王婧，趙煜，張書(shū)紅，李妍，李靜

（天津市兒童醫(yī)院 消化科，天津 300134）

嗜酸性粒細(xì)胞性胃腸炎（eosinophilic gastroenteritis,EG）是兒童較為常見(jiàn)的胃腸道疾病，其主要臨床特征是胃腸道局限性或彌漫性嗜酸性粒細(xì)胞（Eosinophilic,EOS）異常增多、浸潤(rùn)，可累及食管到直腸的任一部位，其中胃最易受到影響[1]。目前關(guān)于EG 的發(fā)病機(jī)制存在多種觀點(diǎn)，其中變態(tài)反應(yīng)、遺傳因素、免疫功能異常、營(yíng)養(yǎng)因素、藥物、食物等可能參與EG 的發(fā)病[2-3]。血管活性腸肽（vasoactive intestinal polypeptide,VIP）是廣泛分布在胃腸黏膜的一種非膽堿能非腎上腺能神經(jīng)遞質(zhì)，其具有調(diào)節(jié)胃腸道的生理、生化、免疫功能，以及抗炎、免疫、舒張平滑肌等多種功能[4]。相關(guān)研究已證實(shí)采用霧化吸入VIP 法可減輕哮喘發(fā)作程度，并抑制氣道重塑[5]。VIP作用于其受體（VPAC），其是與G 蛋白耦聯(lián)的7 次跨膜糖蛋白，2 種受體亞型為VPAC1 和VPAC2。研究表明，VPAC1 可能與腹瀉型腸易激綜合征有關(guān)[6]，VPAC2 可能與特發(fā)性蕁麻疹過(guò)程中肥大細(xì)胞的脫顆粒作用有關(guān)[7]。目前關(guān)于VIP、VPAC1 和VPAC2 與兒童EG 之間的關(guān)系研究較少，因此，本文通過(guò)研究?jī)和葛つぶ蠽IP 及其受體表達(dá)的變化，進(jìn)一步探討其在兒童EG 中的作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2008年11月—2018年12月天津市兒童醫(yī)院消化科收治的EG 兒童50 例作為研究對(duì)象（EG 組）。其中，男性34 例，女性16 例；年齡0.4～10 歲，平均（4.33±2.55）歲。同時(shí)選取胃鏡下病理活檢EOS＜ 10 個(gè)/高倍視野（HPF），免疫球蛋白（IgE）檢測(cè)正常的同一年齡段的急性腸胃炎兒童50 例作為對(duì)照組。 其中，男性33 例，女性17 例；年齡0.5～10.0 歲，平均（4.29±2.50）歲。EG兒童納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)TALLEY標(biāo)準(zhǔn)[8]，臨床表現(xiàn)為反復(fù)腹痛、腹瀉、惡心嘔吐、便血、腹脹、腹腔積液等。排除標(biāo)準(zhǔn)：患兒有幽門(mén)螺桿菌感染、真菌感染、寄生蟲(chóng)感染、炎癥性腸病、變應(yīng)性紫癜、自身免疫性疾病、結(jié)核、功能性胃腸病等疾病。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司），超微量分光光度計(jì)（北京凱奧科技公司），ABI 7900 PCR 儀（美國(guó)ABI 公司），GBox F3 凝膠成像系統(tǒng)（英國(guó)Syngene 公司），-80℃冰箱（中科美菱公司）。

1.2.2 試劑 Trizol（美國(guó)Ambion 公司），PCR 試劑盒、DNA Mark DL500（大連寶生生物工程有限公司），引物合成（北京六合華大基因科技股份有限公司），氯仿、異丙醇、瓊脂糖、溴化乙錠（北京中生瑞泰科技有限公司）。

1.3 VIP、VPAC1、VPAC2 的RT-PCR 檢測(cè)

分別兩組胃黏膜組織標(biāo)本，離體10 min 內(nèi)迅速投入液氮中保存，提取RNA 并行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)，分別加入VIP、VPAC1、VPAC2的引物進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，RT-PRC 反應(yīng)體系為：Sybr Premix Ex Taq（2×），10 μl；正向引物和反向引物分別為（20 μmol/L）0.2 μl，Rox Peference Dye Ⅱ（50×）0.4 μl，cDNA 2 μl，dH2O 7.2 μl。擴(kuò)增條件：94 ℃變性45 s，60.2℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35 個(gè)循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸10 min。產(chǎn)物-20℃冰箱冷凍保存。用2-△△Ct法對(duì)RT-PCR 的結(jié)果進(jìn)行相對(duì)定量分析，2-△△Ct表示EG組相對(duì)于對(duì)照組的擴(kuò)增倍數(shù)，△△Ct=CtEG組-Ct對(duì)照組。

