姜淋潔，崔志剛，楊 雪，婁艷華，甄盼盼，程雪嬌

(天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司，天津300080)

烯丙孕素(Altrenogest)是一種人工合成的甾類促孕激素，屬于19-去甲睪酮類化合物[1-2]，它可憑借其脂溶性穿透靶細(xì)胞，與特定受體結(jié)合[3-5]。烯丙孕素已被歐盟和美國批準(zhǔn)用于母豬和母馬的同步發(fā)情，由其制成的口服液已成功上市。在我國獸醫(yī)臨床中，烯丙孕素口服液可用于母豬的同期發(fā)情、促進(jìn)乏情母豬的發(fā)情[6-8]。但對于烯丙孕素口服液的質(zhì)量控制，目前還沒有相關(guān)的研究報道，本研究建立烯丙孕素口服液中烯丙孕素的含量液相方法檢測方法，為烯丙孕素口服液的質(zhì)量控制研究提供技術(shù)支撐。中國獸藥典中性激素類藥物如丙酸睪酮注射液采用乙醚溶解、甲醇提取后用高效液相色譜法測定丙酸睪酮的含量[9]，操作步驟繁瑣且對浪費(fèi)大量有機(jī)溶劑。本研究對前處理方法進(jìn)行改進(jìn)，采用高效液相色譜法對烯丙孕素進(jìn)行定性和定量檢測，方法經(jīng)濟(jì)快速，可以滿足日常檢測需求。

1 材料與方法

1.1 儀器 安捷倫1260 II 高效液相色譜儀包括包括G7111A四元泵，G7129A自動進(jìn)樣器，AT-330柱溫箱，G7115A DAD檢測器，C.01.07 SR2(255)色譜工作站，美國安捷倫科技有限公司；ES225SM-DR電子天平，普利賽斯儀器有限公司；超聲波清洗器，昆山儀器有限公司；真空泵，ASL儀器有限公司。

1.2 藥品與試劑 烯丙孕素對照品(批號1708001，含量99.95%，天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司)，烯丙孕素口服液(批號：1709001，天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司)，正己烷(色譜純，西隴化工科技有限公司)，異丙醇(色譜純，西隴化工科技有限公司)。

1.3 色譜條件 以氰基鍵合硅烷為填充劑的Zorbax CN色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；以正己烷-異丙醇(98∶2)為流動相；檢測波長為235 nm；流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品溶液制備 精密稱取烯丙孕素口服液適量(約相當(dāng)于烯丙孕素12.5 mg)，置25 mL棕色量瓶中，加異丙醇5 mL，超聲3 min使溶解，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另取烯丙孕素對照品約25.0 mg，精密稱定，置50 mL棕色量瓶中，加異丙醇5 mL溶解后，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 按照2.1項方法操作，配制1份對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果顯示，主峰峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.21%，主峰保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.60%，主峰的理論塔板數(shù)都在15000以上。結(jié)果見表1，色譜圖見圖1。系統(tǒng)適應(yīng)性試驗表明該色譜條件可以滿足分析要求。

表1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗結(jié)果

圖1 烯丙孕素對照品色譜圖

2.3 專屬性試驗 按照烯丙孕素口服液處方量配制空白制劑樣品，按2.1項中制備方法制成陰性對照溶液；另取烯丙孕素口服液按2.1項中制備方法制成供試品溶液；另稱取適量烯丙孕素對照品，按2.1項中制備方法制成對照品溶液。按1.3項的色譜條件分別進(jìn)陰性對照、供試品溶液和對照品溶液，色譜圖見圖2，結(jié)果表明輔料成分不干擾樣品中烯丙孕素的測定。

圖2 專屬性試驗色譜圖(A、B、C 分別為對照品、供試品、陰性對照)

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密稱取適量烯丙孕素對照品至50 mL容量瓶中，制成0.401、0.451、0.503、0.551、0.601 mg/mL的對照品溶液，按照1.3項色譜條件進(jìn)樣記錄峰面積，以峰面積對進(jìn)樣濃度作線性回歸，方程為y=8551.6x+101.78 (R=0.9998，n=5)，表明烯丙孕素對照品溶液濃度在0.401～0.601 mg/mL范圍內(nèi)時與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 回收率試驗 按照烯丙孕素口服液處方分別配制9份50 mL空白制劑，然后加入主藥烯丙孕素處方量的80%(0.16 g)、100%(0.2 g)、120%(0.25 g)(每個濃度各3份)制備9份回收率樣品溶液，按2.1項中制備方法制成供試品溶液；另稱取適量烯丙孕素對照品，按2.1項中制備方法制成對照品溶液。按照1.3項色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。計算樣品的回收率，結(jié)果見表2。

