗體的效價檢測；B：日本七鰓鰻Lja-SHP2多克隆抗體特異性檢測。

3 討論

SHP2作為蛋白酪氨酸磷酸酶家族成員之一，參與多條信號通路，如RAS/MAPK通路、PI3K/AKT通路及JAK/STAT通路等，不僅為脊椎動物胚胎發(fā)育所必需[28]，而且也參與多種組織特異性細胞的增殖、分化和凋亡的調(diào)控[29]。SHP2也是一種特殊的蛋白酪氨酸磷酸酶，它既可以作為正調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，也可以在特定條件下發(fā)揮負調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，與正常T細胞相比，在缺失的T細胞中Erk激酶活化受到阻礙；表明SHP2通過調(diào)節(jié)Erk途徑促進TCR信號傳導(dǎo)，是pre-TCR和TCR促進T細胞成熟和增殖的常用信號傳感器[30]。另外，SHP2通過介導(dǎo)T細胞發(fā)育和功能參與多種信號傳導(dǎo)途徑，可以調(diào)節(jié)細胞因子依賴性粒細胞生成，也是嗜酸性粒細胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[31]。

圖4 Lja-SHP2 mRNA和蛋白質(zhì)在各免疫相關(guān)組織中的相對表達量

A：混合菌免疫前后各免疫相關(guān)組織中mRNA的相對表達水平；B：免疫印跡檢測混合菌免疫24 h Lja-SHP2蛋白的表達情況；C：混合菌免疫24 h的Lja-SHP2蛋白的表達情況統(tǒng)計圖；D：免疫印跡檢測LPS和PHA刺激24 h Lja-SHP2蛋白的表達；E：LPS和PHA刺激24 h各組織中Lja-SHP2蛋白的表達水平統(tǒng)計圖。圖中所示數(shù)據(jù)均進行3組平行實驗。實驗結(jié)果以“mean±SD”表示，所有數(shù)據(jù)均進行檢驗，*：<0.05，表示有統(tǒng)計學(xué)意義；**：<0.01，表示差異顯著。

七鰓鰻雖然沒有基于B細胞受體(B cell receptor, BCR)、TCR和主要組織相容性復(fù)合體(major histo-compatibility complex, MHC)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，但七鰓鰻以VLRA+、VLRB+和VLRC+3種類淋巴細胞亞群作為其適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的基礎(chǔ)以抵御外來病原菌的侵襲[32]。研究證明，類T (VLRA+和VLRC+)淋巴細胞亞群在鰓中的胸腺樣組織內(nèi)發(fā)育，類B (VLRB+)淋巴細胞亞群在髓樣小體中發(fā)育[33]。本研究通過qRT-PCR擴增，結(jié)果顯示，在混合菌免疫刺激24 h后，的mRNA在白細胞和髓樣小體中的相對表達量無顯著變化，但在鰓組織中有顯著性上調(diào)(<0.05)。利用免疫印記方法檢測了Lja-SHP2蛋白在混合菌刺激前后各免疫相關(guān)組織內(nèi)的相對表達情況，結(jié)果顯示在白細胞和鰓組織中表達量上升，在髓樣小體中表達量無顯著差異；其結(jié)果與qRT-PCR測定的轉(zhuǎn)錄水平的表達結(jié)果基本一致。以上結(jié)果從mRNA和蛋白水平證明在混合菌免疫刺激后主要參與了鰓組織的免疫應(yīng)答反應(yīng)。對硬骨魚的研究表明，由于分布在魚類鰓中的淋巴細胞以 T 細胞為主，PHA比LPS對鰓組織T淋巴細胞的激活作用更加顯著[27]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)七鰓鰻經(jīng)PHA刺激之后，其鰓組織中的VLRA表達顯著上調(diào)[33]。本研究中，日本七鰓鰻經(jīng)PHA刺激之后，Lja-SHP2在白細胞、鰓組織和髓樣小體中都有顯著性的上調(diào)表達，其中在白細胞中上調(diào)表達最為顯著(<0.01)。由于外周血中的白細胞有可能是由鰓中胸腺樣組織發(fā)育的VLRA+淋巴細胞增殖補充來的，而成熟的VLRA+淋巴細胞不具備增殖能力，所以外周血中上調(diào)表達Lja-SHP2的白細胞可能是由鰓組織中被PHA激活的VLRA+淋巴細胞增殖后補充的結(jié)果。所以，本研究推測Lja-SHP2可能與VLRA+淋巴細胞亞群免疫應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)，但具體調(diào)節(jié)機制仍需進一步研究。然而，經(jīng)LPS免疫刺激后，Lja-SHP2只在白細胞中的表達量存在顯著性的上調(diào)表達，在鰓組織和髓樣小體中沒有顯著性的差異表達，說明Lja-SHP2和髓樣小體中的VLRB+淋巴細胞亞群的活化關(guān)系不大。

