方芳 羅伏鋼 宋明芬 李靜 劉文娟 胡霖霖 李梅 張永華 邵瓊琰

[摘要] 目的 研究中縫核miR-16以及5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（serotonin transporter，SERT）的表達(dá)在失眠癥發(fā)病機(jī)制中的作用。 方法 20只雌性SD大鼠，隨機(jī)分成對照組和失眠組。失眠組大鼠接受腹腔注射對氯苯丙氨酸（p-chlorophenalanine，PCPA）350 mg/（kg·d），連續(xù)3 d，對照組給予等量生理鹽水。取中縫核組織，測定其miR-16、SERT mRNA與SERT蛋白水平，進(jìn)行注射前后的組間比較。 結(jié)果 失眠組大鼠中縫核miR-16相對水平（1.23±0.33）與對照組（0.71±0.25）比較明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.68，P=0.000）;而失眠組SERT mRNA相對水平（0.68±0.14）以及SERT蛋白相對水平（0.28±0.11）顯著低于相應(yīng)的對照組（1.06±0.30，0.57±0.15）（t=3.94，P=0.004;t=4.69，P=0.002）。 結(jié)論 中縫核miR-16以及SERT的異常表達(dá)，可能參與了失眠癥的發(fā)病機(jī)制。

[關(guān)鍵詞] 失眠;miR-16;5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體;中縫核

[中圖分類號] R74? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）02-0034-04

Expression of raphe nuclei miR-16 and serotonin transporter in insomnia model rats

FANG Fang1? ?LUO Fugang2? ?SONG Mingfen3? ?LI Jing3? ?LIU Wenjuan4? ?HU Linlin4? ?LI Mei4? ?ZHANG Yonghua4? ?SHAO Qiongyan5

1.Emergency Room， Hangzhou Seventh People's Hospital， Hangzhou? ?310013， China; 2.Department of Geriatrics， Hangzhou Seventh People's Hospital， Hangzhou? ?310013， China; 3.Molecular Biology Laboratory， Hangzhou Seventh People's Hospital， Hangzhou 310013， China; 4.Department of Psychophysiology， Hangzhou Seventh People's Hospital， Hangzhou? ?310013， China; 5.Third Clinical College， Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou? 310053， China

[Abstract] Objective To study the role of raphe nuclei miR-16 and serotonin transporter（SERT） expression in the pathogenesis of insomnia. Methods Twenty female Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group and insomnia group. Rats in the insomnia group received intraperitoneal injection of p-chlorophenalanine（PCPA） 350 mg/（kg·d） for 3 days， and the control group was given the same amount of saline. The raphe nuclei tissue was taken and the levels of miR-16， SERT mRNA and SERT protein were measured， and the comparison between groups before and after injection was performed. Results The relative level of miR-16 in the raphe nuclei（1.23±0.33） of the insomnia group was significantly higher than that in the control group（0.71±0.25）. The difference was statistically significant（t=6.68， P=0.000）. The relative levels of SERT mRNA （0.68±0.14） and SERT protein （0.28±0.11） in insomnia group were significantly lower than those（1.06±0.30， 0.57±0.15） of the corresponding control group（t=3.94， P=0.004; t=4.69， P=0.002）. Conclusion Abnormal expression of miR-16 and SERT in the raphe nuclei may be involved in the pathogenesis of insomnia.

[Key words] Insomnia; miR-16; Serotonin transporter; Raphe

當(dāng)今社會失眠發(fā)病率不斷攀升，據(jù)報(bào)道失眠的發(fā)病率高達(dá)10%[1，2]，已成為危害身心健康的社會公共衛(wèi)生問題[3]。但是失眠的發(fā)病機(jī)制未明?，F(xiàn)有研究提示，失眠的發(fā)病機(jī)制與5-羥色胺（5-HT）系統(tǒng)功能低下有關(guān)[4，5]。5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（serotonin transporter，SERT）分布于神經(jīng)突觸前膜，從突觸間隙中回收5-HT，起到調(diào)節(jié)突觸間隙5-HT濃度的作用，決定與突觸后受體結(jié)合的5-HT量和作用持續(xù)時(shí)間，在5-HT神經(jīng)傳遞系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用[6]。目前研究表明，SERT基因是miR-16的靶基因[7-9]。但是失眠癥miR-16及其靶基因SERT的表達(dá)水平尚不清楚。本次實(shí)驗(yàn)建立對氯苯丙氨酸（p-chlorophenalanine，PCPA）大鼠失眠模型，檢測中縫核miR-16與SERT水平，探討miR-16及其靶基因SERT的表達(dá)在失眠癥發(fā)病機(jī)制中的作用，為進(jìn)一步了解失眠癥的5-HT機(jī)制提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

清潔級健康雌性Sprague Dawley（SD）大鼠，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號：SCXK（浙）2014-0001，8周齡，體重約250 g。飼養(yǎng)室溫度控制在（25±1）℃， 相對濕度為（55±5）%，12 h/12 h明暗交替照明，自由飲水和攝食。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 方法

