董玲玲，于曉輝，楊星，馬秋冉，趙富華，汪霞

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

近年來，獸藥中非法添加喹乙醇、乙酰甲喹的現(xiàn)象仍有發(fā)生，喹乙醇是一種抗菌促生長劑，乙酰甲喹是廣譜抗菌藥[1]，非法添加不僅擾亂了獸藥市場(chǎng)，也為動(dòng)物源性食品安全埋下隱患。針對(duì)發(fā)現(xiàn)的問題，以12種獸藥制劑為基礎(chǔ)，建立獸藥中非法添加喹乙醇、乙酰甲喹的檢查方法。現(xiàn)在獸藥中喹乙醇、乙酰甲喹的法定檢查方法有4個(gè)[2-3]，均為高效液相色譜法[4-5]。此外還有文獻(xiàn)報(bào)道的液相方法及液質(zhì)聯(lián)用方法[6-8]?，F(xiàn)有方法的適用范圍有交叉，流動(dòng)相條件各不相同，曾出現(xiàn)乙酰甲喹與標(biāo)稱物質(zhì)完全共流出而導(dǎo)致假陰性的結(jié)果，差點(diǎn)發(fā)生誤判。為確保方法科學(xué)合理有效，有必要將同種類非法添加物的檢查方法進(jìn)行整合優(yōu)化。因此，本文建立了獸藥中非法添加喹乙醇、乙酰甲喹的通用檢查方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀(Waters 2695，PDA，Empower2色譜工作站軟件)；分析天平(十萬分之一)； MiliQ純水機(jī)；磷酸二氫鉀、乙腈為色譜純。

1.2 試藥 對(duì)照品：喹乙醇(H0061407)、乙酰甲喹(H0111008)、恩諾沙星(H0081505)、乳酸環(huán)丙沙星(H0141706)、氧氟沙星(H0090912)、諾氟沙星(H0071305)、硫酸黏菌素(K0271305)，所有對(duì)照品均來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；供試品(空白)包括白頭翁散、黃連解毒散、止痢散、銀翹散、健胃散、清熱散、清瘟敗毒散、肥豬散、恩諾沙星可溶性粉、乳酸環(huán)丙沙星注射液、硫酸黏菌素預(yù)混劑及硫酸黏菌素可溶性粉均為市售合格樣品，不含喹乙醇和乙酰甲喹；非法添加供試品(模擬)：取供試品(空白)，按2.5%添加喹乙醇或乙酰甲喹，混勻。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫；二極管陣列檢測(cè)器，采集波長范圍為200 nm～400 nm，分辨率為1.2 nm；記錄365 nm波長處的色譜圖。喹乙醇和乙酰甲喹峰間分離度應(yīng)符合要求，并應(yīng)與其他峰完全分離。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表

2.2 溶液配制

2.2.1 供試品溶液和對(duì)照品溶液 取供試品1.0 g(mL)，置50 mL量瓶中，加90%乙腈溶液適量，超聲處理15 min后，冷卻至室溫，用90%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，過濾，作為供試品母液。取母液1.0 mL，加10%乙腈溶液稀釋至10.0 mL，搖勻，作為供試品溶液。另取喹乙醇和乙酰甲喹對(duì)照品各約25 mg，同法制備得對(duì)照品母液和對(duì)照品溶液。

2.2.2 系統(tǒng)適用性溶液 6種對(duì)照品混合溶液：取喹乙醇、乙酰甲喹、氧氟沙星、諾氟沙星、乳酸環(huán)丙沙星和恩諾沙星6種對(duì)照品各約25 mg，置同一50 mL量瓶中，照2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液配制方法制備。白頭翁散陽性樣品溶液：取白頭翁散陽性添加樣品照2.2.1項(xiàng)下供試品溶液配制方法制備。以上述兩種溶液作為系統(tǒng)適用性考察溶液。

2.2.3 供試品空白溶液 稱取(量取)無非法添加的供試品1.0 g(mL)，照2.2.1項(xiàng)下操作制備成供試品空白溶液。

2.2.4 建立光譜數(shù)據(jù)庫的溶液 以喹乙醇、乙酰甲喹對(duì)照品溶液(0.05 mg/mL)作為建立光譜數(shù)據(jù)庫的溶液。

出峰順序依次為喹乙醇、乙酰甲喹、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星The order of peak outlet is Olaquindox, Mequindox, ofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin and enrofloxacin

