辛 博，萬麗麗，王 婧，劉金變，霍 炎，郭 澄 （上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院：.藥劑科, .麻醉科，上海 200233）

順式阿曲庫銨（cisatracurium, CA）是一種新型中時效非去極化肌松藥，其結(jié)構(gòu)式如圖1，因其代謝方式（Hofmann elimination，霍夫曼降解）獨特，同時釋放較低水平的組胺，在臨床麻醉過程中被廣泛應(yīng)用。因與其他非去極化肌松藥一樣，存在術(shù)后肌松殘留作用[1]，且已成為麻醉后呼吸系統(tǒng)不良事件的主要原因。因此，為保證患者圍術(shù)期安全，對順式阿曲庫銨進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測十分必要。

CA 的穩(wěn)定性主要受溫度和pH 影響，溫度和pH 升高可加快其消除，因此離體后的生物樣本穩(wěn)定性是血藥濃度監(jiān)測方法建立的一個難點。國內(nèi)外文獻(xiàn)報道測定人血漿中CA 濃度的方法主要為高效液相色譜熒光檢測法（HPLC-FD）及高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS）[2-6]，但樣本前處理方法較為復(fù)雜。本研究在既往文獻(xiàn)報道的基礎(chǔ)上，建立了一種更加簡便、準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定的LC-MS 方法，適用于人血漿中CA 的血藥濃度測定。

1 儀器與試藥

圖 1 順式阿曲庫銨的結(jié)構(gòu)式

高效液相色譜儀（Agilent 6410，美國Agilent 公司）；Triple Quad 三重四極桿質(zhì)譜儀，配電噴霧（ESI）離子源（美國Agilent 公司）；純水機（Millipore）；分析天平（BP211D，德國Sartorius 公司）。對照品順式阿曲庫銨（cisatracurium，CA，批號：C496700，純 度 90%，Toronto Reasearch Chemicals Inc 公司）；對照品鹽酸普羅帕酮（propafenone hydrochloride，PPF，批 號：101190-201101，純度99.9%，中國藥品食品檢定研究院）；乙腈、甲酸均為質(zhì)譜純（美國TEDIA 公司）；水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件

Agilent SB-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm, 3 μm），柱溫35 ℃；流動相A 為0.1%甲酸水溶液，B 為0.1%甲酸乙腈溶液。線性梯度洗脫：0 ～1 min,20% B；1～3 min，50% B；3 ～5 min，20% B; 5 ～10 min，20% B。流速0.3 ml/min；進(jìn)樣量2 μl。

2.1.2 質(zhì)譜條件

采用正離子工作模式；離子源為ESI 源；多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring, MRM）。毛細(xì)管電壓4 000 V；干燥器溫度350 ℃；干燥氣流速12 L/min；霧化器壓力35 psi。MRM 監(jiān)測離子對，離子駐留時間、碰撞誘導(dǎo)解離電壓及碰撞能量等參數(shù)見表1。典型質(zhì)譜圖見圖2。

表 1 質(zhì)譜條件

圖 2 HPLC-MS 色譜圖

2.2 對照品及內(nèi)標(biāo)溶液配制

CA 標(biāo)準(zhǔn)儲備液：精密稱取CA 10 mg 置10 ml容量瓶，加入2%甲酸甲醇溶液至刻度，溶解混勻，配制成相當(dāng)于CA 質(zhì)量濃度為1 mg/ml 的儲備液，于冰箱（4 ℃）備用。

CA 標(biāo)準(zhǔn)工作液：精密吸取CA 儲備液適量，用50%甲醇水溶液配制成系列濃度的工作溶液，其中，CA 質(zhì)量濃度分別為5 000、2 500、1 000、500、250、100、20 ng/ml。

PPF 標(biāo)準(zhǔn)儲備液：精密稱取PPF 0.4 mg 置2 ml容量瓶，加甲醇至刻度，溶解混勻，配制成相當(dāng)于PPF質(zhì)量濃度為0.2 mg/ml 的儲備液，于冰箱（4 ℃）備用。

PPF 標(biāo)準(zhǔn)工作液：精密吸取PPF 儲備液適量，配制成200 ng/ml 的含內(nèi)標(biāo)乙腈溶液。

2.3 血漿樣品處理

精密吸取血漿30 μl，加入2%甲酸水溶液30 μl，振搖10 s，再加50 μl 含內(nèi)標(biāo)乙腈溶液后旋渦振蕩10 s，12 000 r/ min 離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液置進(jìn)樣瓶，進(jìn)樣。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低定量限

取空白人血漿，精密加入不同濃度的對照品溶液，配制成CA 濃度為500、250、100、50、25、10、2 ng/ml 的血漿標(biāo)準(zhǔn)品。以濃度為X 軸，樣品峰與內(nèi)標(biāo)峰的比值為Y 軸，進(jìn)行線性回歸，經(jīng)“1/X”權(quán)重得回歸方程分別為：Y = 7.43×10-3+ 1.99 × 10-2X(r = 0.996 5)。結(jié)果表明，CA 在2～500 ng/ml 內(nèi)，線性關(guān)系良好。本方法CA 的定量下限為2 ng/ml。

