任含柳,路美玉,段鵬,黃月輝

(華北制藥集團(tuán)動(dòng)物保健品有限責(zé)任公司，石家莊 050000)

長(zhǎng)效土霉素注射液屬四環(huán)素類抗生素，具有廣譜抗菌作用，對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、衣原體、支原體及立克次體均有效，臨床也常用于治療附紅細(xì)胞體等病，并且能夠維持較長(zhǎng)有效血藥濃度時(shí)間。其作用機(jī)制主要在于藥物可以特異性地與核糖體30S亞基的a位置結(jié)合，從而阻止氨基酰-tRNA在該位置上的聯(lián)結(jié)，進(jìn)而抑制肽鏈的增長(zhǎng)和影響細(xì)菌或其他病原微生物的蛋白質(zhì)合成。20世紀(jì)美國(guó)輝瑞制藥公司率先開(kāi)發(fā)成功長(zhǎng)效土霉素注射液，其商品名為“得米先”，上市后迅速得到普及。近些年來(lái)，我國(guó)也成功研制出了長(zhǎng)效土霉素注射液，但同國(guó)外產(chǎn)品相比仍有較大的差距，主要表現(xiàn)在穩(wěn)定性差、工藝控制難等問(wèn)題[1]，這就大大降低了國(guó)內(nèi)相關(guān)產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力[2]。為提高長(zhǎng)效土霉素注射液的緩釋作用，同時(shí)克服長(zhǎng)效土霉素注射液的穩(wěn)定性缺陷，本文通過(guò)預(yù)試驗(yàn)篩選有機(jī)復(fù)合溶劑、緩釋劑、抗氧劑、穩(wěn)定劑及pH調(diào)節(jié)劑，確定采用α-吡咯烷酮、二甲基乙酰胺、聚乙烯吡咯烷酮K30等有機(jī)溶媒，經(jīng)過(guò)特殊工藝制備，得到一種新型的長(zhǎng)效土霉素注射液。前期試驗(yàn)表明，該長(zhǎng)效土霉素注射液成本低、穩(wěn)定性好[3]。為探討該長(zhǎng)效土霉素注射液的急性毒性及刺激性，本研究分別進(jìn)行了小鼠急性毒性和家兔局部刺激性試驗(yàn)，以期為臨床應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥品 長(zhǎng)效土霉素注射液，由華北制藥集團(tuán)動(dòng)物保健品有限責(zé)任公司研發(fā)部實(shí)驗(yàn)室制備。均用滅菌生理鹽水稀釋至適宜倍數(shù)后使用。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及管理 選取60只健康昆明種小白鼠(雌雄各半)，體重為19±2 g，試驗(yàn)動(dòng)物及飼料均購(gòu)自沈陽(yáng)市雙義試驗(yàn)動(dòng)物研究所。選取27只健康成年家兔(雌雄各半)，體重為2.0～2.5 kg，試驗(yàn)動(dòng)物及飼料均購(gòu)自新疆醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 方法

1.3.1 小鼠急性毒性試驗(yàn) 試驗(yàn)實(shí)施時(shí)間為2018年9月10日至2018年9月17日，試驗(yàn)場(chǎng)地為石家莊市某大學(xué)實(shí)驗(yàn)室。隨機(jī)將60只小白鼠分為6組，每組10只，其中雌雄各半。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)初步確定出LD0和LD100分別為408.7、759.7 mg/kg，確定正式試驗(yàn)分別以408.7、462.6、523.7、592.9、671.1、759.7 mg/kg的劑量，給小白鼠按照0.1 mL/10 g進(jìn)行頸部肌肉注射。試驗(yàn)期為7 d，各組以相同日糧及飲水常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3.2 家兔局部刺激性試驗(yàn) 試驗(yàn)實(shí)施時(shí)間為2018年9月15日至2018年9月29日，試驗(yàn)場(chǎng)地為石家莊市某大學(xué)實(shí)驗(yàn)室。隨機(jī)將27只家兔分為3組，每組9只。左側(cè)股四頭肌部位剪去兔毛，用75%乙醇和2%碘酊消毒后，分別在第一組成年家兔的左側(cè)后股四頭肌處注射滅菌生理鹽水1.00 mL作對(duì)照，在第二組成年家兔的左側(cè)后股四頭肌處注射長(zhǎng)效土霉素注射液0.5 mL，在第三組成年家兔的左側(cè)后股四頭肌處注射長(zhǎng)效土霉素注射液1.00 mL。試驗(yàn)期為15 d，各組以相同日糧及飲水常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4 樣品采集及處理