1.2.1 動物處理? 20只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成對照組和失眠組。大鼠失眠模型的建立參照以往的研究進(jìn)行[10]。PCPA（購自美國Sigma公司），用生理鹽水制成混懸液，現(xiàn)用現(xiàn)配。失眠組大鼠腹腔注射PCPA劑量為350 mg/kg，體積為10 mL/kg，1次/d，連續(xù)3 d。對照組大鼠腹腔注射等量的生理鹽水。

1.2.2 大鼠一般狀況觀察? 觀察兩組大鼠一般狀況，包括精神狀態(tài)、對應(yīng)激的反應(yīng)情況、毛發(fā)情況、日間與夜晚活動情況等。

1.2.3 造模成功的判斷? 采用戊巴比妥鈉翻正實(shí)驗(yàn)判斷。在第3次注射后36 h，兩組大鼠均腹腔注射戊巴比妥鈉（購自美國Sigma公司）50 mg/kg（引起所有大鼠睡眠的最小域劑量），將大鼠腹部朝上平放，以翻正反射消失為發(fā)生睡眠，以翻正反射恢復(fù)為覺醒[10]，記錄大鼠的睡眠潛伏期及睡眠持續(xù)時(shí)間。若大鼠白天與夜晚都頻繁活動，且戊巴比妥鈉翻正實(shí)驗(yàn)中對照與失眠組的睡眠潛伏期、睡眠持續(xù)時(shí)間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，則造模成功。

1.2.4 中縫核取材? 戊巴比妥鈉翻正實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，斷頭處死大鼠，剪開顱骨，分離腦組織置于冰上，從腦干中切取中縫核，-80℃冷凍待測miR-16、SERT mRNA和SERT蛋白。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測定miR-16? 通過總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取中縫核總RNA，用Nanodrop（美國thermo scientific公司）測定濃度和純度;取2 μg總RNA用cDNA第一鏈合成試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR擴(kuò)增測定miR-16水平，miRNAs熒光定量檢測試劑盒（SYBR Green）購自天根生化科技（北京）有限公司。miR-16正向引物：5'-TAGCAGCACGTAAATTGGCG-3'。反向引物從miRNAs熒光定量檢測試劑盒（SYBR Green）中獲得，序列未顯示。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 2min預(yù)變性;然后94℃ 20s，52℃ 30s，72℃ 30s，循環(huán)35次。熒光PCR儀購自ABI公司，型號Stepone Plus，獲得Ct值，并根據(jù)內(nèi)參U6計(jì)算miR-16的相對含量。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測定中縫核SERT mRNA水平? 上述獲得的cDNA采用SYBR Green法測定SERT mRNA水平，熒光定量檢測試劑盒（SYBR Green）購自大連TaKaRa公司，步驟按照說明書進(jìn)行。使用β-actin作為內(nèi)參，得出大鼠中縫核組織中SERT mRNA的相對表達(dá)水平。

1.2.7 Western blot法測定SERT蛋白? 使用總蛋白提取試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）提取中縫核組織的總蛋白，并且通過BCA法（碧云天生物技術(shù)公司）對蛋白進(jìn)行定量。SERT抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗均購自Santa Cruz公司。使用ChemiDocTM XRS+分子成像儀（美國Bio-rad公司）進(jìn)行蛋白條帶分析，并用內(nèi)參β-actin校正，得出相對SERT蛋白的相對水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。注射前失眠組和對照組之間比較、注射后失眠組和對照組之間比較采用成組t檢驗(yàn);失眠組在注射前后比較、對照組在注射前后比較采用配對t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況

對照組大鼠精神狀態(tài)良好，活動機(jī)靈，反應(yīng)敏捷，毛發(fā)有光澤。失眠組大鼠精神亢奮，易激惹，毛發(fā)光澤較對照組差，日間與夜晚皆活動不斷。

2.2 大鼠失眠模型的評定

失眠組睡眠潛伏期明顯長于對照組（P<0.01），而睡眠持續(xù)時(shí)間明顯短于對照組（P<0.01）。見表1。

表1? ?戊巴比妥鈉翻正實(shí)驗(yàn)結(jié)果（x±s，min）

2.3 兩組大鼠中縫核miR-16水平變化

PCPA注射前，失眠組miR-16相對含量（0.69±0.17）與對照組（0.76±0.21）比較無明顯差異（t=1.45，P=0.190）;注射后，失眠組miR-16相對含量（1.23±0.33）明顯高于對照組（0.71±0.25），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.68，P=0.000）。見圖1。

圖1? ?PCPA注射前后兩組中縫核miR-16水平變化

2.4 兩組大鼠中縫核SERT mRNA變化

PCPA注射前，失眠組SERT mRNA相對含量（1.20±0.28）與對照組（1.14±0.36）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.39，P=0.700）;注射后，失眠組SERT mRNA相對含量（0.68±0.14）明顯低于對照組（1.06±0.30），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.94，P=0.004）。見圖2。

