劉欣彤，王玉鳳，陳孝杰，劉義明，徐 飛，王宏磊，張志博，張向陽，李 存，李秀波*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所,國家飼料藥物基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384)

咪唑苯脲注射液(imidocarb，IM)又稱雙脒苯脲或咪多卡，是一種動(dòng)物專用二苯基脲衍生物類新型抗原蟲的化學(xué)藥物[1]。該藥是由Schmidt應(yīng)用鼠駱巴貝西蟲篩選均二苯脲類化合物時(shí)發(fā)現(xiàn)的，由Beveridge研究證實(shí)該藥的半數(shù)致死量低于其他抗巴貝西蟲藥物，已上市產(chǎn)品由瑞士Monbijoustrasse公司研發(fā)[2]。我國在1985年首次成功合成了咪唑苯脲的二丙酸鹽和雙鹽酸鹽形式。由于雙鹽酸鹽對(duì)局部組織具有較強(qiáng)刺激性，臨床上一般常用二丙酸鹽做成制劑[3]，通過肌肉或皮下注射的方式給藥[4]。在抗犬[5]、牛[6]、羊[7]、羔羊[8]、馬[9]巴貝西蟲病方面具有良好的治療和預(yù)防效果，也可用于抗牛泰勒蟲病[10]、抗牛邊蟲病[11]、抗小鼠利什曼病[12]、抗犬埃立克體病[13]、抗羊/豬附紅細(xì)胞體病[14-15]、抗梨形蟲病[16]、抗錐蟲病[17]等[18]。注射后迅速吸收并分布于全身組織，1 h后即可達(dá)到血藥峰濃度，在腎臟中濃縮并以原型再吸收，在肝臟中解毒。本品毒副作用較小，但靜脈注射毒性大，且內(nèi)服無效[19]。作為獸用專用藥，咪唑苯脲具有用量小、藥效持久、療程短、刺激小、耐藥性低、使用方便等特點(diǎn)。該藥已廣泛應(yīng)用于世界各地，是當(dāng)今國際公認(rèn)的最佳抗原蟲藥[20]。鑒于國內(nèi)當(dāng)前沒有咪唑苯脲注射液臨床使用有關(guān)全部特殊安全性方面的資料，且我國已批準(zhǔn)進(jìn)口該藥，根據(jù)農(nóng)業(yè)部公告要求，在國內(nèi)生產(chǎn)此產(chǎn)品，須進(jìn)行特殊安全性試驗(yàn)。因此，本研究通過豚鼠、新西蘭大白兔的皮膚致敏、皮膚刺激、肌肉刺激、紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)，全面考察咪唑苯脲注射液的特殊安全性，為其臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 受試藥物 咪唑苯脲注射液，1211.5 mg/mL，由齊魯動(dòng)物保健品有限公司提供，批號(hào)：1503003。陽性對(duì)照藥物：1-氯-2,4-二硝基苯(含量99%)，購自北京百靈威科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大白兔(體重2.5～3 kg) 16只，雌雄各半，單籠、常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，由北京市海淀興隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖廠提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)為：SLB112018122420091788和SLB112018122420091780；豚鼠系Hartley種白化豚鼠26只(一級(jí)，體重260～320 g)，雌雄各半，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，由北京市海淀興旺動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(京)2016-0003。

1.3 試驗(yàn)方法及判定原則

1.3.1 皮膚刺激試驗(yàn) 采用新西蘭大白兔進(jìn)行，分組及劑量見表1。取咪唑苯脲注射劑，直接涂布于左側(cè)已去毛的皮膚上，然后用二層紗布(2.5 cm×2.5 cm) 和一層無刺激塑料膜覆蓋，再用無刺激膠布固定，家兔的右側(cè)去毛皮膚涂布賦形劑(生理鹽水) 作對(duì)照。貼敷4 h后，除去受試物并用溫水清潔給藥部位。每天一次，連續(xù)7 d，每次給藥時(shí)間相同。每次去除藥物后1 h以及再次貼敷前觀察去毛部位皮膚是否有紅斑、水腫及其他異常表現(xiàn)，并在末次給藥后1、24、48、72 h肉眼觀察去毛部位皮膚局部反應(yīng)，按照《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[21](以下簡稱《原則》)進(jìn)行刺激反應(yīng)評(píng)分。按表2判定受試動(dòng)物評(píng)分積分的平均值進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，最高積分均值<0.50，無刺激性；0.50～2.99，輕度刺激性；3.00～5.99，中度刺激性；6.00～8.0，強(qiáng)刺激性。

