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        血管活性腸肽及其受體在嗜酸性粒細(xì)胞性胃腸炎兒童胃黏膜中的表達(dá)及其臨床意義

        2020-04-07 11:35:20王婧趙煜張書(shū)紅李妍李靜
        關(guān)鍵詞:胃竇結(jié)果表明胃腸道

        王婧,趙煜,張書(shū)紅,李妍,李靜

        (天津市兒童醫(yī)院 消化科,天津 300134)

        嗜酸性粒細(xì)胞性胃腸炎(eosinophilic gastroenteritis,EG)是兒童較為常見(jiàn)的胃腸道疾病,其主要臨床特征是胃腸道局限性或彌漫性嗜酸性粒細(xì)胞(Eosinophilic,EOS)異常增多、浸潤(rùn),可累及食管到直腸的任一部位,其中胃最易受到影響[1]。目前關(guān)于EG 的發(fā)病機(jī)制存在多種觀點(diǎn),其中變態(tài)反應(yīng)、遺傳因素、免疫功能異常、營(yíng)養(yǎng)因素、藥物、食物等可能參與EG 的發(fā)病[2-3]。血管活性腸肽(vasoactive intestinal polypeptide,VIP)是廣泛分布在胃腸黏膜的一種非膽堿能非腎上腺能神經(jīng)遞質(zhì),其具有調(diào)節(jié)胃腸道的生理、生化、免疫功能,以及抗炎、免疫、舒張平滑肌等多種功能[4]。相關(guān)研究已證實(shí)采用霧化吸入VIP 法可減輕哮喘發(fā)作程度,并抑制氣道重塑[5]。VIP作用于其受體(VPAC),其是與G 蛋白耦聯(lián)的7 次跨膜糖蛋白,2 種受體亞型為VPAC1 和VPAC2。研究表明,VPAC1 可能與腹瀉型腸易激綜合征有關(guān)[6],VPAC2 可能與特發(fā)性蕁麻疹過(guò)程中肥大細(xì)胞的脫顆粒作用有關(guān)[7]。目前關(guān)于VIP、VPAC1 和VPAC2 與兒童EG 之間的關(guān)系研究較少,因此,本文通過(guò)研究?jī)和葛つぶ蠽IP 及其受體表達(dá)的變化,進(jìn)一步探討其在兒童EG 中的作用及臨床意義。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料

        選取2008年11月—2018年12月天津市兒童醫(yī)院消化科收治的EG 兒童50 例作為研究對(duì)象(EG 組)。其中,男性34 例,女性16 例;年齡0.4~10 歲,平均(4.33±2.55)歲。同時(shí)選取胃鏡下病理活檢EOS< 10 個(gè)/高倍視野(HPF),免疫球蛋白(IgE)檢測(cè)正常的同一年齡段的急性腸胃炎兒童50 例作為對(duì)照組。 其中,男性33 例,女性17 例;年齡0.5~10.0 歲,平均(4.29±2.50)歲。EG兒童納入標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)TALLEY標(biāo)準(zhǔn)[8],臨床表現(xiàn)為反復(fù)腹痛、腹瀉、惡心嘔吐、便血、腹脹、腹腔積液等。排除標(biāo)準(zhǔn):患兒有幽門(mén)螺桿菌感染、真菌感染、寄生蟲(chóng)感染、炎癥性腸病、變應(yīng)性紫癜、自身免疫性疾病、結(jié)核、功能性胃腸病等疾病。

        1.2 儀器與試劑

        1.2.1 儀器 低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf 公司),超微量分光光度計(jì)(北京凱奧科技公司),ABI 7900 PCR 儀(美國(guó)ABI 公司),GBox F3 凝膠成像系統(tǒng)(英國(guó)Syngene 公司),-80℃冰箱(中科美菱公司)。

        1.2.2 試劑 Trizol(美國(guó)Ambion 公司),PCR 試劑盒、DNA Mark DL500(大連寶生生物工程有限公司),引物合成(北京六合華大基因科技股份有限公司),氯仿、異丙醇、瓊脂糖、溴化乙錠(北京中生瑞泰科技有限公司)。

        1.3 VIP、VPAC1、VPAC2 的RT-PCR 檢測(cè)

        分別兩組胃黏膜組織標(biāo)本,離體10 min 內(nèi)迅速投入液氮中保存,提取RNA 并行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè),分別加入VIP、VPAC1、VPAC2的引物進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增,RT-PRC 反應(yīng)體系為:Sybr Premix Ex Taq(2×),10 μl;正向引物和反向引物分別為(20 μmol/L)0.2 μl,Rox Peference Dye Ⅱ(50×)0.4 μl,cDNA 2 μl,dH2O 7.2 μl。擴(kuò)增條件:94 ℃變性45 s,60.2℃退火30 s,72℃延伸1 min,共35 個(gè)循環(huán);72℃繼續(xù)延伸10 min。產(chǎn)物-20℃冰箱冷凍保存。用2-△△Ct法對(duì)RT-PCR 的結(jié)果進(jìn)行相對(duì)定量分析,2-△△Ct表示EG組相對(duì)于對(duì)照組的擴(kuò)增倍數(shù),△△Ct=CtEG組-Ct對(duì)照組。