由于SHP2是一種分布廣泛的酪氨酸磷酸酶，作為細胞內(nèi)信號傳感器，其調(diào)控取決于與其結(jié)合的受體以及與下游信號通路的相互作用，后續(xù)仍需進行深入的研究來揭示Lja-SHP2在七鰓鰻免疫應(yīng)答中所起的具體作用機制。

附錄：

附圖1詳見文章電子版www.chinagene.cn。

[1] Gurzov EN, Stanley WJ, Brodnicki TC, Thomas HE. Protein tyrosine phosphatases: molecular switches in metabolism and diabetes., 2015, 26(1): 30–39.

[2] Rai PR, Madan DP, Somani RR. Protein tyrosine phosphatase SHP-2 as drug target., 2016, 13(5): 410–420.

[3] Li X, Tran KM, Aziz KE, Sorokin AV, Chen J, Wang W. Defining the protein-protein interaction network of the human protein tyrosine phosphatase family., 2016, 15(9): 3030–3044.

[4] Elson A. Stepping out of the shadows: Oncogenic and tumor-promoting protein tyrosine phosphatases., 2018, 96: 135–147.

[5] Bonetti M, Rodriguez-Martinez V, Paardekooper Overman J, Overvoorde J, van Eekelen M, Jopling C, Hertog Jd. Distinct and overlapping functions ofgenes in zebrafish development., 2014, 9(4): e94884.

[6] Chen C, Cao MM, Zhu SY, Wang CC, Liang F, Yan LL, Luo DQ. Discovery of a novel inhibitor of the protein tyrosine phosphatase SHP2., 2015, 5: 17626.

[7] Chan RJ, Feng GS.is the first identified proto- oncogene that encodes a tyrosine phosphatase., 2007, 109(3): 862–867.

[8] Hellmuth K, Grosskopf S, Lum CT, Würtele M,R?der N, von Kries JP, Rosario M, Rademann J, Birchmeier W. Specific inhibitors of the protein tyrosine phosphatase SHP2 identified by high-throughput docking., 2008, 105(20): 7275–7280.

[9] Hof P, Pluskey S, Dhe-Paganon S, Eck MJ, Shoelson SE. Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2., 1998, 92(4): 441–450.

[10] Griger J, Schneider R, Lahmann I, Sch?wel V, Keller C, Spuler S, Nazare M, Birchmeier C. Loss of(SHP2) drives satellite cells into quiescence., 2017, 6: e21552.

[11] Matozaki T, Murata Y, Saito Y, Okazawa H, Ohnishi H. Protein tyrosine phosphatase SHP-2: a proto-oncogene product that promotes Ras activation., 2009, 100(10): 1786–1793.

[12] Dance M, Montagner A, Salles J, Yart A, Raynal P. The molecular functions of SHP2 in the Ras/Mitogen-activated protein kinase (ERK1/2) pathway., 2008, 20(3): 453–459.

[13] Shi ZQ, Yu DH, Park M, Marshall M, Feng GS. Molecular mechanism for the SHP-2 tyrosine phosphatase function in promoting growth factor stimulation of Erk activity., 2000, 20(5): 1526–1536.

[14] Miura K, Wakayama Y, Tanino M, Orba Y, Sawa H, Hatakeyama M, Tanaka S, Sabe H, Mochizuki N. Involvement of EphA2-mediated tyrosine phosphorylation of SHP2 in SHP2-regulated activation of extracellular signal-regulated kinase., 2013, 32(45): 5292– 5301.

