曹自平 江豁達 姜良勇

摘要：目的 ?探討乳腺癌殘障蛋白-1（Dab1）與E-鈣粘蛋白（E-cad）在乳腺癌中的表達及其與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的相關(guān)性。方法 ?收集2018年3月～2019年3月佳木斯大學附屬第一醫(yī)院病理科乳腺癌組織與癌旁組織各80例，采用免疫組織化學方法檢測乳腺癌Dab1和E-cad的表達，并分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 ?Dab1在乳腺癌組織中的陽性表達率為45.00%（36/80），在癌旁組織中的陽性表達率為75.00%（60/80）;E-cad在乳腺癌組織中的陽性表達率為60.00%（48/80），在癌旁組織中的陽性表達為85.00%（68/80），差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;不同年齡、月經(jīng)史、腫瘤大小間Dab1、E-cad陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;不同TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況間Dab1、E-cad陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;Spearman相關(guān)分析顯示，Dab1和E-cad呈正相關(guān)（r=0.226，P<0.05）。結(jié)論 ?Dab1、E-cad在乳腺癌中異常表達，二者呈正相關(guān)，均與乳腺癌臨床分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，可作為判斷乳腺癌預后的指標。

關(guān)鍵詞：殘障蛋白-1;E-鈣粘蛋白;上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化;乳腺癌;免疫組織化學

中圖分類號：R737.31 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.04.024

文章編號：1006-1959（2020）04-0080-03

Abstract：Objective ?To investigate the expression of breast cancer disability protein-1（Dab1） and E-cadherin（E-cad）in breast cancer and their correlation with epithelial-mesenchymal transition （EMT）.Methods ?From March 2018 to March 2019， 80 cases of breast cancer tissues and adjacent tissues from the Department of Pathology of the First Affiliated Hospital of Jiamusi University were selected.The expressions of Dab1 and E-cad in breast cancer were detected by immunohistochemistry，and their correlation with the relationship between the clinicopathological characteristics of patients.Results ?The positive expression rate of Dab1 in breast cancer tissues was 45.00% （36/80），and the positive expression rate in adjacent tissues was 75.00%（60/80）.The positive expression rate of E-cad in breast cancer tissues 60.00%（48/80），the positive expression in the adjacent tissues was 85.00%（68/80），the differences were statistically significant（P<0.05）;There was no significant difference in Dab1， E-cad positive rates between different ages，menstrual history，and tumor size（P>0.05）;Dab1，E-cad positive rates were different among different TNM stages，degrees of differentiation， and lymph node metastasis，the difference was statistically significant（P<0.05）;Spearman correlation analysis showed that Dab1 and E-cad were positively correlated （r=0.226，P<0.05）.Conclusion ?Dab1 and E-cad are abnormally expressed in breast cancer.Both of them are positively correlated，and both are related to the clinical stage of breast cancer，the degree of tumor differentiation，and lymph node metastasis.Therefore，the two can be used as indicators to judge the prognosis of breast cancer.

Key words：Disability protein-1;E-cadherin;Epithelial-mesenchymal transition;Breast cancer;Immunohistochemistry

乳腺癌（breast cancer）現(xiàn)已成為威脅女性健康的首要惡性腫瘤[1]。復發(fā)、局部浸潤、遠處轉(zhuǎn)移仍是其治療失敗、造成死亡的主要原因。乳腺癌轉(zhuǎn)移是一個具有復雜步驟的生物學過程，相關(guān)研究表明該過程與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymaltransition，EMT）有關(guān)[2]。乳腺癌細胞在經(jīng)歷EMT之后，其侵襲性增強，繼而浸潤至周圍基質(zhì)中，形成促進腫瘤生長與轉(zhuǎn)移的微環(huán)境，它與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及干細胞特征密切相關(guān)[3]。E-鈣粘蛋白（E-cadherin，E-cad）是其特征性分子，其表達下調(diào)預示腫瘤發(fā)生著EMT現(xiàn)象。近年來研究表明殘障蛋白-1（Disabled-1，Dab1）與腫瘤進展有關(guān)，其表達情況與患者的腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移亦有關(guān)，這預示著Dab1蛋白可以促進乳腺癌的浸潤與轉(zhuǎn)移。目前，有關(guān)Dab1蛋白與乳腺發(fā)生EMT的研究鮮有報道，本研究通過聯(lián)合檢測Dab1與E-cad在乳腺癌中的表達，探討乳腺癌中Dab1、E-cad的表達與EMT的相關(guān)性，以期為臨床判斷乳腺癌預后療效提供參考。

