王濤濤，楊勇，魏唯，林辰濤，馬留銀

研究報告

互花米草NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定與表達分析

王濤濤1,2，楊勇1,2，魏唯2，林辰濤2，馬留銀2

1. 福建農(nóng)林大學林學院，福州 350002 2. 福建農(nóng)林大學基礎林學與蛋白質(zhì)組學研究中心，福州 350002

互花米草()作為一種海岸帶鹽生植物，高度耐鹽脅迫，但因為缺少參考基因組，其耐鹽的分子機制卻尚未見報道。NAC家族蛋白是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控植物的生長發(fā)育和脅迫應答。為了鑒定互花米草NAC蛋白(SaNAC)并探究它們與互花米草生長發(fā)育及脅迫響應之間的關系，本研究以互花米草三代全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為參考，通過與水稻()、擬南芥()和玉米()NAC蛋白序列進行比對，并結(jié)合保守功能域進一步篩選，最終找到62個SaNAC蛋白。從蛋白序列比對、進化、motif預測、同源性比較、亞細胞定位、組織表達以及非生物脅迫下的基因差異表達等方面分別對互花米草NAC家族成員進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SaNAC蛋白均含有保守的NAM結(jié)構(gòu)域，且在進化上與水稻NAC家族具有一定的相似性；SaNAC家族中的兩個蛋白SaNAC9和SaNAC49在細胞核表達；另外，本研究還發(fā)現(xiàn)互花米草基因表達具有高度組織和脅迫應答差異性。這些結(jié)果表明互花米草NAC轉(zhuǎn)錄因子家族不僅具有保守的功能域，而且在調(diào)控互花米草的生長發(fā)育和非生物脅迫響應過程中具有重要的作用。

互花米草；NAC；轉(zhuǎn)錄因子；基因家族；基因表達

由于固定生長的特點，植物極度依賴其所在的生存環(huán)境，因此環(huán)境因素對植物生長發(fā)育有著深遠的影響[1]。其中，土壤鹽漬化是制約植物生產(chǎn)的主要環(huán)境壓力之一，高鹽脅迫誘使細胞膜解體、產(chǎn)生活性氧、削弱代謝過程、抑制光合作用和減弱營養(yǎng)吸收，進而延緩植物生長和發(fā)育、降低農(nóng)林作物品質(zhì)[2]。因此，研究植物高鹽耐受性的調(diào)控機理具有十分重要的理論與實踐價值。

轉(zhuǎn)錄因子是一類重要的調(diào)控子，一般通過結(jié)合在脅迫相關基因的順式作用元件，參與植物對干旱、高鹽、低溫等非生物脅迫的響應[3]。NAC (NAM、ATAF1/2和CUC2)家族是植物特有的且最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。NAC家族蛋白在N端擁有一個大約160個氨基酸殘基大小的保守區(qū)域，該區(qū)域被進一步分為5個亞結(jié)構(gòu)域(A~E)[4,5]。在植物中，NAC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控大量的生長過程，包括花形態(tài)建成[6]、根部發(fā)育[7]、葉片衰老[8]和種子萌發(fā)[9]等。同時NAC轉(zhuǎn)錄因子也參與植物各類脅迫應答過程[10]，例如小麥() NAC家族因子TaNAC2TaNAC47和TaNAC67在促進自身耐多種脅迫壓力過程中具有重要的作用[11~13]，林木類植物剛毛檉柳() ThNAC13因子能促進檉柳和擬南芥()更加耐鹽及滲透脅迫[14]，表明NAC轉(zhuǎn)錄因子在促進農(nóng)林物種耐脅迫改良方面均具有重要的利用價值。

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的植物NAC家族被發(fā)掘和鑒定，大大加速了NAC蛋白在調(diào)控植物生長發(fā)育和脅迫應答方面的研究。研究人員不僅在擬南芥和水稻()中發(fā)現(xiàn)117和151個NAC蛋白[15]，在大豆()和烏拉爾圖小麥()中也發(fā)現(xiàn)含有152和87個NAC蛋白[16,17]。同時，在一些林木植物如果梅()、白梨()和海岸松()中也分別識別出113、146和37個NAC因子[18~20]。分析NAC家族因子有助于探究植物在非生物脅迫下的應答機理，然而大多數(shù)植物因為缺少高質(zhì)量的參考基因組，NAC家族還沒有被系統(tǒng)地鑒定和研究。第三代轉(zhuǎn)錄組測序(Pacbio單分子測序)技術(shù)的誕生為很多缺少基因組的物種提供了可參考的全長轉(zhuǎn)錄組序列[21]，在一定程度上解決了這些物種家族分析研究上的難題。