表1 皮膚刺激試驗(yàn)分組、劑量

表2 皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.2 皮膚致敏試驗(yàn) 采用白化豚鼠進(jìn)行，分組及劑量見表3，以豚鼠背部左側(cè)皮膚進(jìn)行染毒。先進(jìn)行誘導(dǎo)接觸，分別在試驗(yàn)0、7、14 d 時(shí)，在試驗(yàn)組豚鼠左側(cè)備皮處涂敷咪唑苯脲注射液，在陽性對(duì)照組動(dòng)物相同部位涂敷2，4-二硝基氯苯。末次誘導(dǎo)后14 d進(jìn)行激發(fā)接觸，實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組涂敷咪唑苯脲注射液，陽性對(duì)照組動(dòng)物涂敷2，4-二硝基氯苯。激發(fā)接觸實(shí)驗(yàn)染毒后24、48、72 h，根據(jù)表4和表5評(píng)判是否出現(xiàn)皮膚致敏反應(yīng)并判定致敏強(qiáng)度。

表3 皮膚致敏試驗(yàn)分組、劑量

表4 皮膚過敏反應(yīng)程度的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表5 皮膚致敏性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.3 肌肉刺激試驗(yàn) 采用新西蘭大白兔進(jìn)行，分組及劑量見表6。試驗(yàn)前24 h剪去兩側(cè)股四頭肌部位的兔毛，碘酊和乙醇消毒后分別在右側(cè)股四頭肌注入受試藥物(對(duì)照組注入0.9%氯化鈉溶液)，左側(cè)股四頭肌注入同樣體積的滅菌0.9%氯化鈉溶液作為右側(cè)的對(duì)照。給予受試物后4、12、24、48 h觀察皮膚表面的反應(yīng)及變化情況。觀察48 h后將家兔處死，剖開股四頭肌，肉眼觀察注射部位肌肉組織的藥液吸收情況，檢查注射局部是否產(chǎn)生刺激性反應(yīng)；并將高、中、低劑量組和對(duì)照組各2只(雌雄各1只) 注射部位肌肉標(biāo)本用10%中性福爾馬林固定液浸泡固定，做組織切片進(jìn)行病理學(xué)檢驗(yàn)。根據(jù)《原則》進(jìn)行刺激反應(yīng)評(píng)分。根據(jù)表7計(jì)算肌肉刺激性總反應(yīng)級(jí)，計(jì)算平均值，按表8判定刺激等級(jí)。若各股四頭肌反應(yīng)級(jí)的最高與最低之差大于2，應(yīng)另取動(dòng)物重新試驗(yàn)。

表6 肌肉刺激試驗(yàn)分組和劑量

表7 肌肉刺激反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

表8 平均分值和等級(jí)

1.3.4 溶血試驗(yàn) 試驗(yàn)動(dòng)物為新西蘭大白兔2只，采用體外試管法，即肉眼觀察法進(jìn)行，分組及劑量見表9。采心臟血50 mL，制成脫纖血液，處理后置37 ± 0.5 ℃的恒溫箱中進(jìn)行溫育。15 min、1 h、2 h、3 h各觀察1次，若試驗(yàn)中的溶液呈澄明紅色，管底無細(xì)胞殘留或有少量紅細(xì)胞殘留，表明有溶血發(fā)生；如紅細(xì)胞全部下沉，上清液體無色澄明，表明無溶血發(fā)生。若溶液中有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀，振搖后不分散，表明有紅細(xì)胞凝聚發(fā)生。如有紅細(xì)胞凝聚的現(xiàn)象，進(jìn)一步判定是真凝聚還是假凝聚。

表9 紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)分組、劑量

2 結(jié)果與分析

2.1 皮膚刺激試驗(yàn) 6只受試新西蘭大白兔連續(xù)給藥7 d期間，在其去毛部位均未觀察到皮膚紅斑、水腫及其他異常表現(xiàn)，且在停藥后觀察期限內(nèi)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未出現(xiàn)紅斑和水腫等刺激反應(yīng)，見圖1；根據(jù)《原則》判定受試物咪唑苯脲注射液各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的刺激反應(yīng)積分均值為0，與陰性對(duì)照組比較無顯著差異，詳見表10，表明受試物咪唑苯脲注射液對(duì)新西蘭大白兔無皮膚刺激性。

圖1 新西蘭大白兔皮膚刺激結(jié)果

表10 皮膚刺激分值

2.2 皮膚致敏試驗(yàn) 受試藥物組和陰性對(duì)照組豚鼠的皮膚在激發(fā)給藥24、48、72 h 后，皮膚均未見紅斑和水腫現(xiàn)象(圖2)；根據(jù)《原則》判定受試藥物組和陰性對(duì)照過敏反應(yīng)率為0，而陽性對(duì)照組豚鼠均出現(xiàn)嚴(yán)重或中度紅斑和水腫，過敏反應(yīng)發(fā)生率為100%(表11)表明受試藥物咪唑苯脲注射液對(duì)豚鼠皮膚進(jìn)行誘導(dǎo)后不出現(xiàn)過敏反應(yīng)，試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