1材料與方法

1.1材料 ?收集2018年3月～2019年3月佳木斯大學附屬第一醫(yī)院病理科乳腺癌組織、癌旁組織各80例。

1.2試劑 ?兔抗人Dab1抗體，兔抗人E-cadherin，購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司;PS法試劑盒、DAB顯色試劑，PBS憐酸鹽緩沖液、石蠟切片機、電烤箱、恒溫水浴箱、冰箱、光學顯微鏡、計算機病理圖文分析系統(tǒng)由佳木斯大學附屬第一醫(yī)院病理科提供。

1.3免疫組化方法 ?將石蠟塊切成4 μm的切片，置于60℃烤箱烤片，常規(guī)二甲苯脫蠟，乙醇水化;用PBS與蒸餾水沖洗3次，3 min/次;置于EDTA抗原修復液（pH=8.0）高溫高壓修復40 min，冷卻至室溫;用3%過氧化氫滅活、封閉內(nèi)源性生物素;滴加山羊血清封閉抗原，滴加稀釋濃度為1∶600的Dab1、滴加稀釋濃度為1∶200的E-cad抗體，孵育1 min;用PBS沖洗3次，3 min/次;滴加二抗，孵育1 min，再PBS沖洗3次3次，3 min/次;滴加顯色劑，顯微鏡下控制顯色，用蒸餾水沖洗，蘇木精復染細胞核;樹膠封片，光學顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.4結(jié)果判定 ?由2位病理科醫(yī)師進行判定，采用雙定量評分法進行評定：①陽性細胞所占百分比：分為5個等級，分別為0分、1分、2分、3分、4分，其陽性細胞數(shù)分別<10%、10%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%。②染色程度評分：分為3個等級，分別為淡黃色、棕黃色、棕褐色，分別為：1分、2分、3分。<3分為陰性（-），≥3分為陽性（+）。按分數(shù)將表達程度分4個等級：分別為0～2分、3～4分、5～8分、>9分，對應陰性（-）、低表達（+）、中表達（++）、高表達（+++），其中低、中、高表達均按陽性記。

1.5統(tǒng)計學方法 ?采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，Dab1和E-cad在乳腺癌組織和癌旁組織表達比較采用？字2檢驗，Dab1和E-cad的相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 Dab1蛋白和E-cad蛋白的表達 ?Dab1和E-cad在乳腺癌組織和癌旁組織中陽性產(chǎn)物主要存在于胞質(zhì)內(nèi)，均為黃色或棕黃色顆粒（圖1、圖2），Dab1和E-cad在乳腺癌組織中的陽性表達率分別為45.00%（36/80）和60.00%（48/80），在癌旁組織中的陽性表達率分別為75.00%（60/80）和85.00%（68/80），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.2 Dab1和E-cad的表達與臨床病理因素的關(guān)系 ?不同年齡、月經(jīng)史、腫瘤大小間Dab1、E-cad陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;不同TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況間Dab1、E-cad陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

2.3乳腺癌中Dab1和E-cad表達的相關(guān)性分析 ?Spearman相關(guān)分析顯示，Dab1和E-cad在乳腺癌組織中呈正相關(guān)（r=0.226，P<0.05）。

3討論

目前，乳腺癌發(fā)病率逐年升高，異質(zhì)性、轉(zhuǎn)移、復發(fā)及死亡仍然是乳腺癌治療失敗的主要原因，因此，積極尋找腫瘤相關(guān)因子十分重要。乳腺癌的轉(zhuǎn)移、復發(fā)是一個很復雜、多步驟的過程，其中EMT在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色，故積極尋找EMT相關(guān)蛋白具有十分重要的意義。

本研究結(jié)果顯示，E-cad在乳腺癌組織中的表達較癌旁組織中的陽性表達率低，這說明E-cad的低表達促進組織發(fā)生癌變，在乳腺癌的發(fā)生過程中起著促進作用。有研究表明[4]，乳腺癌組織95%來源于由上皮細胞組織。E-cad是一種鈣粘蛋白[5]，主要作用是穩(wěn)定正常組織的上皮細胞，如E-cad發(fā)生異常，組織也容易癌變，這也充分表明E-cad在正常乳腺組中發(fā)揮著重要的抑癌作用，其低表達促進乳腺癌的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，在高、中、低分化的組織中，低分化組織中E-cad陽性率更低，這就說明E-cad的陽性表達率越低，腫瘤的惡性程度越高，沒有了E-cad的穩(wěn)定性保護，癌組織惡性程度增加，這可以作為判斷組織良惡性的指標。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)E-cad的表達缺失與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，這說明E-cad的缺失證實存在著EMT現(xiàn)象，從而使癌細胞更容易獲得活動的能力，沿著血道、淋巴道向遠處轉(zhuǎn)移。有研究表明[6]，E-cad表達降低預示著細胞間的連接性遭到破壞，導致腫瘤細胞向局部浸潤或有遠處轉(zhuǎn)移。一般認為乳腺癌細胞在發(fā)生EMT進入血管后，形成循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs），癌細胞獲得間質(zhì)表型，突破基底膜向遠處轉(zhuǎn)移，同時，CTCs回到原發(fā)灶，增強原發(fā)病灶向周圍組織浸潤，加快腫瘤進展速度[7]，本研究與上述研究結(jié)論基本一致，進一步證實上皮穩(wěn)定因子E-cad的缺失或功能遭到破壞，癌細胞的移動能力大大提高，促進EMT現(xiàn)象的發(fā)生，更易通過局部轉(zhuǎn)移，沿著淋巴道、血道向遠處的器官轉(zhuǎn)移，形成新的轉(zhuǎn)移灶，危及患者生命。

