亐開興, 金顯棟， 張繼才， 尹以昌， 李紅偉， 和嘉榮， 和占星, 羅再仁， 雷初朝， 黃必志*

(1. 云南省草地動物科學研究院，昆明 650212；2. 德宏州畜牧站，云南 德宏 678400；3. 紅河州畜牧技術(shù)推廣站，云南 蒙自 661100；4. 云南省種畜繁育推廣中心，昆明 650212；5. 盈江縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，云南 盈江 679300；6. 西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西 楊凌 712100)

水牛是熱帶、亞熱帶地區(qū)的重要家養(yǎng)動物，能為人類提供肉、奶等，且是水稻種植區(qū)的重要役用動物。根據(jù)核型、表型等將水牛分為兩種類型：江河型水牛(2n= 50)和沼澤型水牛(2n= 48)[1]。幾乎所有的中國水牛均為沼澤型水牛。云南省水牛飼養(yǎng)量位居全國第二，主要分布于德宏、西雙版納、昭通、紅河、大理、臨滄、昆明郊縣等地[2]。德宏水牛、滇東南水牛與鹽津水牛是云南省最主要的3個地方品種。在距今約3000年前的“滄源崖畫”依稀刻有水牛和水牛角，表明云南水牛文化源遠流長。

哺乳動物線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)結(jié)構(gòu)簡單、遵循母系遺傳，且無重組、進化快，被廣泛地用于動物的系統(tǒng)發(fā)育、演化和遺傳多樣性等方面的研究中[3]。線粒體DNA的高變區(qū)(mtDNA D-loop)，變異速率為其它片段的5～10倍，是研究動物母系遺傳的常用分子標記。迄今為止，在水牛上已有大量基于mtDNA D-loop的研究[4-8]。目前的研究表明，沼澤型水牛可以分為2個主要支系(A、B及其亞支系)和3個稀有支系(C、D、E)[6-8]。而云南地區(qū)的水牛具有較高的遺傳多樣性，且位于沼澤型水牛的馴化中心[6-8]。亐開興等通過對29條滇東南水牛mtDNA D-loop序列進行分析，將滇東南水牛分為A、B兩個支系[9]；張自芳等通過對35條滇東南水牛mtDNA D-loop序列的進一步分析，也檢測到A、B兩個支系，且在B支系中檢測到了兩個亞支系(B1和B2)[10]。本研究通過對3個云南水牛品種(德宏水牛、滇東南水牛與鹽津水牛)的mtDNA D-loop全序列進行分析，以探討云南水牛的遺傳多樣性及母系起源，對促進云南水牛的種質(zhì)資源保存和持續(xù)利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 水牛樣品信息

從紅河州蒙自縣采集29頭滇東南水牛血樣，從德宏州采集32頭德宏水牛血樣，頸靜脈血3～5 mL，肝素鈉抗凝，低溫運回實驗室，-20 ℃保存?zhèn)溆谩０闯Ｒ?guī)酚/氯仿法提取水牛的總DNA，稀釋至20 ng/μL。此外，從已發(fā)表的論文中獲取154個云南水牛mtDNA D-loop數(shù)據(jù)(德宏水牛71個，滇東南水牛54個和鹽津水牛29個)[7,8]。

1.2 水牛mtDNA D-loop區(qū)的引物、PCR擴增與序列測定

水牛mtDNA D-loop區(qū)PCR引物參照Kierstein等[11]發(fā)表的文獻，正向引物L15617：5′-TAGTGCTAATACCAACGGCC-3′，反向引物H399：AGGCATTTTCAGTGCCTTGC-3′，測序內(nèi)引物1為：5′-CCATCAACACACCTGACC-3′，測序內(nèi)引物2為：5′-CCATGCTCACACATAACTGTGC-3'。PCR擴增反應：94 ℃預變性4 min，然后94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，36個循環(huán)；72 ℃后延伸7～10 min。利用正反鏈雙向測序，并用兩個內(nèi)引物進行重疊測序，以獲得水牛完整mtDNA D-loop區(qū)序列，測序由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)分析

序列由DNAStar 5.0軟件包Seqman人工校對。利用DnaSP 5.0軟件計算單倍型多樣性、核苷酸多樣性、平均核苷酸差異數(shù)。利用IQ-tree構(gòu)建ML系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 水牛mtDNA D-loop長度變異及其序列特征組成