        1.4 觀察指標(biāo)

        患兒入院后檢測(cè)其外周血EOS 計(jì)數(shù)、IgE 水平,胃鏡檢查其黏膜變化。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以 均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以例(%)表示,比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Logistic回歸模型分析EG 的相關(guān)因素。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 兩組患兒一般資料比較

        兩組患兒性別、年齡、過(guò)敏史、腹痛、腹瀉、嘔吐、便血、腹脹、腹腔積液比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。見(jiàn)表1。

        2.2 兩組患兒外周血EOS、IgE 及胃鏡檢查結(jié)果比較

        兩組外周血EOS、EOS%、IgE 水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),EG 組高于對(duì)照組;兩組胃鏡下黏膜充血水腫、糜爛、潰瘍、結(jié)節(jié)樣隆起或增生例數(shù)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),EG 組多于對(duì)照組。見(jiàn)表2。

        2.3 兩組患兒VIP、VPAC1、VPAC2 mRNA 的表達(dá)比較

        兩組患兒VIP、VPAC1、VPAC2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),EG 組低于對(duì)照組。見(jiàn)表3。

        2.4 EG 影響因素分析

        將患兒是否為EG 作為因變量,將年齡、性別、過(guò)敏史、腹痛、腹瀉、嘔吐、便血、腹脹、腹腔積液、EOS、EOS%、IgE、黏膜充血水腫、糜爛、潰瘍、結(jié)節(jié)樣隆起或增生、VIP、VPAC1 及VPAC2 mRNA 作為自變量,建立模型進(jìn)行單因素Logistic 回歸分析,結(jié)果表明,便血、腹腔積液、EOS、EOS%、IgE、VIP、VPAC1、VPAC2 mRNA 為EG 影響因素(P<0.05)(見(jiàn)表4);將單因素分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的以上因素納入Logistic 回歸模型作多因素分析,結(jié)果表明VIP、VPAC1、VPAC2 mRNA 是EG 的獨(dú)立影響因素(P<0.05)(見(jiàn)表5)。

        表1 兩組患兒一般資料比較(n =50)

        表2 兩組患兒EOS、IgE 及胃鏡檢查結(jié)果比較(n =50)

        表3 兩組患兒VIP、VPAC1、VPAC2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平比較(n =50,±s)

        表3 兩組患兒VIP、VPAC1、VPAC2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平比較(n =50,±s)

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        表4 EG 影響因素的單因素Logistic 回歸分析參數(shù)

        續(xù)表4

        表5 EG 影響因素的多因素Logistic 回歸分析參數(shù)

        3 討論

        近年來(lái),由于各種因素如環(huán)境、飲食等方面的變化,兒童EG 的發(fā)病率逐年升高。EG 是以胃腸道EOS 異常浸潤(rùn)為特征的一種胃腸道疾病,可累及胃竇部、近端空腸、回腸、結(jié)腸、食管、腸系膜、淋巴結(jié)等。EG 的臨床表現(xiàn)呈多樣性,且無(wú)特異性,臨床主要特征為腹痛、腹瀉、嘔吐、便血、腹脹、腹腔積液等,若不能早期診斷并予以早期治療,可導(dǎo)致病情延誤或反復(fù)發(fā)作。目前,EG 的診斷主要依賴(lài)于胃腸鏡下多點(diǎn)活檢[9](≥6 個(gè)部位),且病理染色示有1 處以上EOS>20 個(gè)/高倍視野(HPF)[8-9]。因此,EG 的特異性診斷具有重要臨床意義。

        有研究表明[10],EG 患者外周血EOS 計(jì)數(shù)及總IgE 水平升高,可提示疾病的嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果亦顯示EG 組患兒EOS、EOS%、IgE 水平高于對(duì)照組。分析原因可能是由于外界過(guò)敏原侵入胃腸道后,可選擇性地誘導(dǎo)特異性B 細(xì)胞產(chǎn)生大量IgE 抗體,該抗體可與MC 表面的高親和力受體FcεRI 結(jié)合而引起機(jī)體過(guò)敏;當(dāng)該過(guò)敏原再次侵入胃腸道時(shí),使得MC 表面的FcεRI 受體交聯(lián)活化,導(dǎo)致MC 發(fā)生脫顆粒反應(yīng)而釋放大量EOS 趨化因子、炎癥因子(前列腺素、白三烯等)及細(xì)胞因子(IL-5、TNF-α、IFN-γ 等),最終導(dǎo)致EOS 浸潤(rùn),引起組織損傷。

