張雪，張麗茹，王為，蔡冬冬，張?bào)?

1. 黑龍江東方學(xué)院食品與環(huán)境工程學(xué)部（哈爾濱 150066）；2. 呼倫貝爾雙娃乳業(yè)有限公司（呼倫貝爾 162750）

由于個(gè)人、社會(huì)等多方面外界因素的影響，許多地區(qū)出現(xiàn)了母乳喂養(yǎng)量缺乏、營(yíng)養(yǎng)缺乏以及母乳喂養(yǎng)條件缺乏等情況，因此對(duì)母乳替代品——嬰兒配方奶粉的研究備受重視[1]。嬰兒配方奶粉中脂肪酸組成較牛乳更接近于人乳，但不能完全替代人乳，那么生產(chǎn)脂肪母乳化嬰兒配方奶粉已成為乳品行業(yè)急待解決的重要問(wèn)題[2]。1, 3-二油酸2-棕櫚酸甘油三酯（簡(jiǎn)稱OPO）現(xiàn)已經(jīng)證實(shí)具有促進(jìn)鈣吸收和利用、促進(jìn)嬰兒發(fā)育、減少便秘和產(chǎn)梗阻發(fā)生的功能[3-6]，所以近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于保健食品、嬰幼兒配方乳粉等領(lǐng)域。

中國(guó)人民共和國(guó)衛(wèi)生部于2008年發(fā)布的第13號(hào)公告中，批準(zhǔn)1, 3-二油酸2-棕櫚酸甘油三酯（簡(jiǎn)稱OPO）作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用在嬰兒配方食品、較大嬰兒和幼兒配方食品中[7]，并于2010年第1號(hào)公告中擴(kuò)大其使用范圍及使用量[8]。

目前，國(guó)內(nèi)還沒(méi)有建立關(guān)于檢測(cè)嬰幼兒配方乳粉中OPO含量的標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)內(nèi)外對(duì)于OPO的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[9-12]、液相色譜法[13-18]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[19-20]等，其中高效液相色譜法[21]是目前較廣泛的方法，但使用的銀離子色譜柱的穩(wěn)定性差，柱子的使用率太低且壽命短，測(cè)定時(shí)間較其他方法長(zhǎng)，回收率欠佳，并不適用于OPO的分離測(cè)定。結(jié)合實(shí)際情況，氣相色譜法使用并不普遍，現(xiàn)有文獻(xiàn)中的方法也并沒(méi)有對(duì)方法進(jìn)行深入研究，但氣相色譜法較為穩(wěn)定，測(cè)定的結(jié)果普遍準(zhǔn)確且含量較高，因此試驗(yàn)擬建立一種測(cè)定乳粉中OPO含量的方法，旨在得到一種重現(xiàn)性好、精密度高且回收率高、結(jié)果準(zhǔn)確的方法，使其越來(lái)越多地被應(yīng)用到嬰幼兒配方乳粉中OPO的定量檢測(cè)中。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

25%氨水（分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；無(wú)水乙醇（色譜純，瑞典Oceanpak公司）；無(wú)水乙醚（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；石油醚（優(yōu)級(jí)純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；正己烷（德國(guó)Merck公司）；OPO標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（美國(guó)Sigma公司）；十七烷酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（美國(guó)NU-CHEK公司）；剛果紅指示劑（濃度10 g/L）；氮?dú)猓粴錃猓兌取?9.995%）；氧氣；0.22 μm尼龍濾膜（有機(jī)相）：上海安普生物科技有限公司；DB-1HT色譜柱（30 m×0.25 mm×0.1 μm，Agilent Technologies公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

7890（FID）型氣相色譜儀：Agilent Technologies公司；BT 125 D型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；TST-UPB-20型超純水機(jī)（泰斯特儀器有限公司）；KQ 3200 DE型數(shù)控沖超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DKS-2型電熱恒溫水浴鍋（泰斯特儀器有限公司）；XW-80 A型旋渦混合器（其林貝爾儀器制造有限公司）；RE-52 AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SPB-3全自動(dòng)空氣源（北京中惠普分析技術(shù)研究所）；SPH-300 A氫氣發(fā)生器（北京中惠普分析技術(shù)研究所）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

