宋曉娟，盧曉瑩，曾唯雅，伍銘坤，莊偉權(quán)，嚴(yán)萍，詹若挺

[廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心、嶺南中藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣州中醫(yī)藥大學(xué))、國家中成藥工程技術(shù)研究中心南藥研發(fā)實(shí)驗(yàn)室、廣東省教育廳重點(diǎn)提升平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目—嶺南中藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006]

涼粉草(MesonachinensisBenth.)又名仙草、仙人草、仙人凍、薪草[1]等，為唇形科(Laiatae)涼粉草屬(M.esona B1.)植物涼粉草(MesonachinensisBenth.)的干燥地上部分，其味甘、淡，性寒涼。具有清熱利濕、涼血解暑作用，用于中暑、糖尿病、高血壓、急性腎炎、風(fēng)火牙痛、丹毒、梅毒、黃疽[2]等癥的治療。作為藥食兩用植物資源，涼粉草具有很高營養(yǎng)價(jià)值和潛在醫(yī)療保健作用，其主要成分是黃酮、酚酸和多糖(涼粉草膠)等[3]，具有抗氧化、降血糖、降血脂、降血壓、抗病毒、抗缺氧等生物活性[4]。國內(nèi)涼粉草資源豐富，價(jià)格低廉，有廣闊的開發(fā)利用前景[5]。α-葡萄糖苷酶在人體糖代謝過程中發(fā)揮著重要作用，α-葡萄糖苷酶抑制劑可以降低酶活性，減緩碳水化合物分解，從而降低血糖[6]。體外降血糖活性多采用以對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl α-D-glucopyra-noside，PNPG)為底物的酶抑制劑篩選模型來衡量物質(zhì)對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性[7]。酚類化合物是一類活性較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制劑[8]，但酚類化合物結(jié)構(gòu)多樣，不同結(jié)構(gòu)酚類化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性及作用機(jī)制存在顯著差異[9]。涼粉草具有較好的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值及經(jīng)濟(jì)效益，但其資源尚未被系統(tǒng)開發(fā)，目前關(guān)于涼粉草抗氧化活性及對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究筆者鮮見報(bào)道。筆者在本研究采用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、水飽和正丁醇等有機(jī)溶劑對(duì)涼粉草乙醇提取物進(jìn)行萃取，并分析不同極性部位抗氧化活性及對(duì)α-葡糖苷酶的抑制作用，以確定其抗氧化效果及對(duì)α-葡糖苷酶抑制作用最佳部位，為進(jìn)一步研究與開發(fā)該植物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試藥 涼粉草藥材(產(chǎn)地：廣東省平遠(yuǎn)縣上舉鎮(zhèn)，批號(hào)：20140908)，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心詹若挺研究員鑒定為唇形科涼粉草屬植物涼粉草的全草。1，1-二苯基-2苦基肼(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)：1898-66-4)自由基；2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽[2，2′-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diamm- onium salt，ABTS，美國Sigma公司，批號(hào)：30931-67-0]自由基；2，4，6-三(2-吡啶基)三嗪(2，4，6-tripyridin-2-yl-1，3，5-triazine，TPTZ，美國Sigma公司，批號(hào)：3682-35-7)；維生素C(vitamin C，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：170120)；α-葡萄糖苷酶(S10050)、阿卡波糖(批號(hào)：S11190)、PNPG(批號(hào)：S10137)均購自上海源葉生物科技有限公司；沒食子酸(Dr.Mao，批號(hào)：TN01365)；酒石酸鉀鈉(批號(hào)：I1529064)、氯化鐵(批號(hào)：L1504033)、醋酸鈉(批號(hào)：J1523067)、過硫酸鈉(批號(hào)：S106861)均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；本實(shí)驗(yàn)所用分析純無水乙醇(批號(hào)：20180301)、95%乙醇(批號(hào)：20151106)、石油醚(批號(hào)：20170820)、三氯甲烷(批號(hào)：20171105)、乙酸乙酯(批號(hào)：20150911)、正丁醇(批號(hào)：20170410)均購自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2試劑的配制 DPPH溶液：稱取DPPH適量，用95%乙醇溶解配制得20 mmol·L-1DPPH溶液。ABTS工作液：ABTS儲(chǔ)備液(取ABTS 8.16 mg，加純化水2 mL，得ABTS儲(chǔ)備液)與K2S2O8儲(chǔ)備液(取K2S2O81.4 mg，加純化水2 mL，即得K2S2O8儲(chǔ)備液)各1 mL，混合均勻，避光處放置12 h；臨用前用95%乙醇稀釋，使得其吸光度值在734 nm處為0.700±0.005。鐵離子抗氧化能力(ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP)工作液：取20 mmol·L-1FeCl3溶液，10 mmol·L-1TPTZ溶液，0.3 mol·L-1醋酸鈉緩沖鹽溶液混合，比例為1：1：10，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3儀器 1702276E酶標(biāo)儀(美國BioTek 公司)；Alpha 2-4 LDplus真空冷凍干燥機(jī)(德國Christ公司)；BS224S電子天平(德國Sartorius公司，感量：0.1 mg)；XR205SM-DR天平(瑞士Precisa公司，感量：0.01 mg)；Milli-Q Synthesis純水/超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；KQ5200DE超聲波提取儀(昆山市超聲儀器有限公司)；HWS28電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；DZF-6050B電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；R1001N旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)公司)；紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司)。

