龔夏實(shí)，毛閃閃，龐聰，周文，李繼洪

(1.武漢大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430079； 2.湖北天勤生物科技有限公司武漢分公司， 武漢 430071)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種全身性自身免疫性疾病，臨床上以對稱性、破壞性的關(guān)節(jié)病變?yōu)橹?，患者可表現(xiàn)為晨僵、關(guān)節(jié)腫脹及功能下降[1]，嚴(yán)重影響人們的健康生活。風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎累及人群較廣，患有風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等免疫性疾病的孕婦，需用藥物緩解疼痛和其他炎癥并發(fā)癥，而具有選擇性的環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)抑制劑在孕期中應(yīng)用普遍[2]，妊娠期用藥需謹(jǐn)慎，從而避免藥物對胎兒的不良影響[3]。研究表明：治療RA的代表藥物塞來昔布可引起非洲爪蟾蜍COX-2基因表達(dá)增加[4]，因此在孕期使用非甾體抗炎藥時，需對此類藥物進(jìn)行孕期風(fēng)險評估。TQ17是一種新型的非甾體類抗炎藥，作用機(jī)制是選擇性抑制COX-2，從而抑制花生四烯酸，最終生成前列腺素(prostaglandin，PG)，即減少前列腺素。筆者對TQ17的胚胎-胎仔發(fā)育毒性進(jìn)行研究，為臨床安全用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 10～11周齡無特定病原體(SPF)級SD大鼠，雌鼠120只，雄鼠90只。動物體質(zhì)量，雌性215.40～273.49 g，雄性341.86～437.34 g。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0011 ，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK(鄂)2016-0090。飼料為北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供的專用鼠顆粒飼料，飲水為高壓滅菌水。室溫20～26 ℃，相對濕度40%～70%，光照為明12 h，暗12 h。

1.2藥品與試劑 TQ17(湖北天勤生物科技有限公司武漢分公司，批號：170307)；環(huán)磷酰胺(山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司，批號：K94718，含量：97%，實(shí)驗(yàn)時用0.9%氯化鈉注射液稀釋配成所需的受試濃度)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，湖州展望藥業(yè)有限公司，批號：20160301)；0.9%氯化鈉注射液(武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：1604250711)；苦味酸(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號：20170123)；甲醛(批號：20161011)、冰醋酸(批號：20160728)、氫氧化鉀(批號：20150527)、甘油(批號：20161205)、茜素紅(批號：20151204)均由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.3儀器 電子天平(美國Ohous公司)； LS220A電子天平(普利賽斯公司，感量：0.1 mg)；E200MV生物顯微鏡(日本NIKON公司)；DQ-8UV超純水機(jī)(Millipore)；數(shù)顯游標(biāo)卡尺。

1.4給藥劑量設(shè)計(jì) 參照文獻(xiàn)[5-7]，TQ17大鼠藥效學(xué)有效劑量為6 mg·kg-1·d-1。小劑量組：30 mg·kg-1·d-1，為大鼠藥效學(xué)有效劑量的5倍；大劑量組：350 mg·kg-1·d-1，約為大鼠藥效學(xué)有效劑量的58倍。模型對照組：給予同體積0.5%CMC-Na溶液(溶媒)1 mL·(100 g)-1。環(huán)磷酰胺組：環(huán)磷酰胺15 mg·kg-1·d-1。

1.5實(shí)驗(yàn)方法 參照文獻(xiàn)[5-8]，SPF級SD大鼠按雌雄1：1和2：1比例合籠，合籠時間為5 d，每日對雌鼠進(jìn)行陰栓或陰道涂片檢查，以查到陰栓或精子日定為妊娠第0天，交配期間每日記錄交配情況。90只交配成功的雌鼠按隨機(jī)分到TQ17大、小劑量組，環(huán)磷酰胺組，模型對照組；TQ17大、小劑量組23只，環(huán)磷酰胺組、模型對照組各22只。模型對照組和TQ17 小、大劑量組于妊娠第6天至第15天灌胃給藥，每日1次；環(huán)磷酰胺組于妊娠第12天頸背部皮下注射給藥。孕鼠于妊娠第20天解剖。

1.6觀察指標(biāo) 記錄黃體數(shù)、著床數(shù)、吸收胎數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)和連胎子宮質(zhì)量?；钐プ兄鹨粰z查外觀、性別，稱定體質(zhì)量，并測量頂臀長和尾長。每窩取1/2胎仔放入Bouin氏液固定，作內(nèi)臟檢查，另1/2胎仔固定于體積分?jǐn)?shù)75%乙醇做骨骼畸形檢查。