OPO溶液（1 mg/mL）：準(zhǔn)確稱取25 mg OPO標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用正己烷定容至25 mL并使其充分溶解，在4 ℃條件下儲(chǔ)存。

十七烷酸甘油三酯內(nèi)標(biāo)溶液（2.5 mg/mL）：準(zhǔn)確稱取62.5 mg十七烷酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用正己烷定容至25 mL并使其充分溶解，在4 ℃條件下儲(chǔ)存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確移取100，200，300，400和500 μL OPO溶液，每份準(zhǔn)確加入100 μL十七烷酸甘油三酯內(nèi)標(biāo)溶液，用正己烷定容至1 mL。其中OPO質(zhì)量濃度為100，200，300，400和500 μg/mL，十七烷酸甘油三酯內(nèi)標(biāo)溶液質(zhì)量濃度為250 μg/mL。

1.3.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

1.3.2.1 樣品前處理步驟

試驗(yàn)選用已知OPO含量的奶粉進(jìn)行測(cè)定，奶粉中的OPO含量是已知且穩(wěn)定的，理論值為4.50±0.05 g/100 g。準(zhǔn)確稱取1.0 g（精確至0.000 1 g）樣品，加入10 mL 65 ℃的超純水，使其溶解，置于毛氏抽脂瓶中；加入35%的氨水，在一定溫度下水解15 min；加入10 mL 95%無(wú)水乙醇以及2滴剛果紅指示劑，再加入一定量的乙醚與石油醚；將合并后的有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉脫水，在65 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至完全蒸干；將剩余的油脂用正己烷定容至25 mL，取2 mL上述液和1 mL內(nèi)標(biāo)溶液，用正己烷定容至10 mL，過(guò)0.22 μm濾膜，即為待測(cè)液。

1.3.2.2 堿水解液用量的選擇

氨水溶液體系的加入可以破壞乳的膠體性以及脂肪球膜，使非脂成分溶解于氨水溶液體系中，而脂肪游離出來(lái)，參考GB 5009.6—2016第三法[22]，選用1，2和3 mL的體積來(lái)判斷氨水加入量對(duì)最終結(jié)果的影響。1.3.2.3 水解溫度的選擇

水解溫度會(huì)直接影響堿水解液溶解脂肪的速度，但水解時(shí)間相差太短并不能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生顯著的影響，因此對(duì)水解溫度進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)選擇室溫23 ℃與水浴65 ℃來(lái)判斷水解溫度對(duì)最終結(jié)果的影響。

1.3.2.4 萃取劑用量的選擇

乙醚與石油醚作為萃取脂肪的萃取劑，其用量直接影響到脂肪的提取率。因此對(duì)萃取劑用量進(jìn)行優(yōu)化，選用以下兩種方式來(lái)判斷萃取劑用量對(duì)最終結(jié)果的影響：

1) 加入25 mL無(wú)水乙醚振搖1 min，靜置分層后加入25 mL石油醚振搖1 min，靜置分層后，將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)入雞心瓶中，再加入5 mL 95%無(wú)水乙醇，加入15 mL無(wú)水乙醚振搖1 min，靜置分層后加入15 mL石油醚振搖1 min，靜置分層后，將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)入雞心瓶中，最后加入15 mL無(wú)水乙醚振搖1 min，靜置分層后加入15 mL石油醚振搖1 min，靜置分層后，將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)入雞心瓶中。

2) 加入25 mL無(wú)水乙醚振搖1 min，靜置分層后加入25 mL石油醚振搖1 min，靜置分層后，將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)入雞心瓶中，再重復(fù)以上步驟提取2次。

1.3.2.5 萃取劑比例的選擇

試驗(yàn)采用無(wú)水乙醚與石油醚作為萃取劑，萃取劑的比例同樣影響萃取脂肪的結(jié)果，因此試驗(yàn)選用無(wú)水乙醚-石油醚比例分別為1︰1，1︰2和2︰1作為選擇條件。