1.4涼粉草提取物的制備 取涼粉草干燥細(xì)粉，加50倍量50%乙醇回流提取2次，每次30 min，過濾，合并濾液，使用旋蒸儀減壓濃縮，至有機(jī)溶劑完全揮發(fā)。轉(zhuǎn)入分液漏斗，加入一定量石油醚，振搖，靜置，待溶液完全分層后，取下層水溶液，保留上層石油醚部，下層水溶液同法再萃取，將2次石油醚萃取液合并，減壓濃縮后真空冷凍干燥，得石油醚部位。依次用三氯甲烷、乙酸乙酯、水飽和正丁醇按照相同方法萃取。萃取后的剩余水溶液，減壓濃縮后真空冷凍干燥。最后得到石油醚部位、三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位這5種涼粉草不同極性部位提取物。同時(shí)將50%醇提物減壓濃縮，真空冷凍干燥，得醇提物部位。

稱取涼粉草不同部位提取物，分別置經(jīng)干燥的10 mL量瓶，加入50%乙醇溶解并稀釋至刻度，制備1 mg·mL-1溶液，備用。臨用時(shí)分別將各樣品溶液稀釋成5，10，20，40，80，160，320，500 μg·mL-1。

1.5抗氧化活性的測定

1.5.1對(duì)DPPH自由基的清除作用 取上述不同濃度待測樣品與DPPH溶液各100 μL，先后加入96孔板，震蕩均勻，置室溫避光反應(yīng)20 min，酶標(biāo)儀在517 nm波長處測定吸光度值。以維生素C為陽性對(duì)照藥，以50%乙醇為空白調(diào)零。每份樣品平行測定3次，計(jì)算樣品對(duì)DPPH自由基清除率及半數(shù)抑制率(IC50)值。清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100%。A1表示DPPH溶液與樣品溶液混合液吸光度值，A2表示樣品溶液與空白溶劑混合液吸光度值，A3表示DPPH溶液與空白溶劑混合液吸光度值。

1.5.2對(duì)ABTS自由基的清除作用 取上述不同濃度待測樣品40 μL與ABTS工作液160 μL置96孔板，震蕩均勻，避光反應(yīng)6 min，酶標(biāo)儀在734 nm波長處測定吸光度值。以維生素C為陽性對(duì)照藥，以50%乙醇為空白調(diào)零。每份樣品平行測定3次，計(jì)算樣品對(duì)ABTS自由基清除率及IC50值，方法同“1.5.1”項(xiàng)。

1.5.3FRAP值的測定 將待測樣品各部位提取物配制到相同且合適濃度，取樣品液20 μL與FRAP工作液180 μL置96孔板，震蕩均勻，37 ℃恒溫箱保溫20 min，740 nm波長處測定吸光度值，每份樣品平行測定3次，計(jì)算FRAP值。配制80，120，160，200，240，280 μg·mL-1FeSO4溶液，以FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品抗氧化能力以 FRAP 值表示：1FRAP單位=1 μg·mL-1FeSO4，即樣品抗氧化能力相當(dāng)于FeSO4的μg·mL-1數(shù)。