Dab1的缺失通常會造成精神疾病的發(fā)生[8，9]，其的低表達與腦膠質(zhì)瘤與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展有關(guān)，是一個潛在的抑癌基因。本研究結(jié)果顯示，Dab1在乳腺癌中的表達較癌旁正常組織是下調(diào)的，這說明Dab1參與了乳腺癌的發(fā)生，并可以促進乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，更加證實它的低表達可以促進乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，并且這是一個抑癌基因。本研究還發(fā)現(xiàn)在分化差的乳腺組織中Dab1的陽性表達更低，這就說明正常的乳腺細胞在失去Dab1的調(diào)控的情況下，就會不斷地增殖、更新，甚至失去凋亡的能力，導致低分化組織的出現(xiàn)，因此，Dab1陽性率越低的乳腺癌組織分化越差。有研究表明[10]，Dab1在乳腺癌組織中的含量與乳腺癌細胞的惡化程度負相關(guān)，本研究與上述研究結(jié)論基本一致。Dab1在乳腺癌中的表達隨著臨床分期的增高而表達下降，這表明Dab1的表達情況影響著乳腺癌的預后，臨床分期的高低決定了乳腺癌患者的輔助治療方案的選擇。Spearman相關(guān)分析顯示，Dab1和E-cad在乳腺癌組織中呈正相關(guān)（r=0.226，P<0.05），這表明Dab1與E-cad共同促進了腫瘤發(fā)生EMT現(xiàn)象。

綜上所述，Dab1的表達與乳腺癌局部浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)，并與E-cad二者共同促進EMT的發(fā)生，但Dab1促進腫瘤發(fā)生EMT的機制還需進一步研究，逐步完善。本實驗尚存在不足之處，操作可能存在一定誤差，樣本量較少，仍需大量臨床研究。

參考文獻：

[1]Dasgupta P，Aitken JF，Pyke C，et al.Competing mortality risks among women aged 50-79 years when diagnosed with invasive breast cancer，Queensland，1997-2012[J].Breast，2018（41）：113-119.

[2]Wei Z，Shan Z，Shaikh ZA.Epithelial-mesenchymal transition in breast epithelial cells treated with cadmium and the role of Snail[J].Toxicology and Applied Pharmacology，2018，344（1）：46-55.

[3]劉志嫻，魏爾清，盧韻碧.上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用研究進展[J].浙江大學學報（醫(yī)學版），2015，44（2）：211-216.

[4]郭魚波，王春暉，裴曉華.乳腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的分子機制及其防治的研究進展[J].中國腫瘤，2018，27（12）：933-943.

[5]雷珍，鐘錫明，周岐，等.p53，Ki-67及E-鈣粘蛋白在三陰性乳腺癌中的表達及預后[J].臨床與病理雜志，2017（2）：308-314.

[6]da Cunha IW，Souza MJ，da Costa WH，et al.Epithelial-mesenchymal transition（EMT）phenotype at invasion front of squamous cell carcinoma of the penis influences oncological outcomes[J].Urol Oncol，2016，34（433）：e19-e26.

[7]Ortega FG，Alvarez-Cubero MJ，Nadal R，et al.EMT and EGFR in CTCs cytokeratin negative non-metastatic breast cancer[J].Oncotarget，2014，5（17）：7486-7497.

[8]張建華.DCC介導的Dab1磷酸化參與調(diào)控新皮質(zhì)神經(jīng)元輻射遷移的研究[D].東北師范大學，2018.

[9]王瓊.Reelin-dab1信號轉(zhuǎn)導通路在鋁致Aβ代謝異常中的作用及其機制研究[D].山西醫(yī)科大學，2018，31（8）：3278-3281.

[10]王同玫，張一奇，文普帥，等.乳腺癌組織中Dab1蛋白表達及其臨床相關(guān)性研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2018，28（15）：32-36.

收稿日期：2019-11-26;修回日期：2019-12-02

編輯/李國苗