2.3 峰純度檢查 對(duì)供試品溶液色譜圖中喹乙醇和乙酰甲喹色譜峰進(jìn)行峰純度檢查，結(jié)果顯示12種獸藥制劑中喹乙醇峰與乙酰甲喹峰的純度角度均小于純度閾值，表明在此液相條件下，12種獸藥制劑中喹乙醇或乙酰甲喹的出峰處無其他干擾峰，方法可行。

2.4 光譜相似度檢查 對(duì)供試品溶液中喹乙醇、乙酰甲喹峰的光譜圖與光譜庫進(jìn)行匹配，匹配角度均小于匹配閾值，表明非法添加供試品溶液中相應(yīng)色譜峰的光譜與喹乙醇、乙酰甲喹對(duì)照品的光譜非常相似，可認(rèn)為是同一物質(zhì)。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性 專屬性檢查溶液配制：取供試品空白母液和混合對(duì)照品母液各1.0 mL，加10%乙腈溶液稀釋至10.0 mL，搖勻，即得供試品陽性添加溶液。以供試品空白溶液、溶劑空白和供試品陽性添加溶液作為專屬性考察的溶液。

按擬定方法檢查，對(duì)比12種供試品空白溶液與專屬性檢查溶液的色譜光譜圖，結(jié)果顯示供試品空白對(duì)于被測(cè)物無干擾。另外峰純度檢查結(jié)果也顯示在擬定液相條件下，被測(cè)物喹乙醇、乙酰甲喹均為單一物質(zhì)峰。12種獸藥制劑中，白頭翁散空白溶液在此檢測(cè)條件下出峰最多，因此，以白頭翁散專屬性結(jié)果作為獸藥制劑專屬性考察結(jié)果的代表，結(jié)果見圖2。

A: 喹乙醇、乙酰甲喹混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液; B: 白頭翁散空白溶液; C: 白頭翁散陽性添加溶液

2.5.2 耐用性 耐用性考察的溶液配制：白頭翁散空白溶液在此檢查條件下出峰最多，因此以6種對(duì)照品混合溶液和白頭翁散陽性樣品溶液作為耐用性考察的溶液。配制過程同系統(tǒng)適用性溶液。

從柱溫、流速、色譜柱三個(gè)方面考察方法的耐用性。調(diào)節(jié)柱溫為30±2 ℃，結(jié)果顯示：喹乙醇保留時(shí)間受柱溫影響較小，基本不變，乙酰甲喹隨柱溫升高，保留時(shí)間提前，與其它物質(zhì)峰均能實(shí)現(xiàn)良好分離。調(diào)節(jié)流速值為1.0±0.1 mL/min，結(jié)果顯示：隨流動(dòng)相流速的增大，喹乙醇、乙酰甲喹保留時(shí)間提前，不同流速下分離度均大于1.5。選擇4款不同品牌色譜柱，考察不同色譜柱對(duì)測(cè)定的影響，表2結(jié)果顯示4種品牌色譜柱均可用于該檢查，方法耐用性較好。

表2 4種色譜柱耐用性考察結(jié)果表

*分離度指喹乙醇、乙酰甲喹與其它物質(zhì)峰的分離度

2.5.3 檢測(cè)限 檢測(cè)限溶液配制：取供試品空白母液1.0 mL，分別精密加入喹乙醇對(duì)照品溶液(0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL)和乙酰甲喹對(duì)照品溶液(0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL)，加10%乙腈溶液稀釋至10.0 mL，搖勻，配制成系列溶液。以光譜圖失真的最大濃度作為方法的檢測(cè)限，12種獸藥制劑中喹乙醇和乙酰甲喹檢測(cè)限均為1.0 g/kg(L)，具體結(jié)果見圖3～14。