        VIP 是人體分布較為廣泛的一種神經(jīng)肽,共28個(gè)氨基酸殘基,屬于非膽堿能、非腎上腺素能神經(jīng)遞質(zhì)和腦-腸肽物質(zhì)的一種,對(duì)人體免疫力以及內(nèi)分泌具有較好的調(diào)節(jié)作用,其可抑制巨噬細(xì)胞,調(diào)節(jié)T細(xì)胞生成。VIP 是胃腸道黏膜中含量較為豐富的神經(jīng)內(nèi)分泌肽,具有抑制胃腸道環(huán)形平滑肌的作用[11]。由于人體胃腸道黏膜中的VIP 較為豐富,可與周?chē)蚀蠹?xì)胞、EOS 相互作用,形成神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)[12]。另有報(bào)道[13],VIP 可抑制EOS 的遷移,增強(qiáng)EOS 浸潤(rùn),從而導(dǎo)致食管動(dòng)力障礙。錢(qián)淑怡等[14]研究發(fā)現(xiàn),EG 患兒胃竇黏膜中VIP 及VPAC2 水平與外周血EOS數(shù)量、總IgE 水平均呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,EG組患兒VIP mRNA 低于對(duì)照組;Logistic 回歸分析結(jié)果表明VIP mRNA 是EG 的獨(dú)立影響因素。結(jié)果表明,VIP mRNA 是EG 的獨(dú)立影響因素,可反應(yīng)是否發(fā)生EG,有助于臨床診斷。

        阮族明等[15]研究發(fā)現(xiàn),胃腺癌組織中VPAC1 表達(dá)量低于正常胃黏膜。許惠娟等[16]研究發(fā)現(xiàn),腸易激綜合征大鼠VPAC1 表達(dá)量高于正常組,模型大鼠由于結(jié)腸黏膜組織產(chǎn)生大量VPAC1 和VIP,使結(jié)腸組織細(xì)胞AQPs 的表達(dá)受到影響,進(jìn)而使得結(jié)腸上皮細(xì)胞紊亂而分泌大量水份及電解質(zhì),最終導(dǎo)致腹瀉的發(fā)生。目前關(guān)于EG 與VPAC1 的表達(dá)研究較少,本研究結(jié)果顯示,EG 組患兒VPAC1 相對(duì)表達(dá)水平低于對(duì)照組;Logistic 回歸分析結(jié)果表明VPAC1 mRNA 是EG 的獨(dú)立影響因素。結(jié)果表明,VPAC1 mRNA 可較好地反映EG 的發(fā)生,有助于早期診斷。

        VPAC2 受體是由位于VIPR2基因位于染色體7q36.3 區(qū)域進(jìn)行編碼。VPAC2 是VIP 以及垂體腺苷酸環(huán)化酶活性肽(PACAP)的共同受體,VPAC2 與PACAP、VIP 相結(jié)合后,使蛋白構(gòu)象發(fā)生改變,可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)腺苷酸(cAMP)水平升高,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞代謝水平發(fā)生變化。錢(qián)淑怡等[14]采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)EG 患者胃竇黏膜組織中VIP 及VPAC2 含量,結(jié)果顯示EG 組患者與對(duì)照組比較,VIP 及VPAC2 含量降低。JAIN[7]研究表明,慢性特發(fā)性蕁麻疹中VIP 通過(guò)作用于VPAC2,進(jìn)而調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞的脫顆粒過(guò)程。本研究結(jié)果顯示,EG 組患兒VPAC2 mRNA 低于對(duì)照組;Logistic 回歸分析結(jié)果表明VPAC2 mRNA 是EG 的獨(dú)立影響因素。結(jié)果表明,VPAC1 mRNA 減少可能與EG 的發(fā)生有關(guān)。

        吳昌歸等[17]研究發(fā)現(xiàn),VIP 可抑制血小板激活因子誘導(dǎo)的EOS 嗜酸性過(guò)氧化物酶活性的增加效應(yīng),對(duì)EOS 的脫顆粒反應(yīng)以及EOS 與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附起抑制作用,結(jié)合本研究結(jié)果推測(cè),胃竇黏膜VIP、VPAC1 及VPAC2 含量降低后,使得VIP 與VPAC1 及VPAC2 結(jié)合減少,進(jìn)而對(duì)EOS 與胃竇血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附、浸潤(rùn)的作用降低,導(dǎo)致胃黏膜 EOS 聚集并發(fā)生脫顆粒反應(yīng),從而釋放大量損傷性介質(zhì),最終導(dǎo)致EG 的發(fā)生。

        綜上所述,EG 兒童胃黏膜VIP 水平降低,VPAC1及VPAC2 mRNA 下降,可能與兒童胃黏膜EG 的發(fā)生、發(fā)展相關(guān),有助于臨床早期診斷并早期干預(yù)。另外,本研究結(jié)果提示,在臨床EG 患者的治療中,可嘗試提高VIP 水平,促進(jìn)VIP 與VPAC1 及VPAC2 的結(jié)合,進(jìn)而可能抑制EG 的發(fā)展,對(duì)臨床EG 的治療具有重要指導(dǎo)意義。

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