1.4.1 急性毒性試驗(yàn) 小白鼠頸部肌肉注射長(zhǎng)效土霉素注射液后，觀察7 d并記錄每組臨床癥狀和死亡情況，隨機(jī)解剖5只小白鼠進(jìn)行取樣，觀察肝臟、腎臟、心臟等內(nèi)臟器官的變化情況。本試驗(yàn)采用改良寇氏法[4]。按照毒理學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)定。

1.4.2 刺激性試驗(yàn) 成熟家兔注射后，每組分別于給藥后2、7、15 d各處死3只，解剖后取股四頭肌，縱向切開(kāi)。觀察注射部位肌肉組織的變化。

本試驗(yàn)采用成年家兔股四頭肌法。按照肌肉組織刺激反應(yīng)的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行評(píng)定， 0級(jí)刺激反應(yīng)，給藥部位無(wú)明顯反應(yīng)；1級(jí)刺激反應(yīng)，給藥部位輕度充血，直徑0.5 cm以下；2級(jí)刺激反應(yīng)，給藥部位中度充血，直徑1.0 cm以下；3級(jí)刺激反應(yīng)，給藥部位中度充血，紅腫，肌肉有變性；4級(jí)刺激反應(yīng)，出現(xiàn)肌肉褐色變性，壞死0.5 cm以下；5級(jí)刺激反應(yīng)，肌肉嚴(yán)重變性，出現(xiàn)大片壞死。

1.5 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17軟件進(jìn)行One-Way ANOVA 方差分析，并用 Duncan 法進(jìn)行多重比較，以P<0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性試驗(yàn) 結(jié)果如表1所示。

表1 長(zhǎng)效土霉素注射液急性毒性試驗(yàn)小白鼠死亡數(shù)(n=10)

由表1 可知，試驗(yàn)小白鼠共6組，每組10只。6組小白鼠給藥劑量分別為408.7、462.6、523.7、592.9、671.1、759.7 mg/kg，觀察7 d后，各組死亡數(shù)(死亡率)分別為0只(0%)、2只(20%)、3只(30%)、4只(40%)、6只(60%)、9只(90%)。隨著給藥劑量的增大，小白鼠死亡數(shù)量逐漸增多。

表2 長(zhǎng)效土霉素注射液急性毒性試驗(yàn)

LD50為半數(shù)致死量

由表2可知，該新型長(zhǎng)效土霉素注射液的LD50為600.32 mg/kg，LD50的95%的可信區(qū)間為(600.32±2.44)mg/kg。

2.2 局部刺激試驗(yàn) 眼觀給藥后2、7、15 d，頸部注射部位無(wú)腫脹，觸摸無(wú)硬結(jié)。由表3可知，剖殺后取股四頭肌，對(duì)注射部位肌肉組織的刺激性反應(yīng)分級(jí)。注射滅菌生理鹽水的家兔肌肉組織與正常肌肉組織相同；注射長(zhǎng)效土霉素2 d后，注射部位出現(xiàn)充血、紅腫等刺激性反應(yīng)癥狀；隨著時(shí)間延長(zhǎng)和給藥劑量增加，刺激性增強(qiáng)，注射長(zhǎng)效土霉素7 d后家兔股四頭肌出現(xiàn)紅腫、發(fā)紫、壞死、光澤消失現(xiàn)象，15 d后肌肉組織的壞死范圍擴(kuò)大。