圖3 白頭翁散檢測(cè)限結(jié)果圖

圖4 止痢散檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果圖

圖5 肥豬散檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果圖

圖6 黃連解毒散檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果圖

圖7 健胃散檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果圖

圖8 清熱散檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果圖

圖9 清瘟敗毒散檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果圖

圖10 銀翹散檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果圖

圖11 硫酸黏菌素預(yù)混劑檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果圖

圖12 硫酸黏菌素可溶性粉檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果圖

圖13 乳酸環(huán)丙沙星注射液檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果圖

2.5.4 準(zhǔn)確度 本方法以12種獸藥制劑空白加被測(cè)物對(duì)照品做回收率試驗(yàn)來考察方法的準(zhǔn)確度。稱取(量取)無非法添加的供試品1.0 g(1.0 mL)，另取喹乙醇和乙酰甲喹對(duì)照品各約25 mg，精密稱定，置同一50 mL量瓶中，照2.2.1項(xiàng)下供試品溶液配制方法制備。平行配制6份。每份回收率試驗(yàn)溶液平行測(cè)定2次，按外標(biāo)法計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。12種獸藥制劑中喹乙醇的平均回收率為96.6%～101.4%，平均RSD為0.2%～1.3%；乙酰甲喹的平均回收率為98.0%～101.3%，平均RSD為0.2%～1.4%。

表4 回收率結(jié)果表

續(xù)表

3 討論與結(jié)論

3.1 流動(dòng)相的選擇 在現(xiàn)有檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上選擇乙腈和0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液作為流動(dòng)相的有機(jī)相和水相，同時(shí)為保證所有獸藥制劑中強(qiáng)保留成分的完全洗脫，將洗脫條件改進(jìn)為梯度洗脫。且經(jīng)過考察發(fā)現(xiàn)：流動(dòng)相pH值對(duì)檢查的目標(biāo)物喹乙醇和乙酰甲喹的分離沒有影響，對(duì)二者的光譜圖亦無影響，調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值僅能改善喹諾酮類獸藥制劑主成分的分離和峰形。因此，本檢查方法不調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值。最終確立的流動(dòng)相配制方法簡(jiǎn)便，完全能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的有效分離分析。

3.2 提取條件的選擇 根據(jù)喹乙醇和乙酰甲喹的溶解性，同時(shí)考慮到盡量少引入獸藥制劑中的組分，參考中獸藥散劑中非法添加乙酰甲喹、喹乙醇檢查方法[2]，選擇高濃度乙腈溶液作為提取溶劑。考察超聲和磁力攪拌兩種提取方式，結(jié)果顯示超聲的效果優(yōu)于磁力攪拌。考察不同超聲時(shí)間(5 min、10 min、15min、20 min)對(duì)喹乙醇、乙酰甲喹以及獸藥制劑組分提取效率的影響，結(jié)果顯示超聲15 min時(shí)乙酰甲喹、喹乙醇的提取完全，且獸藥制劑尤其是中獸藥中的干擾相對(duì)較小。最終確定90%乙腈為提取溶劑，超聲15 min。而初始流動(dòng)相為低比例有機(jī)相，提取溶劑與初始流動(dòng)相的差別較大，容易引起喹乙醇色譜峰的分叉，因此，第二次稀釋的溶液選擇10%乙腈溶液，與初始流動(dòng)相比例保持一致，有效解決了色譜峰分叉的問題。

3.3 提取波長的選擇 喹乙醇最大吸收波長為259.5 nm、357.2 nm和376.2 nm；乙酰甲喹最大吸收波長為239.4 nm、254.8 nm和364.1 nm。雖然在高波長處，喹乙醇和乙酰甲喹的響應(yīng)值低于低波長處，但考慮到在低波長處易受獸藥制劑中其它組分的干擾，因此，兼顧?quán)掖己鸵阴＜奏⒖棘F(xiàn)有農(nóng)業(yè)部公告方法，選擇365 nm作為提取波長。

本文建立了HPLC-PDA測(cè)定獸藥制劑中非法添加喹乙醇和乙酰甲喹的通用檢查方法，結(jié)合保留時(shí)間和紫外光譜特征兩方面信息，以及峰純度檢查和光譜相似度檢查結(jié)果，確保檢查結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。同時(shí)，本方法是在現(xiàn)有眾多方法基礎(chǔ)上的優(yōu)化，簡(jiǎn)化流動(dòng)相的配制，解決質(zhì)譜檢查方法空白本底干擾的難題[7-8]，同時(shí)擴(kuò)大了檢查的范圍，真正實(shí)現(xiàn)獸藥中非法添加喹乙醇和乙酰甲喹的高效、準(zhǔn)確識(shí)別，為有力打擊非法添加違法行為提供技術(shù)支撐。