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        云南水牛mtDNA D-loop遺傳多樣性研究

        2020-04-07 00:47:40亐開興金顯棟張繼才尹以昌李紅偉和嘉榮和占星羅再仁雷初朝黃必志
        中國牛業(yè)科學 2020年6期
        關鍵詞:鹽津支系德宏

        亐開興, 金顯棟, 張繼才, 尹以昌, 李紅偉, 和嘉榮, 和占星, 羅再仁, 雷初朝, 黃必志*

        (1. 云南省草地動物科學研究院,昆明 650212;2. 德宏州畜牧站,云南 德宏 678400;3. 紅河州畜牧技術推廣站,云南 蒙自 661100;4. 云南省種畜繁育推廣中心,昆明 650212;5. 盈江縣農業(yè)農村局,云南 盈江 679300;6. 西北農林科技大學動物科技學院,陜西 楊凌 712100)

        水牛是熱帶、亞熱帶地區(qū)的重要家養(yǎng)動物,能為人類提供肉、奶等,且是水稻種植區(qū)的重要役用動物。根據核型、表型等將水牛分為兩種類型:江河型水牛(2n= 50)和沼澤型水牛(2n= 48)[1]。幾乎所有的中國水牛均為沼澤型水牛。云南省水牛飼養(yǎng)量位居全國第二,主要分布于德宏、西雙版納、昭通、紅河、大理、臨滄、昆明郊縣等地[2]。德宏水牛、滇東南水牛與鹽津水牛是云南省最主要的3個地方品種。在距今約3000年前的“滄源崖畫”依稀刻有水牛和水牛角,表明云南水牛文化源遠流長。

        哺乳動物線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)結構簡單、遵循母系遺傳,且無重組、進化快,被廣泛地用于動物的系統(tǒng)發(fā)育、演化和遺傳多樣性等方面的研究中[3]。線粒體DNA的高變區(qū)(mtDNA D-loop),變異速率為其它片段的5~10倍,是研究動物母系遺傳的常用分子標記。迄今為止,在水牛上已有大量基于mtDNA D-loop的研究[4-8]。目前的研究表明,沼澤型水牛可以分為2個主要支系(A、B及其亞支系)和3個稀有支系(C、D、E)[6-8]。而云南地區(qū)的水牛具有較高的遺傳多樣性,且位于沼澤型水牛的馴化中心[6-8]。亐開興等通過對29條滇東南水牛mtDNA D-loop序列進行分析,將滇東南水牛分為A、B兩個支系[9];張自芳等通過對35條滇東南水牛mtDNA D-loop序列的進一步分析,也檢測到A、B兩個支系,且在B支系中檢測到了兩個亞支系(B1和B2)[10]。本研究通過對3個云南水牛品種(德宏水牛、滇東南水牛與鹽津水牛)的mtDNA D-loop全序列進行分析,以探討云南水牛的遺傳多樣性及母系起源,對促進云南水牛的種質資源保存和持續(xù)利用具有重要意義。

        1 材料與方法

        1.1 水牛樣品信息

        從紅河州蒙自縣采集29頭滇東南水牛血樣,從德宏州采集32頭德宏水牛血樣,頸靜脈血3~5 mL,肝素鈉抗凝,低溫運回實驗室,-20 ℃保存?zhèn)溆?。按常?guī)酚/氯仿法提取水牛的總DNA,稀釋至20 ng/μL。此外,從已發(fā)表的論文中獲取154個云南水牛mtDNA D-loop數據(德宏水牛71個,滇東南水牛54個和鹽津水牛29個)[7,8]。

        1.2 水牛mtDNA D-loop區(qū)的引物、PCR擴增與序列測定

        水牛mtDNA D-loop區(qū)PCR引物參照Kierstein等[11]發(fā)表的文獻,正向引物L15617:5′-TAGTGCTAATACCAACGGCC-3′,反向引物H399:AGGCATTTTCAGTGCCTTGC-3′,測序內引物1為:5′-CCATCAACACACCTGACC-3′,測序內引物2為:5′-CCATGCTCACACATAACTGTGC-3'。PCR擴增反應:94 ℃預變性4 min,然后94 ℃變性1 min,56 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min,36個循環(huán);72 ℃后延伸7~10 min。利用正反鏈雙向測序,并用兩個內引物進行重疊測序,以獲得水牛完整mtDNA D-loop區(qū)序列,測序由上海生工生物技術有限公司完成。

        1.3 數據分析

        序列由DNAStar 5.0軟件包Seqman人工校對。利用DnaSP 5.0軟件計算單倍型多樣性、核苷酸多樣性、平均核苷酸差異數。利用IQ-tree構建ML系統(tǒng)發(fā)育樹。