2.5 系統(tǒng)精密度與準(zhǔn)確度（回收率）

配制CA 濃度分別為8、80、400 ng/ml 的血漿樣品，日內(nèi)誤差以3 個濃度各5 個樣品的測定結(jié)果表示；日間誤差以3 個濃度樣品分別3 個批次結(jié)果表示。人空白血漿分別加入不同濃度CA 工作溶液，按照“2.3”項下方法提取后，相同色譜條件進(jìn)行濃度測定。同時測定用流動相稀釋為相應(yīng)濃度的無基質(zhì)溶液的峰面積，以計算絕對回收率。結(jié)果如表2 所示。

表 2 CA 人血漿樣品的系統(tǒng)精密度與準(zhǔn)確度（回收率）

2.6 穩(wěn)定性試驗

空白血漿分別配制成8、80、400 ng/ml 的樣品，每批次各3 個，分別考察其①室溫下放置4 h；②處理后室溫放置24 h；③-80 ℃放置14 d 的穩(wěn)定性。結(jié)果如表3 所示。

2.7 基質(zhì)效應(yīng)

取6 個不同來源的人空白血漿30 μl，除不加內(nèi)標(biāo)外，其余按“2.3”項下操作，取上清液，分別制備成CA 濃度為31.25 和1 000 ng/ml；PPF 濃度為200 ng/ml 的溶液，進(jìn)樣測定，記錄峰面積。另用流動相將CA 稀釋成31.25 和1 000 ng/ml；PPF 濃度為200 ng/ml 濃度的溶液，進(jìn)樣測定，記錄峰面積。

表 3 CA 人血漿樣品不同條件下的穩(wěn)定性

基質(zhì)效應(yīng)=（空白基質(zhì)中添加工作溶液峰面積/重組溶液中添加工作溶液峰面積）×100%

CA 的基質(zhì)效應(yīng)為52%（RSD 2.09%～15.33%）。PPF 的基質(zhì)效應(yīng)為96.71%（RSD4.6%）。

2.8 方法在治療藥物監(jiān)測中的應(yīng)用

采用肌松儀監(jiān)測患者注射苯磺順式阿曲庫銨后神經(jīng)肌肉阻滯程度。給予4 個成串刺激（train of four stimulation，TOF），給藥后，T4 最先發(fā)生衰減，T1 最后衰減。當(dāng)T1 消失即儀器顯示為0 時，肌肉阻滯程度最大，隨后逐漸恢復(fù)。分別在T0（T1 消失至0）、TOFr 50（恢復(fù)至50%）、TOFr 90（恢復(fù)至90%）時采集輸液對側(cè)動脈血3 ml，并及時保存于4 ℃冰箱中。采用建立的方法測定樣本血藥濃度，結(jié)果見表4。同時記錄T0（給藥結(jié)束到T1 消失至0）、TOFr50（給藥結(jié)束到恢復(fù)至50%）、TOFr90（給藥結(jié)束到恢復(fù)至90%）發(fā)生所需時間，結(jié)果見表5、表6。

表 4 6 例受試者血漿中CA 血藥濃度測定結(jié)果

表 5 6 例受試者臨床資料

表 6 6 例受試者達(dá)到各TOF 值的時間

3 討論

CA 的代謝途徑主要為Hoffman 消除[7]，Hoffman消除受溫度和pH 值的影響。有研究顯示[8]，將苯磺順阿曲庫銨注射液稀釋于20%的甲醇中，室溫下，10～15 min 即可檢測到大量降解產(chǎn)物N-甲基四氫罌粟堿和單季丙烯酸酯。血漿的pH 值在7.4 左右。我們發(fā)現(xiàn)，在CA 血漿樣本前處理過程中，如果不加入酸調(diào)節(jié)pH 值，即使在-80 ℃的儲存條件下，CA 仍然會很快降解（結(jié)果未在文中體現(xiàn)）。為此，我們考察了不同比例的甲酸，最終確定了在樣本前處理過程中加入2%的甲酸能夠保證血漿中CA 的穩(wěn)定性。在既往報道中，多是加入一定濃度的硫酸來調(diào)控pH 值[2-6]。硫酸為有機酸，對測定儀器尤其是質(zhì)譜儀的離子源損害很大。同時，加入硫酸并不能保證室溫條件下樣本的長時間穩(wěn)定（＜4 h）[9]。本研究結(jié)果顯示，加入2%的甲酸，室溫下樣本穩(wěn)定性可保持在24 h 以上。此外，我們的樣本前處理過程并不需要經(jīng)過離心-上清液真空濃縮或氮吹濃縮-復(fù)溶-離心取上清液等[2-6,9]復(fù)雜過程，更為省時、省力。經(jīng)驗證，本研究建立的方法測定CA 血漿樣本的精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性均符合方法學(xué)要求。該方法更加簡便、準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定，可應(yīng)用于臨床CA 治療藥物濃度的監(jiān)測。