分析發(fā)現(xiàn)215條云南水牛mtDNA D-loop全序列長度為900～917 bp，這種長度變化主要是由于水牛mtDNA D-loop全序列含有3個Poly G/C/T(7～10個重復)插入缺失結(jié)構(gòu)導致的。水牛mtDNA D-loop全序列由A、T、G、C四種堿基組成，其中A堿基含量最高(31.0%)，其次為T(27.6%)和C(26.3%)，G堿基含量最低(15.1%)。A+T的平均含量為58.6%，G+C的平均含量為41.4%，A+T的平均含量明顯高于G+C，表現(xiàn)出堿基的偏好性。

2.2 云南水牛的mtDNA遺傳多樣性

對這215頭水牛mtDNA D-loop全序列進行比對，共檢測到107個變異位點，定義了86種單倍型。分析結(jié)果表明，這3個云南水牛品種的mtDNA遺傳多樣性非常豐富(表1)。其中，德宏水牛、滇東南水牛和鹽津水牛的單倍型多樣性(Hd)分別為0.907±0.023、0.946±0.017和0.805±0.063，核苷酸多樣性(Pi)分別為0.0141±0.0017、0.0162±0.0018和0.0141±0.0031，平均核苷酸差異數(shù)(k)分別為12.60、14.58和12.66。相比于德宏水牛和滇東南水牛，鹽津水牛的遺傳多樣性較低。

表1 云南3個水牛品種的mtDNA遺傳多樣性參數(shù)

2.3 云南水牛mtDNA D-loop系統(tǒng)發(fā)育分析

以非洲水牛為外群，利用IQ-tree構(gòu)建云南水牛ML樹。ML系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果表明，在3個云南水牛品種中存在A和B兩個主要支系，以及稀有支系C(圖1)。其中，A支系又可以細分為A1、A2與A3亞支系，B支系可細分為B1、B2與B3亞支系。

圖1 云南3個水牛品種的ML系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 網(wǎng)絡分析

構(gòu)建了云南3個水牛品種的網(wǎng)絡關系圖(圖2)，從圖2可以看出，215頭水牛可分為2個主要支系(A支系和B支系)和稀有支系C(僅在1頭德宏水牛中檢測到)，此結(jié)果與ML系統(tǒng)發(fā)育樹得到的結(jié)果一致。其中，A支系又可以分為A1、A2與A3亞支系，B支系可分為B1、B2與B3亞支系，且A1與A2亞支系形成明顯的星形結(jié)構(gòu)，說明沼澤型水牛A支系在馴化傳播過程中經(jīng)歷了強烈的群體擴張。在這215個個體中，A支系為主要支系，占79.07%，B支系僅占20.47%。

圖2 云南3個水牛品種的mtDNA D-loop網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)

3 討 論

研究共分析了215頭云南水牛的mtDNA D-loop序列(900～917 bp)，包括103頭德宏水牛、83頭滇東南水牛、29頭鹽津水牛，其堿基含量分為為：A(31.0%)、T(27.6%)、C(26.3%)和G(15.1%)，呈現(xiàn)明顯的堿基偏好性，這與脊椎動物的特征一致[12]。此外，A+T的含量明顯高于G+C，這與其他物種的研究結(jié)果一致，說明物種之間的mtDNA D-loop含量相似[13,14]。

單倍型多樣度(Hd)和核苷酸多樣度(Pi)常用來衡量一個群體mtDNA的變異程度。本研究結(jié)果表明，在這3個云南水牛品種中，滇東南水牛的遺傳多樣性最高(Hd：0.946±0.017，Pi: 0.0162±0.0018)，鹽津水牛的遺傳多樣最低(Hd：0.805±0.063，Pi: 0.0141±0.0031)，這與之前的研究結(jié)果相似[8]。鹽津水牛較低的遺傳多樣性，可能與檢測的樣本數(shù)較少有關?？偟膩碚f，與中國其他地區(qū)的水牛相比，云南地方水牛呈現(xiàn)出較高的遺傳多樣性[7,8]。越來越多的研究表明，沼澤型水牛可能在中國西南與東南亞交接地區(qū)被馴化，而云南水牛如此高的遺傳多樣性也印證了這一觀點[7,15-17]。

沼澤型水牛分為2個主要支系(A和B支系)及3個稀有支系(C、D、E)[10-13]。本研究結(jié)果表明，云南3個水牛品種存在A(A1,A2,A3)和B(B1,B2,B3)2大支系及稀有支系C，未檢測到稀有支系D和E。其中，A支系為主要支系，占79.07%，這和發(fā)表的研究結(jié)果一致[7,18-20]。此外，網(wǎng)絡圖的結(jié)果表明，A支系呈現(xiàn)明顯的星形結(jié)構(gòu)，說明沼澤型水牛A支系在馴化傳播過程中經(jīng)歷了強烈的群體擴張。