2.6 精密度試驗 按照2.1項方法操作，配制6份相同濃度(0.5 mg/mL)的烯丙孕素口服液樣品溶液和1份烯丙孕素對照品溶液。按照1.3項色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖見圖3。計算樣品中烯丙孕素的含量，結(jié)果見表3。

表2 烯丙孕素口服液中烯丙孕素的回收率(%)

表3 烯丙孕素口服液含量測定精密度試驗結(jié)果

圖3 精密度試驗色譜圖(A、B 分別為對照品、供試品)

2.7 定量限試驗 取烯丙孕素對照品約25 mg適量置于50 mL容量瓶中，按2.2項方法操作，得到濃度約為0.5 mg/mL的溶液，然后用正己烷逐步稀釋至濃度為804.9 ng/mL，連續(xù)測試6次，信噪比平均為10.2，因此，烯丙孕素定量限為804.9 ng/mL。

3 討論與結(jié)論

關(guān)于烯丙孕素在動物組織樣品中的殘留檢測國內(nèi)外有很多報道，Elin Beckman等[10]利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定烯丙孕素和它的代謝物在馬尿液中的殘留水平。Martina Rejtharova等報道了利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定烯丙孕素等六種孕激素在腎臟脂肪中的殘留水平[11]。Dan Zhang等利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定烯丙孕素等在豬肉中的殘留水平[12]。Machnik等利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定烯丙孕素在馬血漿和馬尿液中殘留水平[13]?？岛幍冉⒘撕与圄~、鰻魚及烤鰻中烯丙孕素與氯地孕酮?dú)埩舻耐瑫r測定的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14]。林黎明等建立了進(jìn)出口動物源性食品中孕激素類藥物殘留量的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法[15]。邵兵等建立了動物源食品中激素多殘留檢測方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[16]。賀利民等建立了動物源食品中11種激素殘留檢測液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[17]。這些研究者都是將烯丙孕素從組織樣品中提取出來，然后運(yùn)用液質(zhì)等手段對烯丙孕素進(jìn)行定量測定，操作過程繁瑣且對設(shè)備要求比較高。本文建立的烯丙孕素口服液中烯丙孕素的含量測定方法，著重對前處理方法和色譜系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)，以期為企業(yè)實際生產(chǎn)中烯丙孕素制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

3.1 樣品前處理方法的選擇 烯丙孕素易溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑，難溶于水，其在花生油、大豆油等植物油中有較大溶解度，故烯丙孕素口服液常用植物油作為載體輔料。當(dāng)制劑樣品以植物油作為載體輔料進(jìn)行含量測定時，須先將主藥成分提取出來再進(jìn)行測試，如用乙醚溶解后再用甲醇多次提取[9]，不僅需要經(jīng)過繁瑣的步驟，還耗費(fèi)大量的有機(jī)溶劑，而且處理過程過多會造成樣品損耗，進(jìn)而導(dǎo)致測量誤差。本研究中采用異丙醇-正己烷(5/20)作為混合溶劑，不但能將主藥成分和輔料載體完全溶解，而且操作簡單便于控制，避免了復(fù)雜的前處理步驟。

3.2 色譜系統(tǒng)的選擇 傳統(tǒng)的液相色譜系統(tǒng)常用非極性物質(zhì)(如C18)作為固定相，以甲醇/水或者乙腈/水這些極性大的溶劑作為流動相進(jìn)行洗脫。在本研究中由于樣品前處理過程中用到異丙醇-正己烷(5/20)作為混合溶劑，混合溶劑的極性比較小，須選用極性大的物質(zhì)(如氰基鍵合硅膠)為固定相、極性小的物質(zhì)(如正己烷-異丙醇混合體系)為流動相的正相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分析。

本方法測定烯丙孕素口服液中烯丙孕素的含量，無需復(fù)雜的樣品處理和特殊試劑，測定方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、試劑成本低，便于生產(chǎn)中的質(zhì)量檢測。