1.4 觀察指標(biāo)

患兒入院后檢測(cè)其外周血EOS 計(jì)數(shù)、IgE 水平，胃鏡檢查其黏膜變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以 均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Logistic回歸模型分析EG 的相關(guān)因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患兒一般資料比較

兩組患兒性別、年齡、過(guò)敏史、腹痛、腹瀉、嘔吐、便血、腹脹、腹腔積液比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 兩組患兒外周血EOS、IgE 及胃鏡檢查結(jié)果比較

兩組外周血EOS、EOS%、IgE 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），EG 組高于對(duì)照組；兩組胃鏡下黏膜充血水腫、糜爛、潰瘍、結(jié)節(jié)樣隆起或增生例數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），EG 組多于對(duì)照組。見(jiàn)表2。

2.3 兩組患兒VIP、VPAC1、VPAC2 mRNA 的表達(dá)比較

兩組患兒VIP、VPAC1、VPAC2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），EG 組低于對(duì)照組。見(jiàn)表3。

2.4 EG 影響因素分析

將患兒是否為EG 作為因變量，將年齡、性別、過(guò)敏史、腹痛、腹瀉、嘔吐、便血、腹脹、腹腔積液、EOS、EOS%、IgE、黏膜充血水腫、糜爛、潰瘍、結(jié)節(jié)樣隆起或增生、VIP、VPAC1 及VPAC2 mRNA 作為自變量，建立模型進(jìn)行單因素Logistic 回歸分析，結(jié)果表明，便血、腹腔積液、EOS、EOS%、IgE、VIP、VPAC1、VPAC2 mRNA 為EG 影響因素（P＜0.05）（見(jiàn)表4）；將單因素分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的以上因素納入Logistic 回歸模型作多因素分析，結(jié)果表明VIP、VPAC1、VPAC2 mRNA 是EG 的獨(dú)立影響因素（P＜0.05）（見(jiàn)表5）。

表1 兩組患兒一般資料比較（n =50）

表2 兩組患兒EOS、IgE 及胃鏡檢查結(jié)果比較（n =50）

表3 兩組患兒VIP、VPAC1、VPAC2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平比較（n =50，±s）

表3 兩組患兒VIP、VPAC1、VPAC2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平比較（n =50，±s）

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表4 EG 影響因素的單因素Logistic 回歸分析參數(shù)

續(xù)表4

表5 EG 影響因素的多因素Logistic 回歸分析參數(shù)

3 討論

近年來(lái)，由于各種因素如環(huán)境、飲食等方面的變化，兒童EG 的發(fā)病率逐年升高。EG 是以胃腸道EOS 異常浸潤(rùn)為特征的一種胃腸道疾病，可累及胃竇部、近端空腸、回腸、結(jié)腸、食管、腸系膜、淋巴結(jié)等。EG 的臨床表現(xiàn)呈多樣性，且無(wú)特異性，臨床主要特征為腹痛、腹瀉、嘔吐、便血、腹脹、腹腔積液等，若不能早期診斷并予以早期治療，可導(dǎo)致病情延誤或反復(fù)發(fā)作。目前，EG 的診斷主要依賴(lài)于胃腸鏡下多點(diǎn)活檢[9]（≥6 個(gè)部位），且病理染色示有1 處以上EOS＞20 個(gè)/高倍視野（HPF）[8-9]。因此，EG 的特異性診斷具有重要臨床意義。

有研究表明[10]，EG 患者外周血EOS 計(jì)數(shù)及總IgE 水平升高，可提示疾病的嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果亦顯示EG 組患兒EOS、EOS%、IgE 水平高于對(duì)照組。分析原因可能是由于外界過(guò)敏原侵入胃腸道后，可選擇性地誘導(dǎo)特異性B 細(xì)胞產(chǎn)生大量IgE 抗體，該抗體可與MC 表面的高親和力受體FcεRI 結(jié)合而引起機(jī)體過(guò)敏；當(dāng)該過(guò)敏原再次侵入胃腸道時(shí)，使得MC 表面的FcεRI 受體交聯(lián)活化，導(dǎo)致MC 發(fā)生脫顆粒反應(yīng)而釋放大量EOS 趨化因子、炎癥因子（前列腺素、白三烯等）及細(xì)胞因子（IL-5、TNF-α、IFN-γ 等），最終導(dǎo)致EOS 浸潤(rùn)，引起組織損傷。

