宋衛(wèi)國(guó)，陸永輝，張中湖，張會(huì)敏 （.山東省中醫(yī)藥研究院，濟(jì)南 5004；.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，濟(jì)南500）

銀黃軟膠囊是一種清熱、解毒、消炎作用的中成藥。因中藥起效慢、副作用少，一些不良商家為了尋求暴利，在中成藥中添加西藥成分，短時(shí)間內(nèi)提高中成藥的療效，誤導(dǎo)消費(fèi)者以尋求高利潤(rùn)。因雙氯芬酸鈉有消炎鎮(zhèn)痛作用、芬布芬有抗炎作用、鹽酸羅通定有鎮(zhèn)痛作用，就成了不良商家非法添加的成分之列，據(jù)報(bào)道有30%的抗風(fēng)濕類(lèi)健康產(chǎn)品中非法添加了雙氯芬酸鈉[1]，多種抗風(fēng)濕鎮(zhèn)痛類(lèi)中藥制劑中非法添加雙氯芬酸鈉、芬布芬等此類(lèi)化學(xué)藥物[2]。因此，建立一種快速有效的檢測(cè)方法，對(duì)可能非法添加了西藥成分的中成藥進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)具有重要的意義。

近幾年，薄層色譜-表面增強(qiáng)拉曼光譜（TLCSERS）聯(lián)用技術(shù)廣泛地應(yīng)用于各種領(lǐng)域[3-4]，尤其是在藥物非法添加研究領(lǐng)域被逐漸認(rèn)可[5-8]。本研究應(yīng)用TLC-SERS 聯(lián)用技術(shù)，探索雙氯芬酸鈉、芬布芬、鹽酸羅通定在中成藥銀黃軟膠囊中非法添加的鑒別方法，以期為進(jìn)一步的中成藥快速檢驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

便攜式拉曼光譜儀（BWS415，B&W Tek Inc.,U.S.A），激光發(fā)射波長(zhǎng)785 nm，分辨率5 cm-1；WFH-203B型三用紫外分析儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；離心機(jī)（TG16-WS，上海盧湘儀離心機(jī)有限公司）；KQ-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；薄層板HSGF254（煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所）。

雙氯芬酸鈉（批號(hào)：100334-200302，供含量測(cè)定用）、芬布芬（批號(hào)：100415-201102，純度99.4%）、鹽酸羅通定（批號(hào)：100222-200702，供鑒別用）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。實(shí)驗(yàn)所用陰性樣品由山東省食品藥品檢驗(yàn)所提供，銀黃軟膠囊（批號(hào)：359161004，石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司）。乙酸乙酯（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150410）、石油醚（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：12589-2007）；硝酸銀（批號(hào)：20140320，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），檸檬酸鈉（分析純，批號(hào)：20120429，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的制備

對(duì)照品溶液：精密稱(chēng)取對(duì)照品雙氯芬酸鈉、芬布芬、鹽酸羅通定對(duì)照品2 mg，置EP 管中，加入甲醇2 ml 溶解，制成濃度為1 mg/ml 的溶液，作為對(duì)照品溶液，冷藏保存，備用。

模擬假陽(yáng)性樣品溶液：取中成藥銀黃軟膠囊（經(jīng)山東省食品藥品檢驗(yàn)院薄層色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)，不含以上3 種對(duì)照品，可作為陰性樣品）一次劑量，置EP 管中，并精密量取雙氯芬酸鈉、芬布芬、鹽酸羅通定對(duì)照品溶液加入EP 管中，與銀黃軟膠囊樣品溶液混勻，甲醇溶解，振蕩，超聲（40 kHz，250 W）30 min，10 000 r/min 離心10 min，收集上清液，微孔濾膜濾過(guò)，作為假陽(yáng)性樣品，冷藏保存，備用。