互花米草()作為耐鹽性良好的鹽生植物，自1979年引入我國以后，廣泛分布于沿海地區(qū)的潮灘及河口灣地帶，根系發(fā)達，莖稈粗壯，能夠忍受惡劣的氣候和環(huán)境，尤其是高鹽脅迫。本研究以互花米草為對象，將全長轉(zhuǎn)錄組序列作為參考，通過與擬南芥、水稻和玉米NAC蛋白序列進行比對，并經(jīng)過功能域分析和篩選，獲得62個SaNAC蛋白，隨后從序列比對、進化比較、蛋白定位、組織表達以及非生物脅迫下的基因差異表達等角度對SaNAC家族進行系統(tǒng)的分析，完成了NAC轉(zhuǎn)錄因子家族在互花米草轉(zhuǎn)錄組水平上的初步鑒定以及在生長發(fā)育和脅迫響應過程中的表達分析，為進一步探究互花米草NAC蛋白功能及遺傳應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

互花米草種子和植株采自江蘇省贛榆市(E119°16?, N34°46?)，把種子浸泡在1.5%鹽水中并且儲存于4℃以備長期使用。幼苗種植：將互花米草種子放在含1/2 Hoaglang營養(yǎng)液的濾紙上萌發(fā)7 d，然后轉(zhuǎn)移至含有營養(yǎng)液的生長盒中繼續(xù)生長3周，期間每隔3 d更換一次營養(yǎng)液。鹽處理：將互花米草幼苗分別培養(yǎng)在正常營養(yǎng)液以及含350、500和800 mmol/L NaCl的營養(yǎng)液中24 h，然后進行整株取樣并立即置于液氮保存。干旱處理：將4周大的互花米草幼苗放在干燥的濾紙上，分別在第0 h、1 h、8 h和24 h取樣并立即置于液氮保存。ABA處理：將4周大的互花米草幼苗放入含有100 μmol/L ABA[22]的營養(yǎng)液里培養(yǎng)，分別在第0 h、1 h、8 h和24 h取樣并凍存。

1.2 互花米草NAC家族的鑒定

擬南芥、水稻以及玉米NAC家族蛋白序列從植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫上(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)下載，互花米草全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來自于第三代Pacbio測序數(shù)據(jù)[23]，通過ORF預測(http://bioinformatics. ysu.edu/tools/OrfPredictor.html)獲得所有互花米草轉(zhuǎn)錄本對應的氨基酸序列。將擬南芥、水稻以及玉米的NAC蛋白序列分別與互花米草蛋白序列進行比對，值取小于?50，得到所有與NAC蛋白序列相似性較高的互花米草轉(zhuǎn)錄本序列號。根據(jù)序列號在互花米草轉(zhuǎn)錄組網(wǎng)站(http://plantpolya.org/SAPacBio/)下載對應的轉(zhuǎn)錄本序列并通過ORF預測得到對應的氨基酸序列。將所有可能的SaNAC蛋白序列放在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)中進行保守功能域預測，去除不含NAC功能域的蛋白，并得到最終的互花米草NAC家族蛋白。在ProtPaeam (https://web.expasy.org/protparam/)上進行SaNAC蛋白氨基酸數(shù)量、分子量和等電點的分析，同時在Protcomp 9.0 (http://linux1.softberry.com/berry.phtml? topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc)上進行蛋白亞細胞定位預測。

1.3 序列比較、同源進化樹分析和motif預測

利用DNAMAN軟件進行復合序列比對，保守的結(jié)構(gòu)域參照擬南芥和水稻的NAC家族進行劃分[5]。利用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，選擇Neighbour- Joining方法，并設置自檢次數(shù)為1000次。利用MEME (http://meme-suite.org/)進行motif預測，數(shù)量設置為10。