[15] Fuchikawa T, Nakamura F, Fukuda N,Takei K, Goshima Y. Protein tyrosine phosphatase SHP2 is involved in semaphorin 4D-induced axon repulsion., 2009, 385(1): 6–10.

[16] Liu XJ, Li YY, Zhang Y,Lu Y, Guo W, Liu P, Zhou JZ, Xiang ZH, He C. SHP-2 Promotes the maturation of oligodendrocyte precursor cells through Akt and ERK1/2 signaling., 2011, 6(6): e21058.

[17] Chen L, Sung SS, Yip ML, Lawrence HR, Ren Y, Guida WC, Sebti SM, Lawrence NJ, Wu J. Discovery of a novel SHP2 protein tyrosine phosphatase inhibitor., 2006, 70(2): 562–570.

[18] Shi ZQ, Lu W, Feng GS. The SHP-2 tyrosine phosphatase has opposite effects in mediating the activation of extracellular signal-regulated and c-Jun NH2-terminal mitogen-activated protein kinases., 1998, 273(9): 4904–4908.

[19] Hoff H, Brunner-Weinzierl MC. The tyrosine phosphatase SHP-2 regulates differentiation and apoptosis of individual primary T lymphocytes., 2007, 37(4): 1072–1086.

[20] Janvier P. Palaeontology: modern look for ancient lamprey., 2006, 443(7114): 921–924.

[21] Elphick MR. The evolution and comparative neurobiology of endocannabinoid signalling.. 2012, 367(1607): 3201–3215.

[22] Collin SP. Evolution and ecology of retinal photoreception in early vertebrates.. 2010, 75(3): 174– 185.

[23] Liang J, Liu X, Wu FF, Li QW. Progress of adaptive immunity system of agnathan vertebrate., 2009, 31(10): 969–976.梁佼, 劉欣, 吳芬芳, 李慶偉. 無頜類脊椎動物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的研究進展. 遺傳, 2009, 31(10): 969–976.

[24] Pancer Z, Amemiya CT, Ehrhardt GR, Ceitlin J, Gartland GL, Cooper MD. Somatic diversification of variable lymphocyte receptors in the agnathan sea lamprey., 2004, 430(6996): 174–180.

[25] Liu CJ, Huang HF, Ma F, Liu X, Li QW. Evolution of adaptive immune system in guinea-free vertebrates., 2008, 30(1): 13–19.劉岑杰, 黃惠芳, 馬飛, 劉欣, 李慶偉. 無頜類脊椎動物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的進化. 遺傳, 2008, 30(1): 13–19.

[26] Alder MN, Rogozin IB, Iyer LM, Glazko GV, Cooper MD, Pancer Z. Diversity and function of adaptive immune receptors in a jawless vertebrate., 2005, 310(5756): 1970–1973.

[27] Lin SH, Ellis AE, Davidson GA, Secombes CJ. Migratory, respiratory burst and mitogenic responses of leucocytes isolated from the gills of rainbow trout ()., 1999, 9(3): 211–226.

[28] Abbasi M, Gupta V, Chitranshi N, You YY, Dheer Y, Mirzaei M, Graham SL. Regulation of brain-derived neurotrophic factor and growth factor signaling pathways by tyrosine phosphatase Shp2 in the retina: A brief review., 2018, 12: 85.

[29] Qu CK, Yu WM, Azzarelli B,Cooper S, Broxmeyer HE, Feng GS. Biased suppression of hematopoiesis and multiple developmental defects in chimeric mice containing SHP-2 mutant cells., 1998, 18(10): 6075–6082.

[30] Nguyen TV, Ke Y, Zhang EE, Feng GS. Conditional deletion of SHP2 tyrosine phosphatase in thymocytes suppresses both pre-TCR and TCR signals., 2006, 177(9): 5990–5996.

[31] Xia LX, Hua W, Jin Y, Tian BP, Qiu ZW, Zhang C, Che LQ, Zhou HB, Wu YF, Huang HQ, Lan F, Ke YH, Lee JJ, Li W, Ying SM, Chen ZH, Shen HH. Eosinophil differentiation in the bone marrow is promoted by protein tyrosine phosphatase SHP2., 2019, 26(9): 1859–1860.