1.6對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用[10]將不同極性部位提取物稀釋成一系列合適濃度待測樣品(濃度為0.1，0.25，0.5，1，2，4 mg·mL-1)，按表1加入各試劑，加入 pH值6.8的磷酸鹽緩沖液 112 μL，加入 0.2 U·mL-1α-葡萄糖苷酶20 μL，抑制劑8 μL(待測樣品溶液)，混勻，37 ℃下保溫10 min。 加入 PNPG20 μL，混勻，37 ℃下保溫 10 min，再加入0.2 mol·L-1Na2CO3水溶液80 μL，405 nm波長下測定吸光度，平行測定3份，根據(jù)公式計(jì)算抑制率。本實(shí)驗(yàn)以阿卡波糖作為陽性對(duì)照。

表1 α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)各試劑加入量

Table.1Dosageofeachreagentinα-glucosidaseinhibitionexperiment

μL

樣品抑制作用計(jì)算公式：抑制率(%)=[1-(B-b)/(A-a)]×100%。

Calculation formula for sample inhibition: inhibition rate %=[1-(B-b)/(A-a)]×100%.

1.7多酚的含量測定 參考文獻(xiàn)[11]中酒石酸法測定多酚，精密移取供試品溶液1 mL，置20 mL量瓶，加入純化水3 mL，搖勻，加入酒石酸亞鐵溶液5 mL，搖勻，加入pH值7.5磷酸鹽緩沖液至刻度，搖勻后靜置10 min，在波長535 nm處掃描測定。

2 結(jié)果

2.1抗氧化活性

2.1.1清除DPPH自由基測定結(jié)果 結(jié)果見圖1。維生素C對(duì)DPPH自由基清除作用隨著濃度增加呈上升趨勢，存在較好量效關(guān)系。不同極性部位隨著濃度的增加，其DPPH自由基清除作用也不斷增加，且乙酸乙酯部位對(duì)DPPH自由基清除能力明顯高于其他部位。維生素C及涼粉草不同部位提取物對(duì)DPPH清除能力強(qiáng)弱為：維生素C>乙酸乙酯部位>正丁醇部位>醇提部位>水部位>三氯甲烷部位>石油醚部位。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，濃度為5，10，20，40 μg·mL-1時(shí)，維生素C較乙酸乙酯部位差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，當(dāng)樣品濃度為80 μg·mL-1時(shí)，乙酸乙酯部位和同濃度維生素C清除率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同濃度乙酸乙酯部位較水部位、三氯甲烷部位和石油醚部位差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，當(dāng)樣品濃度為10，20，40，80，160 μg·mL-1時(shí)，乙酸乙酯部位與正丁醇部位和醇提部位差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.1.2清除ABTS自由基測定結(jié)果 結(jié)果見圖2。維生素C對(duì)ABTS自由基清除作用隨濃度增加呈上升趨勢，存在較好量效關(guān)系。不同極性部位對(duì)ABTS自由基清除能力隨樣品濃度增加而增加，其中乙酸乙酯部位對(duì)ABTS自由基清除能力最強(qiáng)。維生素C及涼粉草不同部位提取物對(duì) ABTS自由基清除能力強(qiáng)弱順序?yàn)榫S生素C>乙酸乙酯部位>正丁醇部位>醇提部位>水部位>三氯甲烷部位>石油醚部位。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，濃度為5，10，20，40，80 μg·mL-1時(shí)，維生素C較乙酸乙酯部位差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，濃度為160 μg·mL-1時(shí)，乙酸乙酯部位和同濃度維生素C清除率較接近。濃度在10，20，40，80，160 μg·mL-1范圍內(nèi)，乙酸乙酯部位較正丁醇部位、醇提部位、水部位、三氯甲烷部位和石油醚均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，當(dāng)樣品濃度達(dá)到320 μg·mL-1時(shí)，維生素C與各部位對(duì)ABTS自由基的清除率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

①與同濃度維生素C比較，P<0.01；②與同濃度乙酸乙酯部位比較，P<0.05；③與同濃度乙酸乙酯部位比較，P<0.01；n=3。

圖1 不同極性部位對(duì)DPPH自由基清除作用

①compared with vitamin C at the same concentration,P<0.01；②compared with ethyl acetate part at the same concentration，P<0.05；③compared with ethyl acetate part at the same concentration,P<0.01；n=3.