圖2 豚鼠給藥后 72 h 皮膚致敏結(jié)果

表11 皮膚致敏率

2.3 肌肉刺激試驗(yàn) 給予受試物后4、12、24、48 h均未觀察到注射部位充血、瘙癢、起包。給予受試物后48 h 處死各劑量組和對(duì)照組各2只(雌雄各1只) 家兔，病理顯示其組織注射部位血管未見出血、血栓、血管擴(kuò)張充血、間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤及血管壁周圍組織壞死等異常改變，詳見圖3。判定各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的刺激反應(yīng)分值均為0，與陰性對(duì)照組比較無顯著差異，詳見表12，由此表明受試物咪唑苯脲注射液對(duì)新西蘭大白兔無皮膚刺激性。

表12 刺激性反應(yīng)分值

圖3 新西蘭大白兔給藥后48 h 皮膚致敏及病理結(jié)果

2.4 溶血試驗(yàn) 圖4結(jié)果顯示，1～6號(hào)試管在3 h內(nèi)紅細(xì)胞全部下沉，上清液體均為澄明，溶液中未見有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀；7號(hào)試管中的溶液呈澄明紅色，管底無細(xì)胞殘留或有少量紅細(xì)胞殘留。結(jié)果可判定受試藥物及陰性對(duì)照未發(fā)生溶血和凝聚，陽性對(duì)照組發(fā)生溶血，表明咪唑苯脲注射液對(duì)兔紅細(xì)胞無溶血和凝聚作用，可以注射使用。

圖4 新西蘭大白兔紅細(xì)胞溶血性結(jié)果

3 討論與結(jié)論

藥物特殊安全性試驗(yàn)是注射劑臨床前安全性評(píng)價(jià)的重要組成部分，主要由體外溶血性試驗(yàn)、過敏性試驗(yàn)、局部刺激性試驗(yàn)等組成。任何一項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)陽性，則表明該藥安全性評(píng)價(jià)不符合標(biāo)準(zhǔn)，不宜通過注射途徑給藥[21]。藥物刺激性是指藥物制劑經(jīng)非口服途徑給藥，對(duì)用藥局部產(chǎn)生刺激性。通過藥物在給藥部位使用后是否引起局部或全身毒性，以揭示臨床應(yīng)用時(shí)可能出現(xiàn)的毒性反應(yīng)、安全范圍等指標(biāo)，并為臨床提供參考[22]。

咪唑苯脲注射液涂敷部位的皮膚刺激試驗(yàn)，給藥劑量為0.5 mL。試驗(yàn)中同時(shí)進(jìn)行了生理鹽水的陰性對(duì)照試驗(yàn)。結(jié)果表明，受試兔在給藥后的1 h內(nèi)和每次去除藥物后1 h以及再次貼敷前去毛部位皮膚均未出現(xiàn)異常表現(xiàn)；在試驗(yàn)的第7天及停藥后3天內(nèi)受試兔外觀及病理觀察均正常。由此可見，咪唑苯脲注射液經(jīng)皮膚涂敷連續(xù)給藥7天及停藥后對(duì)受試兔是安全的。

咪唑苯脲注射液注射部位的肌肉刺激試驗(yàn)，給藥劑量為0.1 mL/kg，約為臨床正常劑量(1倍劑量)。試驗(yàn)中同時(shí)進(jìn)行了2倍劑量組、5倍劑量組和0.9%氯化鈉溶液的對(duì)照組試驗(yàn)。結(jié)果表明，每組受試兔的刺激反應(yīng)分值均為0，與陰性對(duì)照組比較無顯著差異；剖檢股四頭肌，肉眼觀察注射部位肌肉組織的藥液吸收良好，注射局部未產(chǎn)生刺激性反應(yīng)；病理組織注射部位肌肉切片的血管未見異常改變，病理學(xué)檢驗(yàn)正常。由此可見，咪唑苯脲注射液以5倍劑量經(jīng)肌肉注射對(duì)受試兔是安全的。

隨著上市新藥的增多，尤其是注射途徑藥物的廣泛應(yīng)用，藥物致敏反應(yīng)的發(fā)生率大大提高[21]。因此，臨床前致敏反應(yīng)評(píng)價(jià)非常關(guān)鍵。皮膚致敏是將具有致敏作用的化學(xué)物質(zhì)經(jīng)一定途徑進(jìn)入機(jī)體，與組織蛋白結(jié)合形成完全抗體，刺激免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生致敏淋巴細(xì)胞或體液抗體；經(jīng)1～2周致敏期，使體內(nèi)免疫反應(yīng)得到充分發(fā)展，形成一定數(shù)量的致敏淋巴細(xì)胞或特異抗體；當(dāng)再次接觸(激發(fā))時(shí)使機(jī)體對(duì)該化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生感受性增高的狀態(tài)，以一定的異常形式表現(xiàn)出來的反應(yīng)。