1.4 煙草瞬時表達

利用基因特異性引物(表1)從互花米草cDNA中擴增和基因全長CDS序列，并連接到植物表達載體pCambia3301上GFP標簽的N端，隨后將載體借助農(nóng)桿菌AGL0瞬時轉(zhuǎn)入煙草(L)葉片中。煙草浸染實驗步驟：首先從轉(zhuǎn)化目的載體的培養(yǎng)板上挑取單克隆菌落培養(yǎng)并進行PCR鑒定，然后取200 μL陽性菌液接入50 mL含有10 mmol/L MES、20 μmol/L 乙酰丁香酮以及相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。第二天，將菌液離心(4000 r/min，15 min)，并用適量體積重懸液(10 mmol/L MES、150 μmol/L乙酰丁香酮、10 mmol/L MgCl2)將沉淀混勻至值為1.0~1.5之間，重懸的菌液放置室溫2 h后用無菌注射器輕輕注射入新鮮煙草的葉片中，并對注射位置進行標記。將煙草放在暗室過夜培養(yǎng)后繼續(xù)放置溫室生長1~2 d。進行顯微觀察時，取小塊注射位置的葉片浸泡在1 mg/L的DAPI染液中30 min，分別在倒置顯微鏡(型號Zeiss Axio Observer.A1)下觀察SaNAC9、SaNAC49以及對照蛋白在GFP和DAPI通道下的熒光表達，找到同時表達的核定位信號后與明場圖片進行重疊。

1.5 SaNAC基因家族表達模式分析與驗證

1.5.1 RNA-seq數(shù)據(jù)分析

表達模式分析參考互花米草轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果[23]，RNA-seq數(shù)據(jù)從Bioproject(PRJNA413596)下載。使用bowtie2 (v2.2.9)[24]將測序數(shù)據(jù)與互花米草全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行比對，然后對數(shù)據(jù)進行均一化處理，最后使用RSME[25]對處理后的數(shù)據(jù)進行計算，得到基因標準化后的表達量FPKM值。

表1 本研究使用的引物序列

下劃線部分代表載體構(gòu)建接頭序列。

1.5.2 RT-PCR驗證

用試劑盒(廣州美基生物公司，R4151-02)提取不同組織(葉、莖、根和地下莖)以及脅迫處理的互花米草幼苗總RNA，具體操作參照說明書進行，對RNA進行定性定量檢測確保其質(zhì)量滿足后續(xù)實驗。取1 μg RNA，利用MonScript? RTIII All-in-One Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(武漢莫納生物公司，RN05004M)合成第一鏈cDNA，具體操作參照說明書進行，將cDNA的濃度稀釋至5 ng/μL后備用。挑選、、、、、、、、、、和基因進行RT-PCR驗證，引物序列如表1所示。擴增前先用內(nèi)參基因?qū)δ０暹M行均一化，然后取合適體積的模板進行PCR。PCR反應體系：10 μL MonAmp? 2× Taq Mix (武漢莫納生物公司，MP05001)，0.5 μL正向引物，0.5 μL反向引物，適當體積的模板cDNA，適量體積RNAse-free水，總體系20 μL。反應程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃ 5 min。

1.5.3 qRT-PCR驗證

通過qRT-PCR驗證、、、、、、、、、、、、、、和基因在互花米草葉、莖、地下莖和根部的表達量，同時驗證、、、、、、、、、、和基因在ABA及干旱處理下的表達量。引物在Primer3 (http://primer3.ut.ee/)網(wǎng)站上設計，GC含量在40%~60%且值在55℃~65℃之間，序列如表1所示。每個qRT-PCR反應體系包含1 μL正反向引物(10 μmol/L)、1 μL cDNA模板、7 μL RNAse-free水和10 μL SYBRGreen Master Mix(莫納生物，RN04002M)。反應程序為95℃ 5 min；95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)。樣本之間的表達量差異使用-test進行計算，值小于0.01定義為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 互花米草NAC轉(zhuǎn)錄因子家族鑒定

為了從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中鑒定出含有功能域的NAC轉(zhuǎn)錄因子，本研究首先對復合序列比對產(chǎn)生的所有可能NAC蛋白進行保守功能域分析。CDD (Conserved Domain Database)預測結(jié)果顯示，62個SaNAC蛋白在N端均含有NAM結(jié)構(gòu)域(附圖1)。NAM是NAC家族蛋白特有的結(jié)構(gòu)域(NAM、ATAF1/2和CUC2)之一，也是NAC轉(zhuǎn)錄因子能夠發(fā)揮結(jié)合功能的關鍵區(qū)域，預測結(jié)果表明62個SaNAC蛋白均是具有潛在NAC功能的轉(zhuǎn)錄因子。