表3 長(zhǎng)效土霉素注射液家兔股四頭肌刺激試驗(yàn)結(jié)果

“+”為有刺激性，數(shù)量越多刺激性越大；“-”為無(wú)刺激性。

3 討論與結(jié)論

由于長(zhǎng)效土霉素注射液的臨床用法是肌肉注射給藥，而安全性評(píng)價(jià)的指標(biāo)又是以劑型為依據(jù)進(jìn)行選擇的。因此，選擇了急性毒性試驗(yàn)和局部刺激性試驗(yàn)作為安全性評(píng)價(jià)指標(biāo)。根據(jù)參考土霉素過(guò)量使用對(duì)肝臟、腎臟所造成的毒副作用的資料[6]，小白鼠會(huì)出現(xiàn)食欲減退、精神沉郁和運(yùn)動(dòng)失調(diào)；肝臟腫大，呈黃褐色，有出血點(diǎn)，易碎有油膩感；腎臟腫大，有出血點(diǎn)，易碎；部分小白鼠心臟稍有腫大，產(chǎn)生心包積液等癥狀。劉偉[7]等試驗(yàn)研究表明，給小鼠以465.2 mg/kg劑量注射長(zhǎng)效土霉素注射液時(shí)，小鼠出現(xiàn)精神沉郁、被毛粗糙、嗜睡等癥狀，對(duì)小鼠進(jìn)行剖檢，發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟腫大，呈黃褐色；腎臟腫大，有出血點(diǎn)；部分小鼠出現(xiàn)心臟稍有腫大，產(chǎn)生心包積液。在本試驗(yàn)中，給小白鼠注射新型長(zhǎng)效土霉素注射液的劑量為462.6 mg/kg時(shí)，同樣出現(xiàn)以上相類似的病發(fā)癥狀。且隨著給藥劑量的增大，癥狀越明顯。因此，這表明致小鼠死亡的主要原因?yàn)橥撩顾厥褂眠^(guò)量。

根據(jù)毒理學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，藥物L(fēng)D50在500～5000 mg/kg為低毒。季進(jìn)英[8]等利用小白鼠檢測(cè)一種長(zhǎng)效土霉素注射液的急性毒性試驗(yàn)中，測(cè)得LD50為594.58 mg/kg，LD50的95%的可信限是594.58±2.22 mg/kg。根據(jù)毒理學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)其將長(zhǎng)效土霉素注射液定為低毒。而本試驗(yàn)測(cè)得新型長(zhǎng)效土霉素注射液的LD50為600.32 mg/kg，LD50的95%的可信區(qū)間為(600.32±2.44)mg/kg。同樣在低毒范圍內(nèi)，該結(jié)果與資料試驗(yàn)所得結(jié)果一致。且該新型長(zhǎng)效土霉素注射液的LD50偏高，說(shuō)明相同致死率，該新型長(zhǎng)效土霉素注射液需用更高的劑量，由此證明該新型長(zhǎng)效土霉素注射液的處方工藝更優(yōu)異，藥品的急性毒性更小。

季進(jìn)英[8]等利用家兔檢測(cè)長(zhǎng)效土霉素注射液的局部刺激性試驗(yàn)中，給藥2、7、15 d后，眼觀無(wú)腫脹，手摸注射部位無(wú)硬結(jié)，解剖發(fā)現(xiàn)2 d后肌肉組織出現(xiàn)充血、紅腫現(xiàn)象；7 d后肌肉組織出現(xiàn)發(fā)紫、壞死；15 d后肌肉組織壞死范圍擴(kuò)大。根據(jù)家兔股四頭肌刺激反應(yīng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容，由此判斷長(zhǎng)效土霉素注射液對(duì)家兔具有局部刺激性。在本次試驗(yàn)的給藥劑量條件下，表明該藥對(duì)肌肉組織有一定程度的刺激性，這與目前有關(guān)長(zhǎng)效土霉素注射液具有局部刺激作用的報(bào)道一致[9-10]。

該新型長(zhǎng)效土霉素注射液對(duì)小白鼠表現(xiàn)為低毒性，對(duì)家兔肌肉組織有一定程度的刺激性。