陰性樣品溶液：取中成藥銀黃軟膠囊一次劑量，置EP 管中，加入甲醇2 ml 溶解，振蕩，超聲（40 kHz，250 W）30 min，10 000 r/min 離心10 min，取上清液，微孔濾膜濾過(guò)，作為陰性樣品，冷藏保存，備用。

1.2.2 納米銀膠溶液的制備

精密稱(chēng)取45 mg 的硝酸銀，加入少量去離子水使其溶解。溶解后移至250 ml 的容量瓶中，用去離子水定容。用電磁攪拌加熱器不斷攪拌并將其加熱至微沸，逐滴加入5 ml 濃度為1 %檸檬酸鈉溶液并繼續(xù)加熱，保持微沸60 min，繼續(xù)攪拌至溶液冷卻，得灰綠色銀溶膠，避光保存[8]。

1.2.3 最佳光譜條件的優(yōu)選

分別取1 mg/ml 雙氯芬酸鈉、芬布芬、鹽酸羅通定對(duì)照品溶液，以點(diǎn)樣點(diǎn)膠比為變量，激光功率，積分時(shí)間為定值，檢測(cè)出峰效果，篩選3 種成分的最佳點(diǎn)樣點(diǎn)膠比；同理篩選3 種成分的最佳激光功率、積分時(shí)間。

1.2.4 檢測(cè)限的考察

以對(duì)照品溶液與陰性樣品溶液作為對(duì)照，將配制的添加不同濃度對(duì)照品的模擬陽(yáng)性樣品點(diǎn)在同一塊硅膠薄層板上，按優(yōu)選的最佳光譜條件設(shè)置點(diǎn)樣點(diǎn)膠比、激光功率、積分時(shí)間，根據(jù)信噪比（S/N=3）評(píng)價(jià)出峰效果，確定各個(gè)對(duì)照品的檢測(cè)限。

1.2.5 表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)

將配置好的各種樣品、對(duì)照品溶液置于薄曼聯(lián)用儀內(nèi)對(duì)應(yīng)位置，高效硅膠薄層板置于儀器平臺(tái)上，設(shè)置點(diǎn)樣量與點(diǎn)樣位置，由聯(lián)用儀完成點(diǎn)樣操作。取出點(diǎn)樣后的薄層板，以選定的石油醚-乙酸乙酯（3：5）展開(kāi)系統(tǒng)，室溫下展開(kāi)80 mm，取出晾干，放回聯(lián)用儀，于內(nèi)置254 nm 紫外燈下檢視定位以確定點(diǎn)膠位置，設(shè)置合適的點(diǎn)膠量、激光強(qiáng)度與積分時(shí)間，由聯(lián)用儀完成點(diǎn)膠操作后，隨即進(jìn)行拉曼檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 最佳出峰條件的篩選結(jié)果

對(duì)照品雙氯芬酸鈉、芬布芬、鹽酸羅通定最佳出峰條件分別是：雙氯芬酸鈉點(diǎn)樣點(diǎn)膠比2：3，激光功率30%，積分時(shí)間30 s；芬布芬點(diǎn)樣點(diǎn)膠比2：2，激光功率40%，積分時(shí)間30 s；鹽酸羅通定點(diǎn)樣點(diǎn)膠比1：2，激光功率50%，積分時(shí)間30 s。拉曼圖譜如圖1 所示。

2.2 檢測(cè)限的考察結(jié)果

從圖2、圖3、圖4 中可以看出，3 種對(duì)照品在薄層色譜中分離程度高，雙氯芬酸鈉的比移植（Rf）值為0.75，芬布芬Rf 值為0.54，鹽酸羅通定Rf 值為0.21。由“2.1”項(xiàng)可知，雙氯芬酸鈉、芬布芬、鹽酸羅通定最佳點(diǎn)樣點(diǎn)膠比分別為2：3、2：2、1：2（即點(diǎn)樣量分別為2 μl、2 μl、1 μl，故銀黃軟膠囊中添加的雙氯芬酸鈉、芬布芬、鹽酸羅通定最低檢測(cè)限對(duì)應(yīng)的點(diǎn)樣沉積量分別為0.2 μg、0.2 μg、0.1 μg。

