陳春亮，匡長(zhǎng)春，陳志龍，符旭東，劉輝 ，謝向陽(yáng)

(1.中央警衛(wèi)局保健處，北京 100017；2.中國(guó)人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科，武漢 430070)

作為RNA藥物中主要的一類(lèi)藥物，小干擾RNA (small interfering RNA， siRNA)憑借其獨(dú)特的作用機(jī)制和確切的治療效果，得到廣泛的關(guān)注。目前美國(guó)食品藥品管理局(FDA)已批準(zhǔn)超過(guò)20個(gè)品種的siRNA藥物進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段[1]。但siRNA在體內(nèi)環(huán)境下不穩(wěn)定，其相對(duì)分子質(zhì)量較大，難以穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入靶細(xì)胞發(fā)揮治療作用需借助適當(dāng)載體才能實(shí)現(xiàn)。NGR(CYGGRGNG)作為一個(gè)主動(dòng)靶向的配體，可以與CD13受體高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞(如HT-1080細(xì)胞)特異性結(jié)合[2]。因此，可將NGR肽連接到siRNA載體的外表，利用NGR肽的主動(dòng)尋靶特性，從而提高siRNA載體在腫瘤部位的濃度。本研究團(tuán)隊(duì)在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上[3]，制備N(xiāo)GR修飾的聲敏脂質(zhì)體，然后對(duì)其進(jìn)行理化評(píng)價(jià)，為RNA類(lèi)藥物的靶向遞送提供參考。

1 儀器與材料

1.1儀器 Optima超速低溫離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮有限公司)；JY92-IID型細(xì)胞超聲破碎儀(寧波新芝生物科技有限公司)；高壓均質(zhì)-擠出器(加拿大Avestin公司)；7500型透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)；Malvern納米粒徑儀(美國(guó)Malvern公司)； RF-5301型熒光分光光度計(jì)(日本島津公司)；NanoWizarc原子力顯微鏡(德國(guó)JPK公司)； Autoflex III基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)(美國(guó)Bruker Daltonics公司)。

1.2藥品與試劑 NGR肽(上海如吉生物科技有限公司，批號(hào)：20171108)；siRNA和FAM (6-fluorescein amidite)-siRNA(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，批號(hào)：20160613)； DSPE-PEG2000-Mal [1，2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethy-lene glycol)-2000] (ammonium salt)]、DSPE-PEG2000 [1，2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethano-lamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000](美國(guó)Avanti公司，批號(hào)：203214，102261)；蛋黃卵磷脂(上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：B02315)；膽固醇(上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：501711)；焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate， DEPC)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150813)；二氫卟吩e6(上海Sigma試劑公司，批號(hào)：C2061007)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，批號(hào)：20170118)。

2 方法與結(jié)果

2.1功能材料的制備 取NGR肽和DSPE-PEG2000-Mal(1：1，mol：mol)適量，置于含有三乙胺(5 eq)的二甲基甲酰胺溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢?8 h，加入L-半胱氨酸(10 eq)反應(yīng)4 h，封閉未反應(yīng)的馬來(lái)酰亞胺殘基。對(duì)該反應(yīng)液以雙蒸水避光透析(截留分子量：35000)48 h，后經(jīng)冷凍干燥處理，得到白色膨松物，密封存放于-20 ℃冰箱[4]。終產(chǎn)物采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization mass， MALDI-TOF MS)進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定。脂材DSPE-PEG2000-MAL的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)(-MAL)與帶有巰基(-SH)的半胱氨酸NGR多肽，可通過(guò)反應(yīng)生成DSPE-PEG2000-NGR。合成的DSPE-PEG2000-NGR偶聯(lián)物在MALDI-TOF MS的圖譜，峰呈鐘形分布，各細(xì)峰間相對(duì)分子質(zhì)量相差44，推測(cè)為聚乙二醇(PEG)結(jié)構(gòu)中重復(fù)單元結(jié)構(gòu)[5]。由NGR(相對(duì)分子質(zhì)量738)、DSPE-PEG2000-Mal(相對(duì)分子質(zhì)量2941.6)計(jì)算可得DSPE-PEG2000-NGR相對(duì)分子質(zhì)量為3678，這與終產(chǎn)物的MALDI-TOF MS(相對(duì)分子質(zhì)量3 679.6)結(jié)果一致，由此表明功能材料合成成功。