根據(jù)三代全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對所有互花米草基因的命名[23]，按從小到大的順序?qū)⒒セ撞軳AC蛋白命名為SaNAC1~SaNAC62，然后根據(jù)氨基酸序列對所有SaNAC蛋白的基礎特征包括氨基酸數(shù)量、蛋白分子重量、等電點以及蛋白定位進行預測(表2)。通過分析發(fā)現(xiàn)，SaNAC蛋白大小介于186~ 858個氨基酸之間，蛋白分子量則介于21.2~93.2 kDa之間，其中SaNAC6和SaNAC15分別對應最大和最小的蛋白。所有SaNAC蛋白的等電點在4.3~ 10.7之間，SaNAC47和SaNAC2蛋白分別具有最大和最小的等電點。蛋白定位預測結(jié)果顯示大多數(shù)SaNAC蛋白定位在細胞核，少數(shù)蛋白定位在細胞外(表2)。

表2 互花米草NAC蛋白基本信息

續(xù)表

2.2 蛋白序列比對及功能域分析

復合序列比對分析結(jié)果顯示，所有的互花米草NAC蛋白在N端都具有保守的NAC結(jié)構(gòu)域(圖1)，這與擬南芥和水稻的報道結(jié)果相一致[5]。除了少數(shù)基因具有不完整的NAC結(jié)構(gòu)域外，大多數(shù)基因具有5個保守的亞結(jié)構(gòu)域(A~E)。其中，蛋白SaNAC2、SaNAC3、SaNAC13和SaNAC60缺少A、B結(jié)構(gòu)域；SaNAC58缺少B、C結(jié)構(gòu)域；SaNAC25缺少A、B和C結(jié)構(gòu)域；SaNAC46、47、51和53缺少E結(jié)構(gòu)域。蛋白序列比對結(jié)果進一步證明了SaNAC家族蛋白在N端具有保守的NAM功能域(A~D)，表明SaNAC轉(zhuǎn)錄因子可能與其他植物NAC蛋白功能相似。

為了研究互花米草NAC轉(zhuǎn)錄因子之間的進化關系，本研究利用62個SaNAC蛋白序列構(gòu)建NJ進化樹。通過進化樹分析將互花米草NAC家族分成9個小組，分別命名為a~I (圖2)。其中小組e中包含最多的SaNAC蛋白，有12個，小組b中的SaNAC蛋白最少，只有2個，分別是SaNAC4和SaNAC10。為了進一步探究NAC蛋白功能域之間的關系，對所有的SaNAC蛋白序列進行motif分析(MEME)，通過預測最終獲得10個保守的motif (motif 1~10) (圖2)。分析motif與蛋白結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)motif 3、4、1、7、2和5分別對應SaNAC轉(zhuǎn)錄因子N端5個保守的亞結(jié)構(gòu)A~D，其中motif 2和motif 7共同組成結(jié)構(gòu)域D。另外，SaNAC11、29、36、38、40和58蛋白缺少motif 1和4，但是都擁有motif 6。Motif 8則主要存在于小組d和h中，而motif 9則出現(xiàn)在一些SaNAC蛋白的C端。結(jié)合小組分類分析motif，發(fā)現(xiàn)小組g中的全部NAC蛋白均具有不完整的NAC亞結(jié)構(gòu)，而小組a、b、d里的NAC蛋白亞結(jié)構(gòu)最為完整，其他小組里都有個別基因缺少某些亞結(jié)構(gòu)(圖2)。

圖1 互花米草NAC蛋白序列比對

黑色線框圈出的位置代表不同的亞結(jié)構(gòu)域A~E，不同顏色代表序列之間的相似性程度(黑色>紅色>綠色>黃色)，線框下方的Logo代表對應亞結(jié)構(gòu)域的保守序列。