[32] Liu X, Song XY, Zhang XP, Han YL, Zhu T, Xiao R, Li QW. Genetic basis of immune response of lymphocyte- like cells in the mucosal immune system of., 2015, 37(11): 1149–1159.劉欣, 宋雪螢, 張曉萍, 韓英倫, 朱婷, 肖蓉, 李慶偉. 七鰓鰻鰓黏膜免疫系統(tǒng)類淋巴細胞免疫應(yīng)答遺傳基礎(chǔ). 遺傳, 2015, 37(11): 1149–1159.

[33] Guo P, Hirano M, Herrin BR, Li J, Yu C, Sadlonova A, Cooper MD. Dual nature of the adaptive immune system in lampreys.,2009, 459(7248): 796–801.

Identification, recombinant expression and immunological study ofin

Xin Li1, Chengming Qu1, Yinglun Han1,2, Xin Liu1,2, Qingwei Li1,2

Theprotein tyrosine phosphatase SHP2 of higher vertebrates, encoded bygene, catalyzes the dephosphorylation of tyrosine phosphorylation site, and plays regulatory roles in various signaling pathways by cooperating with other protein tyrosine kinase. Previous studies have shown that SHP2 plays an important role in the activation and signal transduction of T and B cells in higher vertebrates. To study the role of a SHP2 homologous molecule of lampreys () in immune response, we cloned and expressed the open reading frame sequence ofgene in prokaryotic expression vector pET-32a. The recombinant protein was successfully expressed inand the rabbit-derived polyclonal antibody was prepared.were immunized with mixed bacteria, and the mRNA and protein ofin immune-related cells and tissues were detected by real-time quantitative PCR and Western blotting after immunization. ThemRNA and protein were not significantly affected in leukocytes and supraneural myeloid bodies, but up-regulated significantly in gill tissues (<0.05) after challenged by mixed bacteria, which indicated that Lja-SHP2 mainly participates in the immune response of gill tissues after mixed bacteria stimulation.To further investigate whetherlevel was affected in three lymphocyte subsets, the B-cell mitogen lipopolysaccharide (LPS) and T-cell mitogen phytohaemagglutinin (PHA) were employed to boost the immune response in. LPS immune stimulation increased Lja-SHP2 in leucocytes significantly compared with the control group, and but had a marginal effect on Lja-SHP2 expression in gills and supraneural myeloid bodies. PHA immune stimulation could up-regulate Lja-SHP2 level in leukocytes, gill tissues and supraneural myeloid bodies. The change of Lja-SHP2 was especially dramatical in leukocytes, which was about 2.5 times higher than that in the control group, suggesting that Lja-SHP2 is involved in the lamprey immune response mediated by PHA. Consistent with the previous finding that PHA could induce the activation of VLRA+lymphocytes, our results showed that Lja-SHP2 might be included in the immune response of VLRA+lymphocytes mediated by PHA in gills. This research will benefit exploring the functions of Lja-SHP2 in the immune response of lamprey and will provide clues for understanding the phylogenesis of SHP2 molecular family, and its roles in the early occurrence and evolution of adaptive immune system in higher vertebrates.

; Lja-SHP2; antibody preparation; immune response

2019-09-02;

2019-11-15

國家自然科學(xué)基金項目(編號：31801973)和遼寧省教育廳科研基金重點項目(編號：LZ201783601)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31801973) and the Liaoning Provincial Department of Education Research Fund Key Project (No. LZ201783601)]

李歆，碩士，專業(yè)方向：細胞生物學(xué)。E-mail: 18342267920@163.com

劉欣，博士，教授，碩士生導(dǎo)師；研究方向：細胞生物學(xué)。E-mail: liuxin@lnnu.edu.cn

李慶偉，博士，教授，博士生導(dǎo)師；研究方向：細胞生物學(xué)。E-mail: liqw@263.net

10.16288/j.yczz.19-260

2020/1/9 10:35:51

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.r.20200108.1642.003.html

(責(zé)任編委: 胡煒)