2.2聲敏脂質(zhì)體的制備 參照文獻(xiàn)[3]。采用薄膜分散-擠出法制備，在容量為300 mL燒瓶中，分別加入處方量的蛋黃卵磷脂、DSPE-PEG2000、膽固醇、DSPE-PEG2000-NGR、二氫卟吩e6(依次為：45，8，2，2，1 mg)，然后加入三氯甲烷-甲醇(2：1)(4 mL)溶解，45 ℃減壓旋蒸40 min，揮去有機(jī)溶劑，待瓶壁上有透明薄膜形成后，加入2 μmol·mL-1的siRNA溶液8 mL(DEPC預(yù)處理5%葡萄糖水溶液)，繼續(xù)旋蒸1.5 h(正常大氣壓)，水化液經(jīng)高壓均質(zhì)擠出(孔徑100 nm)10個(gè)循環(huán)后，得到半透明有藍(lán)色乳光的siRNA/NGR-LP懸液。

2.3理化性質(zhì)考察

2.3.1形態(tài) 采用透射電鏡(transmission electron microscopy， TEM)和原子力顯微鏡(atomic force microscopy， AFM)觀察siRNA/NGR-LP的外觀形態(tài)，TEM方法：待測(cè)樣品經(jīng)5%葡萄糖水溶液適當(dāng)稀釋后，小心滴加在TEM專(zhuān)用的銅篩網(wǎng)上，滴加2%磷鎢酸染色，吸水紙吸去多余液體，自然干燥后制成待測(cè)品。AFM方法：待測(cè)樣品經(jīng)去離子水適當(dāng)稀釋后，輕輕滴加在新去除表層的云母片上，室溫干燥待測(cè)。結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，制備的siRNA/NGR-LP多數(shù)粒子形態(tài)圓整，為球形或近球形。

圖1 透射電鏡(A)與原子力顯微鏡(B)觀察siRNA/NGR-LP照片

Fig.1 Transmission election microscopy (A) and atomic force microscopy (B) photographs of siRNA/NGR-LP

2.3.2粒度分布和Zeta電位 采用激光粒度儀測(cè)定制備的siRNA/NGR-LP樣品粒徑和Zeta電位。激光粒度儀的設(shè)置為：發(fā)射波長(zhǎng)633 nm，入射光與散射光間夾角90°，溫度25 ℃ 。同時(shí)測(cè)定Zeta電位。結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖可知，siRNA/NGR-LP的平均粒徑為(101.56±9.82)nm。樣品的多分散系數(shù)(PDI)為(0.101±0.007)，Zeta電位為(3.68±1.08)mV。

圖2 siRNA/NGR-LP的粒徑分布圖

Fig.2 Particle size distribution of siRNA/NGR-LP

2.3.3包封率 先用pH值 8.0的TE緩沖液(由10 mmol·L-1Tris-HCl與1 mmol·L-1乙二胺四乙酸組成)配制成2～20 nmol·L-1的系列FAM-siRNA標(biāo)準(zhǔn)溶液，放入熒光分光光度儀(λex=490 nm、λem=515 nm)測(cè)定，以熒光強(qiáng)度(E)對(duì)濃度(C)進(jìn)行線性擬合，得擬合方程為E= 29.113C+ 40.738，相關(guān)系數(shù)(R2)=0.999 7，表明在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)擬合方程的線性關(guān)系良好。

脂質(zhì)體的包封率測(cè)定采用超速離心管法。將FAM-siRNA/NGR-LP樣品液加到超濾離心管(截留分子量50 000)上層小室后，4 ℃ 、3000×g的條件下離心45 min，以離心管下層液體(未包封的FAM-siRNA)作為樣品液，采用熒光分光光度法檢測(cè)超濾離心樣品液的熒光強(qiáng)度。將測(cè)定值代入上述擬合方程后，計(jì)算游離的FAM-siRNA濃度(C游)。

根據(jù)下式計(jì)算聲敏脂質(zhì)的FAM-siRNA包封率，包封率(%)= (C總-C游)/C總×100% ，C總為制備投料量。測(cè)得FAM-siRNA/NGR-LP的包封率為(74.52±2.49)%。

2.4穩(wěn)定性考察 取制備的siRNA/NGR-LP樣品50 μL，加入到磷酸鹽緩沖液(pH值7.4)1 mL中，平行配制6份，混勻、密封、置于4 ℃冰箱中保存，于放置的當(dāng)天(第1天)和第31天測(cè)定樣品液的粒徑和Zeta電位，考察樣品在4 ℃條件下的穩(wěn)定性。另以磷酸鹽緩沖液(pH值7.4)和胎牛血清按1：9比例制成稀釋液，將適量siRNA/NGR-LP樣品稀釋成樣品液3 mL，置于Turbiscan Lab?Expert穩(wěn)定性分析儀(37 ℃)中測(cè)定。

