張秀梅 趙俊軍

摘要：目的 ?探討TRIM32過表達對MCF-7乳腺癌細胞增殖、浸潤和侵襲的影響。方法 ?應用Western blot、CCK-8、Transwell和wound healing實驗分析TRIM32過表達對MCF-7細胞增殖、浸潤和侵襲影響。結果 ?Western blot實驗顯示，TRIM32在MCF-10A正常乳腺上皮細胞中低表達，而在MCF-7乳腺癌細胞中高表達（P<0.05）;與空白對照組比較，MCF-7細胞中轉(zhuǎn)染TRIM32質(zhì)粒后TRIM32呈過表達（P<0.05）;CCK-8實驗顯示，與空白對照組比較，TRIM32過表達后MCF-7細胞增殖率提高（P<0.05）。Transwell實驗顯示，與空白對照組比較，過表達TRIM32后MCF-7乳腺癌細胞穿孔數(shù)目增加（P<0.05）;Wound healing實驗顯示，與空白對照組比較，過表達TRIM32后MCF-7乳腺癌細胞12、24 h的遷移距離增加（P<0.05）。結論 ?TRIM32在乳腺癌細胞中高表達，過表達TRIM32促進乳腺癌細胞增殖、浸潤和侵襲能力，其可能成為乳腺癌治療的新靶點。

關鍵詞：TRIM32;過表達;乳腺癌

中圖分類號：R737.9 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.04.026

文章編號：1006-1959（2020）04-0087-03

Abstract：Objective ?To investigate the effect of TRIM32 overexpression on the proliferation， infiltration and invasion of MCF-7 breast cancer cells. Methods ?Western blot， CCK-8， Transwell and wound healing experiments were used to analyze the effects of TRIM32 overexpression on MCF-7 cell proliferation， infiltration and invasion.Results ?Western blot experiments showed that TRIM32 was low-expressed in MCF-10A normal breast epithelial cells and high-expressed in MCF-7 breast cancer cells（P<0.05）. Compared with the blank control group， MCF-7 cells were transfected with TRIM32 plasmid TRIM32 was over-expressed （P<0.05）; CCK-8 experiments showed that compared with the blank control group， the proliferation rate of MCF-7 cells increased after TRIM32 over-expression （P<0.05）. Transwell experiments showed that MCF-7 breast cancer cell perforations increased after overexpression of TRIM32 compared with the blank control group（P<0.05）; Wound healing experiments showed that compared with the blank control group， MCF-7 breast cancer cells overexpressed TRIM32 migration distance at 12 and 24 h increased（P<0.05）.Conclusion ?TRIM32 is highly expressed in breast cancer cells， and overexpression of TRIM32 promotes breast cancer cell proliferation， infiltration and invasion ability， which may become a new target for breast cancer treatment.

Key words：TRIM32;Overexpression;Breast cancer

乳腺癌（breast cancer）是女性最常見的惡性腫瘤，也是導致女性癌癥死亡的第2位因素。傳統(tǒng)治療方法包括手術、放療和化療，雖然在很大程度上提高了患者生存率，但是死亡率仍然很高，因此研究乳腺癌發(fā)病和侵襲的分子機制將有助于乳腺癌的靶向治療。TRIM32是TRIM家族成員之一[1]，其參與調(diào)控細胞的增殖、分化、發(fā)育、凋亡以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程[2，3]。有研究報道[4]，TRIM32通過活化β-catenin信號通路促進胃癌細胞增殖、浸潤和侵襲。另有研究報道[5]，TRIM32高表達可促進肝細胞癌增殖。但TRIM32在乳腺癌細胞中的具體作用尚未明確。本研究旨在探討TRIM32過表達對MCF-7乳腺癌增殖、浸潤和侵襲的影響，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1主要藥品與試劑 ?10%胎牛血清、DMEM細胞培養(yǎng)基、胰酶、青-鏈霉素、PBS購自美國Hyclone公司;TRIM32兔多克隆抗體、GAPDH抗體、羊抗兔二抗購于美國proteintech公司;Lipofectamine 3000試劑盒和ECL顯色試劑盒購于美國賽默飛公司;基質(zhì)膠購于美國BD公司;Transwell小室購于美國康寧公司;CCK-8試劑盒購于上海碧云天生物公司;TRIM32過表達及空白對照質(zhì)粒由上海吉瑪生物公司合成;正常乳腺上皮細胞MCF-10A和乳腺癌MCF-7細胞為大連醫(yī)科大學附屬大連市中心醫(yī)院病理科保存。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 ?將MCF-10A和MCF-7細胞用含10%胎牛血清及100 IU/ml青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基放入5%的CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞密度達到90%左右時，胰酶消化，進而傳代及轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟按照Lipofectamine 3000試劑盒說明書進行。

1.2.2 Western blot實驗 ?用裂解液提取細胞蛋白，根據(jù)Bradford方法對蛋白定量，將蛋白提取液與上樣緩沖液混勻煮沸，上樣，SDS-PAGE電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)印，3% BSA封閉，TRIM32及GAPDH一抗（1∶1000）4℃孵育過夜，羊抗兔二抗37℃孵育2 h，ECL顯色試劑盒顯色，使用DNR發(fā)光系統(tǒng)進行發(fā)光。