VIP 是人體分布較為廣泛的一種神經(jīng)肽，共28個(gè)氨基酸殘基，屬于非膽堿能、非腎上腺素能神經(jīng)遞質(zhì)和腦-腸肽物質(zhì)的一種，對(duì)人體免疫力以及內(nèi)分泌具有較好的調(diào)節(jié)作用，其可抑制巨噬細(xì)胞，調(diào)節(jié)T細(xì)胞生成。VIP 是胃腸道黏膜中含量較為豐富的神經(jīng)內(nèi)分泌肽，具有抑制胃腸道環(huán)形平滑肌的作用[11]。由于人體胃腸道黏膜中的VIP 較為豐富，可與周?chē)蚀蠹?xì)胞、EOS 相互作用，形成神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)[12]。另有報(bào)道[13]，VIP 可抑制EOS 的遷移，增強(qiáng)EOS 浸潤(rùn)，從而導(dǎo)致食管動(dòng)力障礙。錢(qián)淑怡等[14]研究發(fā)現(xiàn)，EG 患兒胃竇黏膜中VIP 及VPAC2 水平與外周血EOS數(shù)量、總IgE 水平均呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，EG組患兒VIP mRNA 低于對(duì)照組；Logistic 回歸分析結(jié)果表明VIP mRNA 是EG 的獨(dú)立影響因素。結(jié)果表明，VIP mRNA 是EG 的獨(dú)立影響因素，可反應(yīng)是否發(fā)生EG，有助于臨床診斷。

阮族明等[15]研究發(fā)現(xiàn)，胃腺癌組織中VPAC1 表達(dá)量低于正常胃黏膜。許惠娟等[16]研究發(fā)現(xiàn)，腸易激綜合征大鼠VPAC1 表達(dá)量高于正常組，模型大鼠由于結(jié)腸黏膜組織產(chǎn)生大量VPAC1 和VIP，使結(jié)腸組織細(xì)胞AQPs 的表達(dá)受到影響，進(jìn)而使得結(jié)腸上皮細(xì)胞紊亂而分泌大量水份及電解質(zhì)，最終導(dǎo)致腹瀉的發(fā)生。目前關(guān)于EG 與VPAC1 的表達(dá)研究較少，本研究結(jié)果顯示，EG 組患兒VPAC1 相對(duì)表達(dá)水平低于對(duì)照組；Logistic 回歸分析結(jié)果表明VPAC1 mRNA 是EG 的獨(dú)立影響因素。結(jié)果表明，VPAC1 mRNA 可較好地反映EG 的發(fā)生，有助于早期診斷。

VPAC2 受體是由位于VIPR2基因位于染色體7q36.3 區(qū)域進(jìn)行編碼。VPAC2 是VIP 以及垂體腺苷酸環(huán)化酶活性肽（PACAP）的共同受體，VPAC2 與PACAP、VIP 相結(jié)合后，使蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)腺苷酸（cAMP）水平升高，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞代謝水平發(fā)生變化。錢(qián)淑怡等[14]采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)EG 患者胃竇黏膜組織中VIP 及VPAC2 含量，結(jié)果顯示EG 組患者與對(duì)照組比較，VIP 及VPAC2 含量降低。JAIN[7]研究表明，慢性特發(fā)性蕁麻疹中VIP 通過(guò)作用于VPAC2，進(jìn)而調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞的脫顆粒過(guò)程。本研究結(jié)果顯示，EG 組患兒VPAC2 mRNA 低于對(duì)照組；Logistic 回歸分析結(jié)果表明VPAC2 mRNA 是EG 的獨(dú)立影響因素。結(jié)果表明，VPAC1 mRNA 減少可能與EG 的發(fā)生有關(guān)。

吳昌歸等[17]研究發(fā)現(xiàn)，VIP 可抑制血小板激活因子誘導(dǎo)的EOS 嗜酸性過(guò)氧化物酶活性的增加效應(yīng)，對(duì)EOS 的脫顆粒反應(yīng)以及EOS 與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附起抑制作用，結(jié)合本研究結(jié)果推測(cè)，胃竇黏膜VIP、VPAC1 及VPAC2 含量降低后，使得VIP 與VPAC1 及VPAC2 結(jié)合減少，進(jìn)而對(duì)EOS 與胃竇血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附、浸潤(rùn)的作用降低，導(dǎo)致胃黏膜 EOS 聚集并發(fā)生脫顆粒反應(yīng)，從而釋放大量損傷性介質(zhì)，最終導(dǎo)致EG 的發(fā)生。

綜上所述，EG 兒童胃黏膜VIP 水平降低，VPAC1及VPAC2 mRNA 下降，可能與兒童胃黏膜EG 的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，有助于臨床早期診斷并早期干預(yù)。另外，本研究結(jié)果提示，在臨床EG 患者的治療中，可嘗試提高VIP 水平，促進(jìn)VIP 與VPAC1 及VPAC2 的結(jié)合，進(jìn)而可能抑制EG 的發(fā)展，對(duì)臨床EG 的治療具有重要指導(dǎo)意義。