Fig.1ScavengingeffectsofDPPH·bydifferentpolarparts

2.1.3FRAP測定結(jié)果 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)線性方程為Y=0.002 3X+0.169 9，R2=0.999 9，說明線性關(guān)系較好；由圖3可知，F(xiàn)RAP值反映總抗氧化能力的強(qiáng)弱，不同極性部位總抗氧化能力強(qiáng)弱順序?yàn)椋阂宜嵋阴ゲ课?正丁醇部位>醇提部位>水部位>三氯甲烷部位>石油醚部位。涼粉草其他極性部位總抗氧化能力均顯著低于乙酸乙酯部位(P<0.01)。

2.2對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用 從圖4可知，阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用隨濃度增加呈上升趨勢，存在較好量效關(guān)系。涼粉草乙酸乙酯部位、正丁醇部位、三氯甲烷部位、水部位、石油醚部位和醇提部位隨著濃度增加，對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用也增加。其中，涼粉草正丁醇部位提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用最強(qiáng)，其次為乙酸乙酯部位。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在濃度為0.5，1，2 mg·mL-1，阿卡波糖較正丁醇部位差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，當(dāng)樣品濃度達(dá)4 mg·mL-1時(shí)，正丁醇部位和同濃度阿卡波糖抑制率較接近。當(dāng)樣品濃度為0.25，0.5，1，2，4 mg·mL-1時(shí)，正丁醇部位較乙酸乙酯部位、醇提部位、水部位、三氯甲烷部位和石油醚均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。

①與同濃度維生素C比較，P<0.01；②與同濃度乙酸乙酯部位比較，P<0.05；③與同濃度乙酸乙酯部位比較，P<0.01；n=3。

圖2 不同極性部位對(duì)ABTS自由基清除作用

①compared with vitamin C at the same concentration,P<0.01;②compared with ethyl acetate part at the same concentration,P<0.05；③compared with ethyl acetate part at the same concentration,P<0.01；n=3.

Fig.2ScavengingeffectsofABTS+bydifferentpolarparts

①與乙酸乙酯部位比較，P<0.01。

①compared with ethyl acetate part，P<0.01.

2.3不同極性部位抗氧化活性及對(duì) α-葡萄糖苷酶的抑制作用 由DPPH及ABTS自由基清除率曲線可知，每批不同提取部位抗氧化活性存在差異，但乙酸乙酯部位抗氧化能力均最強(qiáng)，石油醚部位最弱，且均低于陽性對(duì)照藥維生素C。根據(jù)IC50結(jié)果，不同批次DPPH及ABTS自由基清除能力順序?yàn)椋壕S生素C>乙酸乙酯部位>正丁醇部位>醇提物>水部位>三氯甲烷部位>石油醚部位。由FRAP實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，不同批次FRAP值大小為：乙酸乙酯部位>正丁醇部位>醇提物>水部位>三氯甲烷部位>石油醚部位；FRAP值越大，說明總抗氧化能力越強(qiáng)。再結(jié)合DPPH及ABTS自由基清除率結(jié)果，在一定程度上，DPPH及ABTS自由基清除能力越強(qiáng)，其總抗氧化能力也越強(qiáng)，具有一定的正相關(guān)性，見表2。

①與同濃度阿卡波糖比較，P<0.01；②與同濃度正丁醇部位比較，P<0.05；③與同濃度正丁醇部位比較，P<0.01；n=3。

圖4 不同極性部位對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果

①compared with acarbose at the same concentration,P<0.01; ②compared with n-butanol part at the same concentration,P<0.05；③compared with n-butanol part at the same concentration,P<0.01；n=3.

Fig.4Inhibitioneffectofα-glucosidasebydifferentpolarparts

對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制實(shí)驗(yàn)表明，涼粉草正丁醇部位效果最優(yōu)，其次為乙酸乙酯部位，結(jié)合抗氧化結(jié)果可知，涼粉草有效活性部位集中在乙酸乙酯和正丁醇部位。

2.4涼粉草不同極性部位多酚含量 多酚含量最高的是水部位，為12.50 mg·g-1，其次是乙酸乙酯部位(3.41 mg·g-1)，之后是正丁醇部位(3.16 mg·g-1)。但抗氧化能力最強(qiáng)的是乙酸乙酯部位，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果最優(yōu)的是正丁醇部位。