2 結(jié)果

2.1TQ17對孕鼠體質(zhì)量的影響 與模型對照組比較，TQ17大劑量組孕鼠體質(zhì)量增長顯著減慢，妊娠第7天至第15天、第20天顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；環(huán)磷酰胺組在大鼠妊娠第13天和第20天顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。

2.2TQ17對孕鼠攝食量的影響 與模型對照組比較，TQ大劑量組在妊娠第7天、第14天攝食量極顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

2.3TQ17對孕鼠生殖能力的影響 與模型對照組比較，TQ17大，小劑量組著床數(shù)、活胎和死胎差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

2.4TQ17對胚胎形成及外觀的影響 與模型對照組比較，TQ17各組對胚胎形成及外觀差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；環(huán)磷酰胺組胎鼠平均體質(zhì)量、身長、尾長和連胎子宮重極顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，胎鼠露腦、肢畸型、趾畸型極顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01 或P<0.05)，見表4，5。

2.5TQ17對胎鼠內(nèi)臟的影響 與模型對照組比較，TQ17小、大劑量組胎鼠內(nèi)臟無顯著性影響，環(huán)磷酰胺組胎鼠內(nèi)臟畸形率極顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表6。

2.6TQ17對胎鼠骨骼的影響 與模型對照組比較，環(huán)磷酰胺組胎鼠骨骼的畸形或變異顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)；TQ17大劑量致胎鼠胸骨的畸形或變異顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表7[7]。

3 討論

COX是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的限速酶，有COX-1、COX-2和COX-3三種表現(xiàn)形式，其中COX-2是體內(nèi)多種細(xì)胞響應(yīng)創(chuàng)傷和炎癥而產(chǎn)生的[9-10]。研究表明，在小鼠胃黏膜急性損傷期，COX-2 mRNA及蛋白質(zhì)水平升高，COX-2 mRNA及蛋白質(zhì)可修復(fù)胃黏膜損傷[11]，COX-2選擇性抑制劑對胃腸道可能有一定毒副作用。前列腺素不僅為疼痛遞質(zhì)，還可調(diào)節(jié)骨細(xì)胞功能[10]，即前列腺素E2(prostaglandin E2， PGE2)可以刺激成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化[12]，而COX-2作為PGE2合成的限速酶，通過調(diào)節(jié)PGE2影響骨生成。COX-2抑制劑亦可引起胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩，影響骨骼發(fā)育[13]。

表1 4組孕鼠不同時間體質(zhì)量比較

組別大鼠/只第0天第3天第7天第8天第9天第10天模型對照組22247.84±12.82272.85±13.04302.57±14.40308.71±15.33314.88±16.62320.93±15.82環(huán)磷酰胺組22248.37±13.32273.16±13.41302.16±15.44306.83±14.31314.40±14.95320.66±14.64TQ17 小劑量組23249.67±17.82274.74±18.08297.43±21.95306.02±19.54310.47±22.22318.84±20.17 大劑量組23249.62±14.75273.66±13.85286.13±13.31①285.36±12.61①287.35±11.48①294.12±12.66①組別第11天第12天第13天第14天第15天第20天模型對照組329.32±16.39335.73±16.71341.65±16.65349.28±15.69357.90±16.00434.38±21.01環(huán)磷酰胺組326.57±15.72334.26±14.27328.22±15.41②341.14±13.62348.21±13.52399.16±21.05①TQ17 小劑量組323.71±23.44331.68±20.34335.88±23.76344.40±21.74355.05±23.15437.04±30.94 大劑量組295.63±13.30①297.96±15.07①305.01±16.49①307.94±18.42①312.96±21.42①406.71±24.51①

①與模型對照組比較，P<0.01，②與模型對照組比較，P<0.05。

①Compared with model control group，P<0.01，②compared with model control group，P<0.01.

表2 4組孕鼠不同時間攝食量的比較

組別大鼠/只劑量/(mg ·kg-1)妊娠第0天妊娠第7天妊娠第14天妊娠第20天模型對照組22-8.13±0.669.30±2.787.71±0.576.89±0.86環(huán)磷酰胺組22157.70±0.549.60±1.357.90±0.916.82±0.66TQ17 小劑量組23308.23±0.528.09±1.227.88±0.756.37±0.99 大劑量組233508.17±0.61 5.91±2.69① 5.98±1.92①7.91±1.27

①與模型對照組比較，P<0.01。

①Compared with model control group，P<0.01.