圖2 互花米草NAC家族進化及MEME分析

左側(cè)為SaNAC家族NJ進化樹，a~i代表進化樹不同的小組；右側(cè)為SaNAC蛋白MEME預測結(jié)果，1~10代表不同的motif。

2.3 互花米草與水稻NAC家族進化分析

為了探究互花米草與水稻NAC家族成員之間的進化關系，本研究利用MEGA7軟件構(gòu)建互花米草與水稻NAC蛋白NJ進化樹(圖3)。結(jié)果顯示，所有NAC蛋白被分為12個小組(Ⅰ~Ⅻ)，其中小組Ⅰ中蛋白數(shù)量最多，包含11個SaNAC和18個OsNAC蛋白，小組Ⅲ中蛋白數(shù)量最少，不包含SaNAC蛋白。小組Ⅷ和Ⅺ中也只包含1個(SaNAC9)及2個(SaNAC36和SaNAC44) SaNAC蛋白，說明互花米草基因組在長期的進化過程中可能丟失了一些基因。但是，幾乎所有小組都同時包含互花米草和水稻NAC蛋白，表明兩個物種的NAC家族在進化水平上具有一定的相似性。

2.4 互花米草NAC蛋白亞細胞定位

蛋白定位預測結(jié)果表明大多數(shù)互花米草NAC轉(zhuǎn)錄因子定位在細胞核中(表1)。為了進一步驗證SaNAC蛋白的表達定位，本研究將和基因全長CDS序列克隆到植物表達載體pCambia3301中，并利用煙草瞬時轉(zhuǎn)化系統(tǒng)將目的載體和空載體對照同時轉(zhuǎn)入煙草葉片表皮中。通過對SaNAC蛋白表達GFP信號的觀察以及煙草葉片細胞核的染色，可以清楚的發(fā)現(xiàn)SaNAC9和SaNAC49蛋白在煙草表皮細胞的細胞核中表達(圖4)。

圖3 互花米草與水稻NAC家族系統(tǒng)進化樹

Ⅰ~Ⅻ分別代表進化樹的不同小組。

2.5 互花米草NAC基因在不同組織中的表達特征

為了研究基因在互花米草不同組織中的表達情況，本研究隨機挑選16個基因，并通過qRT-PCR檢測它們在互花米草的葉、莖、根以及地下莖中的表達量。結(jié)果顯示，這些基因在互花米草不同組織中的表達量各不相同，其中、和在葉片表達量最高，而和則在地下莖中有較高的表達量(圖5)。另外，和在根部有較高的表達量，這些基因在莖中的表達量都相對較低(圖5)。結(jié)果顯示，基因的表達具有一定的組織差異性，表明基因可能與互花米草的生長發(fā)育有關。

圖4 互花米草NAC蛋白亞細胞定位

BF代表明場通道下的細胞，GFP和DAPI分別代表綠色熒光和細胞核信號，Merge代表BF、GFP和DAPI圖像的重疊。所有圖像在顯微鏡下放大倍數(shù)：20′。

2.6 互花米草NAC基因在鹽脅迫下的表達特征

為了探究基因在鹽脅迫下的表達特征，結(jié)合不同濃度(0、350、500以及800 mmol/L)NaCl處理下的互花米草RNA-seq測序數(shù)據(jù)[23]，對所有基因的表達水平進行了系統(tǒng)分析。通過不同鹽濃度處理下的表達熱圖可以看出，大部分基因在鹽處理下發(fā)生了差異表達(圖6A)，說明鹽脅迫可以調(diào)控基因的表達。其中和隨著鹽濃度的升高表達量持續(xù)降低(圖6A)，表明這些基因可能負向調(diào)控互花米草的鹽脅迫響應。在800 mmol/L高鹽處理時，與對照組相比，以及等25個基因表達量顯著增加，基因的表達量上調(diào)最多，增加近60倍，表明高鹽對基因具有顯著調(diào)控作用。其中S以及等10個基因隨著鹽濃度的增加，表達量呈逐漸上升趨勢(圖6A)。另外，一些基因隨著鹽濃度的增加，表達量呈先升高后降低的趨勢，例如以及等(圖6A)，表明這些基因雖然受鹽脅迫的調(diào)控，但具有一定的濃度范圍，一旦超過最適的濃度，則開始發(fā)生負向調(diào)控。為了證明RNA-seq數(shù)據(jù)分析的可信性，本研究挑選了、、、、、、、、、、和基因進行RT-PCR驗證(圖6B)，實驗結(jié)果與RNA-seq分析結(jié)果基本一致，進一步證明鹽脅迫調(diào)控互花米草NAC家族基因的表達。