1.2.3 CCK-8實驗 ?將細胞接種到96孔板中，每孔細胞密度為2000個細胞，每孔含100 μl的10%胎牛血清和10 μl的CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中孵育2 h。酶標儀測定每孔細胞在450 nm處的吸收峰值，收集5 d數(shù)據(jù)。以細胞培養(yǎng)天數(shù)為橫軸，以細胞相對生長率為縱軸制作生長曲線。

1.2.4 Transwell實驗 ?將稀釋后的細胞懸液加入24孔Transwell上室中，下室加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。PBS沖洗2次，將基質(zhì)膠膜上層細胞用棉簽輕輕擦掉，用多聚甲醛固定基底膜20 min，結晶紫染色5 min，自來水沖洗。倒置顯微鏡觀察并計數(shù)遷移至膜下層的細胞數(shù)。每個樣本隨機選取5個視野，取其平均值。

1.2.5 Wound healing實驗 ?在6孔板背后均勻劃橫線，橫線間距為0.5 cm，每孔加5×105個細胞，培養(yǎng)箱中孵育，確保細胞達到100%融合。用槍頭對照橫線劃痕，PBS沖洗，并加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。按照0、12、24 h時間點觀察拍照。

1.3統(tǒng)計學分析 ?所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計，采用Students t檢驗方法，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 TRIM32的表達情況 ?Western blot實驗顯示，TRIM32在MCF-10A正常乳腺上皮細胞中低表達，而在MCF-7乳腺癌細胞中高表達（P<0.05），見圖1A;與空白對照組比較，MCF-7細胞中轉(zhuǎn)染TRIM32質(zhì)粒后TRIM32呈過表達（P<0.05），見圖1B。

2.2過表達TRIM32對MCF-7乳腺癌細胞增殖能力的影響 ?CCK-8實驗顯示，與空白對照組比較，TRIM32過表達后MCF-7細胞增殖率提高（P<0.05），見圖2。

2.3過表達TRIM32對MCF-7細胞浸潤和侵襲的影響 ?Transwell實驗顯示，與空白對照組比較，過表達TRIM32后MCF-7乳腺癌細胞穿孔數(shù)目增加（P<0.05），見圖3。Wound healing實驗顯示，與空白對照組比較，過表達TRIM32后MCF-7乳腺癌細胞12、24 h的遷移距離增加（P<0.05），見圖4。

3討論

TRIM32屬于TRIM家族成員之一，最初認為其具有調(diào)節(jié)骨骼肌干細胞分化功能，在肌肉再生中起重要作用[6]。TRIM32包含6個NHL（NCL-1、HT2A和LIN-41）重復序列，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用。TRIM32是一種E3泛素連接酶，通過泛素化和降解P53，促進致癌基因轉(zhuǎn)化和致癌過程[7]。最初發(fā)現(xiàn)TRIM32在小鼠的皮膚癌變模型中表達升高，隨后在人類頭頸鱗狀細胞癌中也發(fā)現(xiàn)TRIM32過表達，提示TRIM32參與皮膚癌變過程[8，9]。文獻報道，TRIM32在各種類型的癌中存在高表達，如在胃癌[10]、乳腺癌[11]、肺癌[12]和肝細胞癌[5]中高表達，其過表達與腫瘤預后差密切相關。

本研究通過轉(zhuǎn)染TRIM32過表達質(zhì)粒，調(diào)控MCF-7乳腺癌細胞中TRIM32的內(nèi)源性過表達水平，分析過表達TRIM32對MCF-7乳腺癌細胞生物學功能的變化，結果發(fā)現(xiàn)TRIM32在MCF-10A正常乳腺上皮細胞中低表達，而在MCF-7乳腺癌細胞中高表達（P<0.05）。與空白對照組比較，MCF-7細胞中轉(zhuǎn)染TRIM32質(zhì)粒后TRIM32呈過表達（P<0.05）。細胞的增殖率是衡量腫瘤細胞惡性生物學行為的重要指標。CCK-8實驗顯示，與空白對照組比較，TRIM32過表達后MCF-7細胞增殖率提高（P<0.05），表明TRIM32過表達促進MCF-7細胞增殖能力，提示在乳腺癌發(fā)生中TRIM32可能為一種原癌基因，其表達上調(diào)后促進乳腺癌細胞的惡性增殖過程。細胞遷移、浸潤和粘附是腫瘤預后差和轉(zhuǎn)移的關鍵因素，是衡量腫瘤細胞惡性程度的重要指標[13]。Transwell實驗顯示，與空白對照組比較，過表達TRIM32后MCF-7乳腺癌細胞穿孔數(shù)目增加（P<0.05）;Wound healing實驗顯示，與空白對照組比較，過表達TRIM32后MCF-7乳腺癌細胞12、24 h的遷移距離較對照組增加（P<0.05）。提示TRIM32具有原癌基因功能，其表達上調(diào)后促進乳腺癌浸潤、轉(zhuǎn)移侵襲過程。