圖2? ?PCPA注射前后兩組大鼠SERT mRNA水平變化

2.5 兩組大鼠中縫核SERT蛋白表達(dá)變化

PCPA注射前，失眠組SERT 蛋白相對含量（0.62±0.23）與對照組（0.51±0.15）比較無顯著差異（t=1.50，P=0.170）;注射后，失眠組SERT 蛋白相對含量（0.28±0.11）明顯低于對照組（0.57±0.15），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.69，P=0.002）。見圖3。

3討論

針對失眠癥患者5-HT神經(jīng)遞質(zhì)功能低下的特點(diǎn)，臨床上選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物（selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs）通常用于失眠癥的治療，且獲得較好的臨床療效[11，12]。SSRIs類藥物以SERT為作用靶點(diǎn)，通過抑制SERT對突觸間隙5-HT的再回收，提高突觸間隙5-HT水平，進(jìn)而增強(qiáng)5-HT系統(tǒng)功能而發(fā)揮其藥理學(xué)作用[13]。本次研究結(jié)果表明，失眠大鼠的SERT mRNA與SERT蛋白表達(dá)水平均顯著低于對照組，提示SERT參與了失眠的發(fā)生和發(fā)展。分析SERT表達(dá)下降的原因可能為失眠大鼠的5-HT功能下降，突觸間隙5-HT水平降低，使SERT反饋性低表達(dá)，以減少5-HT從突觸間隙再攝取至突觸前神經(jīng)元內(nèi)，從而增加和突觸后膜上5-HT受體結(jié)合的5-HT量。

越來越多的證據(jù)表明，miRNAs在腦組織中呈特異性表達(dá)，它們可能在大腦神經(jīng)可塑性以及腦功能發(fā)揮中起重要作用[14]，同時(shí)，它們可能參與了諸多精神疾病如抑郁癥的表觀遺傳學(xué)機(jī)制和藥物治療機(jī)制[15，16]。有研究指出，miRNAs可能參與調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律，因而與失眠相關(guān)。CLOCK基因在晝夜節(jié)律調(diào)控方面發(fā)揮重要作用，miR-182對該基因的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用[17];另外，miR-219-1/132/183/96/182也參與了生物鐘的調(diào)節(jié)[18]。Saus等[19]發(fā)現(xiàn)pre-miR-182的rs76481776位點(diǎn)T等位基因與抑郁癥患者的失眠相關(guān)。在治療方面，miR-101a被發(fā)現(xiàn)參與針灸治療失眠的作用機(jī)制[20]。多項(xiàng)研究指出，SERT基因表達(dá)受miR-16的調(diào)節(jié)，miR-16與SERT mRNA的3非翻譯區(qū)（3-untranslated region，UTR）結(jié)合，引起mRNA的降解，抑制基因翻譯，從而在翻譯水平調(diào)節(jié)SERT表達(dá)[21-24]。有學(xué)者對miR-16與抑郁癥的關(guān)系方面進(jìn)行了闡明，母愛剝奪抑郁模型大鼠海馬miR-16水平明顯高于對照組大鼠，且miR-16的高低與抑郁行為相關(guān)[25];抗抑郁藥氟西汀能降低小鼠海馬組織miR-16，如果使用人工合成的抗miR-16對miR-16進(jìn)行中和，則小鼠亦表現(xiàn)出抑郁樣行為[26]。但是，miR-16是否與失眠癥相關(guān)，至今相關(guān)的報(bào)道較少。本次研究發(fā)現(xiàn)，miR-16在失眠模型大鼠中表達(dá)升高，提示miR-16作為SERT基因的調(diào)節(jié)因子，可能通過介導(dǎo)SERT基因的表達(dá)調(diào)節(jié)，發(fā)揮其在失眠癥中的作用。。

本研究存在不足。（1）本次實(shí)驗(yàn)選用雌性大鼠作為研究對象。研究提示，失眠癥存在性別差異[27]，臨床上失眠癥患者女性多于男性，本次研究采用雌性大鼠作為研究對象，今后需對雄性大鼠進(jìn)行相關(guān)研究，以明確不同性別間的差異。（2）因中縫核與5-HT系統(tǒng)功能密切相關(guān)，本次實(shí)驗(yàn)只對5-HT能神經(jīng)元聚集的中縫核進(jìn)行了研究，今后有待對失眠癥相關(guān)的其他腦區(qū)進(jìn)行研究。

總之，本次實(shí)驗(yàn)提示失眠模型大鼠中縫核miR-16、SERT基因表達(dá)發(fā)生異常，miR-16可能通過參與改變SERT蛋白水平，從而調(diào)節(jié)體內(nèi)5-HT遞質(zhì)系統(tǒng)，參與失眠癥的發(fā)病機(jī)制。

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（收稿日期：2018-12-28）