2.7 互花米草NAC基因在ABA處理下的表達特征

NAC家族除了調(diào)控植物響應鹽脅迫，還參與多種脅迫的調(diào)控過程[12,13]。脫落酸(abscisic acid, ABA)信號通路已被確定為植物非生物脅迫反應的中樞調(diào)節(jié)因子,可以引起植物生理反應和基因的表達[26]，為了探究互花米草基因在ABA脅迫下的表達變化，對12個隨機的基因在ABA處理下的表達量進行檢測。qRT-PCR結(jié)果顯示，在ABA處理下，大部分檢測的基因發(fā)生了表達量的改變(圖7)。其中，及的表達隨著ABA處理時間的增加逐漸降低，、、及則在ABA處理下呈現(xiàn)顯著上調(diào)的趨勢，這些基因中只有的表達水平?jīng)]有受到ABA的影響(圖7)，表明基因的表達受到ABA的調(diào)控。

圖5 16個SaNAC基因組織表達特征

每個樣品取3個生物學重復，葉片的表達量被均一化成1。

2.8 互花米草NAC基因在干旱處理下的表達特征

與ABA脅迫類似，植物對干旱脅迫的應答同樣是一個復雜的調(diào)控過程[27]。研究表明水稻ONAC066和ONAC095蛋白都參與干旱脅迫的調(diào)控[28,29]，大豆NAC家族因子在抗旱過程中也具有重要作用[30]，表明NAC蛋白是植物干旱脅迫響應過程中的重要調(diào)控子。本研究對12個基因在干旱脅迫下的基因表達進行qRT-PCR驗證，結(jié)果顯示，與ABA脅迫類似，干旱脅迫促進大多數(shù)基因發(fā)生差異表達(圖8)。其中和在干旱處理時表達量均呈顯著上調(diào)趨勢，且除在干旱脅迫下表現(xiàn)出顯著下調(diào)的趨勢，其中和基因的表達量在1 h干旱處理時先降至最低，然后隨著處理時間的增加開始逐漸增加(圖8)。這些結(jié)果表明干旱脅迫同樣可以調(diào)控基因的表達。外，其他基因的表達量都表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。和

圖6 SaNAC基因在不同鹽濃度下的表達特征

A：不同濃度鹽脅迫下所有基因的表達熱圖。表達量的值經(jīng)過均一化后呈現(xiàn)在熱圖的右邊，紅色代表高表達，綠色代表低表達。B：12個鹽脅迫應答基因的RT-PCR驗證作為RT-PCR擴增均一化的內(nèi)參基因。

3 討論

互花米草作為高度耐鹽的鹽生植物，在沿海地帶具有良好的生長優(yōu)勢。NAC家族蛋白具有保守的結(jié)構(gòu)域和功能域，對植物的生長發(fā)育以及非生物脅迫應答具有重要的作用[16,18,20]。本研究從互花米草全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定出62個完整的NAC轉(zhuǎn)錄因子，明顯少于擬南芥和水稻基因組中的數(shù)目[5]。三代測序技術(shù)雖然可以得到較長的基因序列，但受到文庫構(gòu)建和機器讀取不確定性的影響，相比基因組測序存在基因測序不全的缺點，因此互花米草NAC家族成員的完整性還有待進一步確定和完善。

蛋白序列比對結(jié)果顯示SaNAC家族蛋白在N端含有基本的NAC結(jié)構(gòu)域，除了SaNAC2、SaNAC3和SaNAC13等一些蛋白缺少個別亞結(jié)構(gòu)域(A~E)外，絕大多數(shù)SaNAC蛋白都含有完整的NAC結(jié)構(gòu)。NAC蛋白結(jié)構(gòu)可以分為兩個部分：N端保守的DNA結(jié)合區(qū)域(BD)和C端變化的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域(TR)[5]，其中BD包含150~160個氨基酸殘基，主要被分為A~E五個亞結(jié)構(gòu)域，與DNA結(jié)合、同源或異源二聚體的形成以及核定位具有密切聯(lián)系。保守功能域預測結(jié)果顯示SaNAC蛋白均含有NAM功能域，NAM區(qū)域雖然只包含A~D共4個NAC亞結(jié)構(gòu)域，但結(jié)構(gòu)域E卻是AtNAM蛋白一個重要的DNA結(jié)合區(qū)域[31]，因此可以用NAM結(jié)構(gòu)域來替代分析NAC結(jié)構(gòu)域。同時，亞細胞定位實驗也證明SaNAC9和SaNAC49在細胞核里表達，這些分析結(jié)果共同表明SaNAC蛋白可能發(fā)揮植物NAC轉(zhuǎn)錄因子的功能。