        2 結果與分析

        2.1 水牛mtDNA D-loop長度變異及其序列特征組成

        分析發(fā)現(xiàn)215條云南水牛mtDNA D-loop全序列長度為900~917 bp,這種長度變化主要是由于水牛mtDNA D-loop全序列含有3個Poly G/C/T(7~10個重復)插入缺失結構導致的。水牛mtDNA D-loop全序列由A、T、G、C四種堿基組成,其中A堿基含量最高(31.0%),其次為T(27.6%)和C(26.3%),G堿基含量最低(15.1%)。A+T的平均含量為58.6%,G+C的平均含量為41.4%,A+T的平均含量明顯高于G+C,表現(xiàn)出堿基的偏好性。

        2.2 云南水牛的mtDNA遺傳多樣性

        對這215頭水牛mtDNA D-loop全序列進行比對,共檢測到107個變異位點,定義了86種單倍型。分析結果表明,這3個云南水牛品種的mtDNA遺傳多樣性非常豐富(表1)。其中,德宏水牛、滇東南水牛和鹽津水牛的單倍型多樣性(Hd)分別為0.907±0.023、0.946±0.017和0.805±0.063,核苷酸多樣性(Pi)分別為0.0141±0.0017、0.0162±0.0018和0.0141±0.0031,平均核苷酸差異數(k)分別為12.60、14.58和12.66。相比于德宏水牛和滇東南水牛,鹽津水牛的遺傳多樣性較低。

        表1 云南3個水牛品種的mtDNA遺傳多樣性參數

        2.3 云南水牛mtDNA D-loop系統(tǒng)發(fā)育分析

        以非洲水牛為外群,利用IQ-tree構建云南水牛ML樹。ML系統(tǒng)發(fā)育樹的結果表明,在3個云南水牛品種中存在A和B兩個主要支系,以及稀有支系C(圖1)。其中,A支系又可以細分為A1、A2與A3亞支系,B支系可細分為B1、B2與B3亞支系。

        圖1 云南3個水牛品種的ML系統(tǒng)發(fā)育樹

        2.4 網絡分析

        構建了云南3個水牛品種的網絡關系圖(圖2),從圖2可以看出,215頭水??煞譃?個主要支系(A支系和B支系)和稀有支系C(僅在1頭德宏水牛中檢測到),此結果與ML系統(tǒng)發(fā)育樹得到的結果一致。其中,A支系又可以分為A1、A2與A3亞支系,B支系可分為B1、B2與B3亞支系,且A1與A2亞支系形成明顯的星形結構,說明沼澤型水牛A支系在馴化傳播過程中經歷了強烈的群體擴張。在這215個個體中,A支系為主要支系,占79.07%,B支系僅占20.47%。

        圖2 云南3個水牛品種的mtDNA D-loop網絡結構

        3 討 論

        研究共分析了215頭云南水牛的mtDNA D-loop序列(900~917 bp),包括103頭德宏水牛、83頭滇東南水牛、29頭鹽津水牛,其堿基含量分為為:A(31.0%)、T(27.6%)、C(26.3%)和G(15.1%),呈現(xiàn)明顯的堿基偏好性,這與脊椎動物的特征一致[12]。此外,A+T的含量明顯高于G+C,這與其他物種的研究結果一致,說明物種之間的mtDNA D-loop含量相似[13,14]。

        單倍型多樣度(Hd)和核苷酸多樣度(Pi)常用來衡量一個群體mtDNA的變異程度。本研究結果表明,在這3個云南水牛品種中,滇東南水牛的遺傳多樣性最高(Hd:0.946±0.017,Pi: 0.0162±0.0018),鹽津水牛的遺傳多樣最低(Hd:0.805±0.063,Pi: 0.0141±0.0031),這與之前的研究結果相似[8]。鹽津水牛較低的遺傳多樣性,可能與檢測的樣本數較少有關。總的來說,與中國其他地區(qū)的水牛相比,云南地方水牛呈現(xiàn)出較高的遺傳多樣性[7,8]。越來越多的研究表明,沼澤型水??赡茉谥袊髂吓c東南亞交接地區(qū)被馴化,而云南水牛如此高的遺傳多樣性也印證了這一觀點[7,15-17]。

        沼澤型水牛分為2個主要支系(A和B支系)及3個稀有支系(C、D、E)[10-13]。本研究結果表明,云南3個水牛品種存在A(A1,A2,A3)和B(B1,B2,B3)2大支系及稀有支系C,未檢測到稀有支系D和E。其中,A支系為主要支系,占79.07%,這和發(fā)表的研究結果一致[7,18-20]。此外,網絡圖的結果表明,A支系呈現(xiàn)明顯的星形結構,說明沼澤型水牛A支系在馴化傳播過程中經歷了強烈的群體擴張。

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