表3 TQ17 對致畸敏感期孕鼠的影響

組別大鼠/只劑量/(mg ·kg-1)著床數(shù)活胎數(shù)死胎數(shù)模型對照組22-15.32±2.0114.95±2.170.05±0.21環(huán)磷酰胺組221516.50±1.7115.55±2.320.32±0.65TQ17 小劑量組233015.48±3.2515.13±3.510.00±0.00 大劑量組2335015.39±2.0214.83±2.610.00±0.00

表4 TQ17對胚胎形成的影響

組別孕鼠/只劑量/(mg ·kg-1)子宮連胎質(zhì)量/g吸收胎數(shù) 黃體數(shù)個模型對照組22-85.72±11.640.32±0.5720.41±2.61環(huán)磷酰胺組221557.59±12.89①0.64±1.2619.45±2.39TQ17 小劑量組233088.89±20.640.35±0.7119.91±3.74 大劑量組2335087.11±14.160.57±1.3121.09±3.63

①與模型對照組比較，P<0.01。

①Compared with model control group，P<0.01.

表5 TQ17對致畸敏感期胎仔生長發(fā)育及外觀影響

組別劑量/(mg ·kg-1)大鼠/只性別比(雄/雌)胎鼠身長胎鼠尾長cm胎鼠體質(zhì)量/g模型對照組-220.93±0.513.81±0.191.37±0.103.84±0.36環(huán)磷酰胺組15221.21±0.692.85±0.40①1.17±0.17①2.29±0.51①TQ17 小劑量組30230.78±0.433.79±0.221.37±0.173.89±0.32 大劑量組350230.90±0.553.83±0.181.38±0.093.87±0.37組別皮下出血露腦肢畸型趾畸型只模型對照組2.23±3.150.00±0.000.00±0.000.00±0.00環(huán)磷酰胺組2.09±3.662.59±4.94①4.23±5.82②7.32±6.03②TQ17 小劑量組1.57±1.670.00±0.000.00±0.000.00±0.00 大劑量組1.83±1.800.00±0.000.00±0.000.00±0.00

①與模型對照組比較，P<0.01；②與模型對照組比較，P<0.05。

①Compared with model control group，P<0.01；②Compared with model control group，P<0.05.

表6 TQ17對胎鼠內(nèi)臟的影響

①當(dāng)1只胎仔出現(xiàn)兩種畸形時畸形數(shù)僅計(jì)算1次；②與模型對照組比較，P<0.01。

①the deformity is counted as one when two deformities exist in a foetus；②Compared with model control group，P<0.01.

表7 TQ17對胎鼠骨骼發(fā)育的影響

①與模型對照組比較，P<0.01；②當(dāng)1只胎仔出現(xiàn)兩種畸形時畸形數(shù)僅計(jì)算1次。

①Compared with model control group，P<0.01；②the deformity is counted as one when two deformities exist in a foetus.

TQ17為治療RA的非甾體抗炎藥，選擇性抑制COX-2，可能對胃腸道產(chǎn)生影響，致使大劑量組孕鼠體質(zhì)量增長緩慢。本實(shí)驗(yàn)特設(shè)環(huán)磷酰胺為環(huán)磷酰胺組，環(huán)磷酰胺組對胎兒宮內(nèi)骨骼發(fā)育產(chǎn)生明顯毒性反應(yīng)[14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，環(huán)磷酰胺對胚胎形成有極顯著阻礙作用，胎鼠外觀畸形極顯著增加，胎鼠內(nèi)臟和骨骼的畸形或變異顯著增加；TQ17小劑量對胚胎形成、胎鼠外觀形態(tài)、內(nèi)臟發(fā)育和骨骼發(fā)育均無明顯影響；大劑量對胎鼠胸骨的畸形或變異較模型對照組相比有顯著性升高，但對胚胎形成、胎鼠外觀形態(tài)、內(nèi)臟發(fā)育均無明顯影響，可能對胸骨發(fā)育有影響。在實(shí)試驗(yàn)條件下，TQ17 30 mg· kg-1·d-1對母體一般狀況和子代發(fā)育沒有影響，350 mg· kg-1·d-1對胎鼠胸骨發(fā)育有毒性作用，TQ17有致畸風(fēng)險。