圖7 ABA處理下12個SaNAC基因的表達特征

每個時間點的樣本取3個生物學重復，處理0 h的樣本表達量被均一化為1，星號代表ABA處理1 h、8 h或者24 h的樣本與0 h樣本之間具有差異。*表示<0.05，樣本之間具有統(tǒng)計學差異；**表示<0.01，樣本之間具有顯著性差異；***表示<0.001，****表示<0.0001，均代表樣本之間具有極顯著差異。

在進化分組上共同位于某一小組的蛋白一般具有相似程度較高的序列，因此可能發(fā)揮相似的蛋白功能。互花米草與水稻同為單子葉植物，在結(jié)構(gòu)上具有一定的相似之處，而且研究表明互花米草基因與水稻具有90%以上的相似度[32]，因此分析它們NAC家族蛋白之間的進化保守性(圖3)，有助于更好的研究互花米草NAC蛋白的功能。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果顯示互花米草與水稻NAC蛋白相似程度較高，因此可以通過分析水稻NAC蛋白來預測互花米草NAC同源蛋白的功能。水稻ONAC095 (Os06g51070)被證明參與干旱和冷脅迫的響應，在干旱和ABA處理下，基因表達量增加，通過顯性嵌合抑制因子抑制基因的表達后減少了水稻體內(nèi)水分的丟失并且增加了脯氨酸和可溶性糖的含量，同時使一些干旱相關基因的表達發(fā)生上調(diào)，從而促進水稻抗干旱脅迫[29]。互花米草SaNAC2、SaNAC18、SaNAC28、SaNAC31、SaNAC32、SaNAC34及SaNAC51與OsNAC095蛋白共同位于X小組，研究發(fā)現(xiàn)、和基因在干旱處理下的表達量同樣增加，因此猜測這些蛋白可能同樣參與互花米草對干旱脅迫的調(diào)控。

圖8 干旱處理下12個SaNAC基因的表達特征

每個時間點的樣本取3個生物學重復，處理0 h的樣本表達量被均一化為1，星號代表干旱處理1 h、8 h或者24 h的樣本與0 h樣本之間具有顯著性差異。*表示<0.05，樣本之間具有統(tǒng)計學差異；**表示<0.01，樣本之間具有顯著性差異；***表示<0.001，****表示<0.0001，均代表樣本之間具有極顯著差異。

組織表達差異是基因選擇性表達的結(jié)果，實驗結(jié)果表明基因在互花米草葉、莖、根以及地下莖中的表達具有明顯差異?；蛟跀M南芥里的同源基因編碼一種轉(zhuǎn)錄激活因子，在干旱誘導的葉片衰老過程中，通過與ROS生物合成酶基因的啟動子直接結(jié)合來促進ROS的產(chǎn)生[33]?；セ撞菽軌蛏L在潮水漲落頻繁的海岸帶，主要原因之一是具有發(fā)達的地下根莖系統(tǒng)，地下莖的橫向擴張也是互花米草繁殖的主要途徑之一。本研究結(jié)果顯示基因在互花米草地下莖中的表達量相對較高，同時在干旱處理下表達量也顯著上調(diào)，因此猜測基因參與的干旱應答過程可能在互花米草地下莖中進行。在擬南芥的同源基因，參與調(diào)控擬南芥韌皮部薄壁轉(zhuǎn)移細胞壁的生長[34]，的同源基因，也影響擬南芥纖維次生細胞壁發(fā)育以及增加纖維細胞面積相關基因的表達[35]，和基因在互花米草葉片中具有較高的表達，卻在莖稈部分表達量較低，表明它們很可能同樣參與調(diào)控互花米草器官的生長發(fā)育。另外，葉片中含有鹽腺是互花米草耐鹽的特點之一，根部吸收的鹽大多可以由鹽腺排出體外，因此葉片在互花米草的耐鹽過程中也極為重要[36]。在研究紅樹林的鹽腺時，發(fā)現(xiàn)相比葉肉組織，在富含鹽腺的組織中紅樹林基因具有更高的表達量[37]，說明NAC家族因子可能參與調(diào)控鹽腺器官的發(fā)育。因此，大量基因在互花米草葉片中的高度表達，可能與鹽腺的發(fā)育以及耐鹽的調(diào)控有關。