2.3 模擬的假陽(yáng)性樣品考察結(jié)果

圖1 3 種成分最佳出峰條件下的SERS 圖譜

圖2 雙氯芬酸鈉薄層及各斑點(diǎn)拉曼光譜

圖3 芬布芬薄層及各斑點(diǎn)拉曼光譜

從圖5 薄層板中可以看出，同時(shí)添加了3 種對(duì)照品的銀黃軟膠囊模擬的假陽(yáng)性樣品溶液4、5、6、7 號(hào)中出現(xiàn)了與雙氯芬酸鈉、芬布芬、鹽酸羅通定相同Rf 值的斑點(diǎn)，可初步確定4、5、6、7 中添加了雙氯芬酸鈉、芬布芬、鹽酸羅通定。為進(jìn)一步確證，對(duì)各斑點(diǎn)進(jìn)行SERS 檢測(cè)，在拉曼儀數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中與相應(yīng)對(duì)照品色譜斑點(diǎn)的SERS 光譜進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明4、5、6、7 號(hào)中對(duì)應(yīng)斑點(diǎn)的SERS圖譜與雙氯芬酸鈉、芬布芬、鹽酸羅通定對(duì)照品的SERS 圖譜相同，見(jiàn)圖5 中SERS 圖譜。

圖4 鹽酸羅通定薄層及各斑點(diǎn)拉曼光譜

2.4 3 種成分的拉曼光譜分析

由圖6 可知，雙氯芬酸鈉、芬布芬、鹽酸羅通定3 種成分的分子結(jié)構(gòu)中均含有苯環(huán)、C—C、C=O 基團(tuán)，故3 種成分的拉曼光譜特征峰有9 個(gè)共有峰，在576、712、1 004、1 130、1 240、1 316、1 394、1 454、1 564 cm-1左右，同一共有峰的強(qiáng)度有所不同，取代基不同拉曼位移略有變化（見(jiàn)表1）。此外，由于3 種成分的分子結(jié)構(gòu)含有不同的基團(tuán)，也有相應(yīng)的差異峰，如740 cm-1為鹽酸羅通定特有峰。共有峰、差異峰以及峰強(qiáng)度共同組成了區(qū)別于其他成分的特征峰群，這為T(mén)LC-SERS 專(zhuān)屬性鑒別提供了依據(jù)。

圖5 模擬假陽(yáng)性樣品薄層及拉曼光譜

圖6 3 種成分的分子結(jié)構(gòu)

表1 3 種成分的拉曼光譜特征峰(cm-1)

3 討論

本研究通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，確定了TLC 展開(kāi)劑為石油醚-乙酸乙酯（3：5），得到了較好的展開(kāi)效果。在展開(kāi)的TLC 薄層板上，3 種對(duì)照品對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)處，模擬假陽(yáng)性樣品與3 種對(duì)照品有相同斑點(diǎn)；經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的SERS 檢測(cè)，模擬假陽(yáng)性樣品的斑點(diǎn)拉曼光譜特征峰與對(duì)照品斑點(diǎn)拉曼光譜特征峰一致，且重復(fù)性良好，說(shuō)明TLC-SERS 聯(lián)用技術(shù)簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠，可同時(shí)檢測(cè)銀黃軟膠囊中非法添加的雙氯芬酸鈉、芬布芬、鹽酸羅通定3 種成分。

本研究采用TLC-SERS 聯(lián)用技術(shù)所建立的檢測(cè)方法，對(duì)中成藥銀黃軟膠囊中非法添加西藥雙氯芬酸鈉、芬布芬、鹽酸羅通定3 種成分的，能滿(mǎn)足同時(shí)、快速檢測(cè)的要求。該方法實(shí)用性強(qiáng)，對(duì)人員技術(shù)要求低，尤其適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。