樣品液放置第31天(4 ℃)，測(cè)定siRNA/NGR-LP的粒徑為(108.04±3.14)nm，PDI為(0.102±0.072)，Zeta電位為(3.34±1.14) mV，各項(xiàng)指標(biāo)與放置前相近，表明siRNA/NGR-LP在4 ℃ 的PBS(pH值7.4)中穩(wěn)定性良好。穩(wěn)定性分析儀的結(jié)果(圖3)顯示，48 h內(nèi)樣品的透射光和散射光波動(dòng)均小于5%[6]，表明siRNA/NGR-LP在模擬血漿中未發(fā)生聚集或沉淀，所制備的聲敏脂質(zhì)體在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5體外釋藥行為考察 在透析袋中進(jìn)行制備樣品的聲敏釋藥特性確證。量取FAM-siRNA/NGR-LP樣品液2.0 mL至截留分子量為8 000的透析袋中(6份分成2組)，夾緊，置于釋放介質(zhì)(pH值7.4的磷酸鹽緩沖液)100 mL中，然后置于37 ℃恒溫水浴中振蕩(75 r·min-1)，在0，1，2，4，6，8，12，24 h取樣(其中一組在1 h時(shí)采用超聲治療儀(Intelect?2776， Chattanooge， USA)超聲2 min(1 MHz、1 W/cm2)[5]，補(bǔ)加同體積的空白釋放介質(zhì)(37 ℃)，參照“2.3.3”項(xiàng)下測(cè)定FAM-siRNA濃度，計(jì)算累積FAM-siRNA釋放率，繪制累積FAM-siRNA釋放曲線。結(jié)果見(jiàn)圖4。未經(jīng)超聲處理的FAM-siRNA/NGR-LP釋藥曲線呈突釋和緩釋兩相：前4 h可認(rèn)為處于突釋階段，在此段時(shí)間內(nèi)FAM-siRNA釋放近6%；此后藥物釋放減慢，24 h時(shí)累積釋藥不到10%。另一組FAM-siRNA/NGR-LP經(jīng)超聲波處理后，1 h內(nèi)的FAM-siRNA累積釋放量達(dá)86%。上述結(jié)果表明FAM-siRNA/NGR-LP的釋藥行為具有聲敏的特點(diǎn)，在一定的超聲條件下可迅速釋放包載的大部分藥物。

3 討論

體外超聲激發(fā)脂質(zhì)體釋放藥物是將來(lái)脂質(zhì)體在靶組織內(nèi)釋藥的關(guān)鍵。本文采取的超聲條件(頻率、功率)沿用前期實(shí)驗(yàn)的結(jié)果[5]。選擇的依據(jù)是在人體使用安全的超聲條件下篩選激發(fā)條件。本研究的聲敏脂質(zhì)體激發(fā)原理主要是依靠超聲激發(fā)聲敏劑來(lái)實(shí)現(xiàn)，不同于常見(jiàn)的聲敏微泡，其主要是依靠共振破膜釋藥。

在穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，主要考察載體的低溫下穩(wěn)定性，只能為載體的實(shí)驗(yàn)室保存使用提供一定的參考依據(jù)。本文所制備的聲敏脂質(zhì)體在室溫條件下大約可穩(wěn)定8 d，其處方工藝有待進(jìn)一步調(diào)整、優(yōu)化，將其制成注射用凍干粉針可能較大幅幅度提高其穩(wěn)定性。由于模擬血清成分的干擾較為嚴(yán)重，直接對(duì)siRNA/NGR-LP進(jìn)行含量測(cè)定有一定困難，所以只采用穩(wěn)定性分析儀對(duì)siRNA/NGR-LP的物理穩(wěn)定性(膠體的光學(xué)性質(zhì))進(jìn)行考察。

圖3 穩(wěn)定性分析儀的透射光和散射光圖譜

圖4 FAM-siRNA/NGR-LP的體外釋藥曲線

Fig.4Invitrorelease profiles of FAM-siRNA/NGR-LP

體外釋放實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，超聲探頭與透析袋貼合度的好壞，對(duì)藥物的釋放影響非常大，將來(lái)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)需要仔細(xì)檢查偶合劑在探頭與皮膚間的填充情況。另外，超聲波的頻率、功率和刺激時(shí)間對(duì)聲敏脂質(zhì)體的釋藥行為都有一定的影響，其相互作用機(jī)理需要深入的研究。

從筆者前期有關(guān)NGR修飾脂質(zhì)體的研究結(jié)果來(lái)看[2-3，5]，本研究制得的脂質(zhì)體應(yīng)當(dāng)具有一定的腫瘤靶向性，具體需要后期活體成像實(shí)驗(yàn)或藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確證。本文制備的siRNA/NGR-LP能否最終進(jìn)入體內(nèi)靶向部位發(fā)揮藥效，需后繼的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)才能確證。此外，載體應(yīng)用的安全性方面問(wèn)題亦待后繼深入考察才能了解。總之，本文制備的NGR肽修飾的聲敏脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)對(duì)抗腫瘤藥物靶向遞送的研究具有一定的參考意義。