為了系統(tǒng)的研究非生物脅迫對基因表達的調(diào)控，本研究同時分析了鹽、ABA以及干旱脅迫對基因表達的影響。耐鹽是互花米草最顯著的特征，找出耐鹽相關基因?qū)ρ芯科錂C理具有重要意義。非生物脅迫的控制機制依賴于大量脅迫相關基因的激活和調(diào)控[38]，通過RNA-seq數(shù)據(jù)和qRT- PCR分析發(fā)現(xiàn)和基因同時受到高鹽、ABA和干旱脅迫的調(diào)控，基因的表達量在3種脅迫下均顯著增加，表明這些基因都是潛在的脅迫相關基因，在非生物脅迫的調(diào)控過程中可能扮演重要的角色。其中，的同源基因參與調(diào)控擬南芥對干旱脅迫的應答[33]，的同源基因調(diào)控擬南芥細胞的衰老[39]，而同源基因則可以負向調(diào)控ABA信號通路[40]，充分顯示基因在互花米草組織發(fā)育和對非生物脅迫應答方面的重要作用，同時也表明互花米草對非生物脅迫的應答是一個多基因復雜調(diào)控的過程。本研究豐富了互花米草NAC家族轉(zhuǎn)錄因子的信息，不僅為更好的研究互花米草生長發(fā)育和脅迫響應機制提供一定的參考，同時也為農(nóng)林作物耐鹽改良提供良好的基因資源。

附錄：

附圖1詳見文章電子版www.chinagene.cn。

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Identification and expression analyses of the NAC transcription factor family in

Taotao Wang1,2, Yong Yang1,2, Wei Wei2, Chentao Lin2, Liuyin Ma2

As a coastal halophytehas high salt tolerance. However, the mechanism at the molecular level has not been widely studied due to the absence of a reference genome. The proteins of NAC families are plant-specific transcription factors that regulate the growth, development and stress response in plants. To identify the NAC family and explore the relationship between NACproteins and the growth, development and stress response of, full-length transcriptome data ofby the third generation sequencing technology was used as reference sequences in this study to blast with the NAC protein sequences from,and. Finally, 62 SaNAC proteins were found inby deep analysis on conserved domains. Then we analyzed sequence alignment, evolution, motif prediction, homology comparison, subcellular localization, tissue and abiotic stress-induced gene differential expression profile on the NAC family members in. As a result, all SaNAC proteins were found containing a conserved NAM domain and having certain evolutionary similarity with rice; two family proteins, SaNAC9 and SaNAC49, were expressed in the nucleus; moreover,genes were identified to have distinct expressional profiles in different tissues and stress response ofThese results indicated the SaNAC transcription factor family not only had conserved functional domains but also played important role in the regulation of growth, development and abiotic stress response.

; NAC; transcription factor; gene family; gene expression

2019-08-27;

2019-12-26

福建農(nóng)林大學林學高峰學科建設項目(編號：71201800725，71201800773)和福建農(nóng)林大學優(yōu)秀博士學位論文基金項目(編號：324-1122yb043)資助[Supported by Peak Subject Construction Project of Fujian Agricultural and Forestry University (Nos. 71201800725, 71201800773) and Scientific Research Foundation of the Graduate School of Fujian Agriculture and Forestry University (No. 324-1122yb043)]

王濤濤，博士研究生，研究方向：林木遺傳學理論基礎。E-mail: fjnlwtt@163.com

馬留銀，博士，副教授，博士生導師，研究方向：植物轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。E-mail: lma223@163.com

10.16288/j.yczz.19-250

2020/2/21 11:21:17

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20200220.1501.001.html

(責任編委: 趙方慶)