咪唑苯脲注射液涂抹部位的皮膚致敏試驗(yàn)，給藥劑量為0.5 mL/kg。試驗(yàn)中同時(shí)進(jìn)行了涂抹0.2 mL 2，4-二硝基氯苯的陽性對(duì)照和末次誘導(dǎo)后14 d再涂敷咪唑苯脲注射液的陰性對(duì)照。結(jié)果表明，激發(fā)接觸實(shí)驗(yàn)染毒后受試藥物組和陰性對(duì)照組受試豚鼠，無肉眼可見的病理變化，受試物咪唑苯脲注射液無過敏反應(yīng)；陽性對(duì)照組豚鼠均出現(xiàn)過敏反應(yīng)。由此可見，咪唑苯脲注射液以0.5 mL/kg的劑量經(jīng)皮膚涂敷給藥對(duì)受試豚鼠是安全的。

藥物制劑引起體內(nèi)溶血可分為免疫性溶血和非免疫性溶血兩類，都通過藥物引發(fā)溶血反應(yīng)。因此，凡是注射液和可能引起溶血反應(yīng)的其他藥物制劑均應(yīng)進(jìn)行溶血性試驗(yàn)。

本研究對(duì)咪唑苯脲注射液進(jìn)行了溶血性試驗(yàn)，結(jié)果表明咪唑苯脲注射液對(duì)受試兔紅細(xì)胞無溶血和凝聚現(xiàn)象，可供臨床注射使用。

近年來，動(dòng)物原蟲病的發(fā)病率逐年上升，部分病已呈局部流行的趨勢(shì)。因此，在畜牧養(yǎng)殖過程中，抗原蟲藥對(duì)于動(dòng)物原蟲病的預(yù)防及治療尤為重要?？乖x藥主要包括抗球蟲藥、抗錐蟲藥、抗梨形蟲藥、抗滴蟲藥四大類。抗球蟲藥主要分為三類。三嗪類的地克珠利和妥曲珠利，缺點(diǎn)為半衰期短且易產(chǎn)生耐藥性[23]。二硝基類的二硝托胺為產(chǎn)蛋期禁用的藥物；尼卡巴嗪的副作用較大，在體內(nèi)蓄積時(shí)間長，因此在長休藥期期間可復(fù)發(fā)其他疾病，甚至造成死亡[24]?；前奉愃幬锊贿m用于腎臟有疾病的畜禽，且不可長期連用；磺胺氯吡嗪的毒性較大，抗蟲譜較窄[24]。錐蟲病的主要傳播體是自然界的蜱蟲，喹嘧胺作為抗錐蟲藥物在家禽中應(yīng)用較少[24]。巴貝西蟲病經(jīng)蜱傳播，治療藥物有黃色素、貝尼爾、硫酸喹啉脲和咪唑苯脲。病牛服用黃色素后對(duì)光較敏感，強(qiáng)光照射易灼傷[25]；貝尼爾的副反應(yīng)較大[26]；使用硫酸喹啉脲需特別注意妊娠奶牛可能發(fā)生流產(chǎn)。滴蟲為單細(xì)胞原蟲，火雞、鴿子、犢牛均可感染滴蟲病?？沟蜗x的藥物甲硝唑，在一些國家只允許用作治療藥物，不允許用作添加劑長期使用[27]。

1986年，Vos A J D的研究結(jié)果表明，咪唑苯脲作為一種有效預(yù)防牛巴貝斯蟲感染的藥物，對(duì)牛痘苗的傳染性有明顯的抑制作用，是一種有效的牛分枝桿菌化療藥物[28]。2019年，Ehimiyein A M的研究結(jié)果表明，犬巴貝斯蟲引起的行為和臨床血液學(xué)損傷的實(shí)驗(yàn)感染，如口干、眼內(nèi)有分泌物、脾腫大、貧血和血小板減少癥，在聯(lián)合應(yīng)用咪唑苯脲和丙氨酸丙咪唑的情況下得到了最佳的改善，是治療犬巴貝斯蟲病的有效藥物[29]。但國內(nèi)外當(dāng)前沒有關(guān)于咪唑苯脲注射液臨床使用有關(guān)全部特殊安全性研究報(bào)告。

本研究通過豚鼠和新西蘭大白兔進(jìn)行的皮膚致敏、皮膚刺激、肌肉刺激、紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)結(jié)果表明，咪唑苯脲注射劑無皮膚刺激性、不出現(xiàn)過敏反應(yīng)(致敏率為0)、無肌肉刺激性、無溶血和凝聚作用，未對(duì)受試動(dòng)物產(chǎn)生明顯的不良影響，受試動(dòng)物未見異常行為，臨床上可以肌肉注射使用，具有良好的應(yīng)用前景。