2.5相關(guān)性分析 為進(jìn)一步探索涼粉草不同極性部位多酚含量與抗氧化和對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用之間相關(guān)性，筆者以Pearson 相關(guān)系數(shù)衡量不同指標(biāo)之間相關(guān)性。表3表明多酚含量與DPPH IC50、ABTS IC50呈負(fù)相關(guān)，與FRAP值、α-葡萄糖苷酶IC50呈正相關(guān)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而3個(gè)抗氧化指標(biāo)之間都有很好的相關(guān)性(P<0.01)，說明某一組分在清除一種自由基能力強(qiáng)時(shí)，對(duì)剩余2個(gè)抗氧化指標(biāo)的清除能力也強(qiáng)。

表2 涼粉草不同極性部位抗氧化及對(duì) α-葡萄糖苷酶抑制作用

Table.2Antioxidationandα-glucosidaseinhibitionbydifferentpolarpartsofMesonachinensis

提取部位DPPH(IC50)ABTS(IC50)FRAP(Fe2+)(μg·mL-1) α-葡萄糖苷酶(IC50)/(mg·mL-1)石油醚111.7045.2094.540.85三氯甲烷95.8833.89122.360.53乙酸乙酯19.1318.20392.070.35正丁醇52.6724.03240.910.25水82.8728.70192.221.99醇提65.4527.87238.010.79維生素C8.5867.63——阿卡波糖———0.05

“—”表示未進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)

“—” indicated that the experiment was not performed

3 討論

筆者在本實(shí)驗(yàn)采用 DPPH 自由基法、ABTS自由基法和FRAP法，對(duì)涼粉草醇提物不同極性部位的體外抗氧化能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)和比較。研究發(fā)現(xiàn)各組分均具不同程度抗氧化能力，乙酸乙酯部位抗氧化能力強(qiáng)于其他極性部位。對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)表明，正丁醇部位效果優(yōu)于其他部位。因此，可初步確定涼粉草抗氧化活性有效成分主要在乙酸乙酯部位，抑制α-葡萄糖苷酶活性成分主要在正丁醇部位。

進(jìn)一步對(duì)涼粉草醇提物及其不同極性部位進(jìn)行多酚含量測定，結(jié)果顯示水部位多酚含量最高，這與文獻(xiàn)報(bào)道中涼粉草水溶性成分中酚酸含量較高一致[12]。雖然石油醚和三氯甲烷部位多酚含量很低，僅有0.32和0.34 mg·g-1，但這兩個(gè)部位抗氧化和對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用仍有較好活性，說明涼粉草石油醚和三氯甲烷部位的抗氧化作用和對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的物質(zhì)基礎(chǔ)可能與涼粉草中的多酚類化合物不相關(guān)，且由多酚含量與抗氧化和對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用之間的相關(guān)性結(jié)果也說明了這一點(diǎn)。

筆者在本實(shí)驗(yàn)通過評(píng)價(jià)涼粉草抗氧化活性和對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性，為深入研究涼粉草活性化合物的結(jié)構(gòu)鑒定，篩選高效抗氧化藥物和食品抗氧化劑的研究及其深入開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

表3 涼粉草不同極性部位多酚含量與抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制作用的相關(guān)性分析

Table.3Correlationanalysisamongpolyphenolcontent,antioxidantandα-glucosidaseinhibitionofdifferentpolarpartsofMesonachinensis

項(xiàng)目多酚含量DPPH(IC50)ABTS(IC50)FRAP值α-葡萄糖苷酶(IC50)多酚含量 Pearson 相關(guān)性1-0.144-0.2720.2060.478 顯著性(雙側(cè))0.7860.6020.6960.338DPPH IC50 Pearson 相關(guān)性-0.14410.938①-0.985①0.411 顯著性(雙側(cè))0.7860.0060.0000.419ABTS IC50 Pearson 相關(guān)性-0.2720.938①1-0.911②0.232 顯著性(雙側(cè))0.6020.0060.0120.659FRAP值 Pearson 相關(guān)性0.206-0.985①-0.911②1-0.306 顯著性(雙側(cè))0.6960.0000.0120.556α葡萄糖苷酶 IC50 Pearson 相關(guān)性0.4780.4110.232-0.3061 顯著性(雙側(cè))0.3380.4190.6590.556

①表示在0.01水平上顯著相關(guān)；②表示在0.05水平上顯著相關(guān)。

①Showed significant correlation at 0.01 level；②Showed significant correlation at 0.05 level.