1.3.3 色譜條件優(yōu)化

參照馬小寧等[12]程序升溫方法進(jìn)行改進(jìn)。分別采用兩種程序升溫方式進(jìn)行色譜條件優(yōu)化，進(jìn)樣樣品為0.1 g/100 g添加內(nèi)標(biāo)的OPO標(biāo)準(zhǔn)品。升溫程序（a）：初始溫度70 ℃，保持1 min，以50 ℃/min的速率升至170 ℃，再以20 ℃/min的速率升至350 ℃，保持25 min；升溫程序（b）：初始溫度100 ℃，保持1 min，以50 ℃/min的速率升至300 ℃，保持1 min，以20 ℃/min的速率升至370 ℃，保持10 min。

進(jìn)樣口溫度320 ℃；檢測(cè)器溫度370 ℃；載氣為氮?dú)?，恒壓模式；進(jìn)樣量1.0 μL；燃?xì)饬髁?0.00 mL/min。

1.3.4 OPO含量計(jì)算

式中：X表示試樣中OPO的含量，g/100 g；C表示試樣中OPO的濃度，mg/mL；V表示試樣的定容體積，mL；m表示試樣的質(zhì)量，mg；f表示稀釋倍數(shù)。

以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。

1.3.5 方法驗(yàn)證

1.3.5.1 精密度

對(duì)同一添加OPO的乳粉樣品，在相同的測(cè)定條件下進(jìn)行6次重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算OPO含量以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.3.5.2 加標(biāo)回收率

稱取一定量的樣品，在3個(gè)加標(biāo)水平下測(cè)定OPO含量，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算回收率。3個(gè)水平的添加量分別為2.4，3.4和4.4 g。

1.3.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)性

移取100，200，300，400和500 μL OPO溶液，每份加入100 μL十七烷酸甘油三酯溶液，用正己烷定容至1 mL。配制成OPO質(zhì)量濃度為100，200，300，400和500 μg/mL的系列溶液，對(duì)此混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定分析，以O(shè)PO含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5.4 檢出限與定量限

稱取一定量的樣品，在相同的測(cè)定條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，以相當(dāng)于3倍信噪比待測(cè)液的量計(jì)算，得出OPO的最低檢出限；以相當(dāng)于10倍信噪比待測(cè)液的量計(jì)算，得出OPO的最低定量限。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.1.1 氨水體積的選擇

當(dāng)加入1 mL氨水時(shí)，最終測(cè)得的OPO含量最高且最接近理論值，為4.36±0.02 g/100 g，最后選用1 mL氨水作為前處理最優(yōu)條件之一，樣品色譜分析圖如圖1所示。

2.1.2 水解溫度的選擇

在加入1 mL氨水的條件下，采用不同水解溫度進(jìn)行試驗(yàn)。由計(jì)算可知，當(dāng)在65 ℃溫度下水解時(shí)，最終測(cè)得的OPO含量最高且最接近理論值，為4.45±0.03 g/100 g，最后選用在65 ℃溫度下水解作為前處理最優(yōu)條件之一，樣品色譜分析圖如圖2所示。

圖1 加入1 mL氨水樣品色譜圖

圖2 65 ℃水解樣品色譜圖

2.1.3 萃取劑用量的選擇

在加入1 mL氨水、65 ℃溫度水解的條件下，采用不同萃取劑用量進(jìn)行試驗(yàn)。由計(jì)算可知，當(dāng)采用萃取劑用量（a）時(shí)，最終測(cè)得的OPO含量是最高的，為4.46±0.03 g/100 g，同時(shí)在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，采用萃取劑用量（b）時(shí)，萃取過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量白色渾濁物體，沉淀不完全，導(dǎo)致肉眼無(wú)法觀察萃取情況，影響后續(xù)試驗(yàn)操作與上機(jī)分析。綜上所述，最后選用萃取劑用量（a）作為前處理最優(yōu)條件之一，樣品色譜分析圖如圖3所示。

圖3 萃取劑用量（a）樣品色譜圖

2.1.4 萃取劑比例的選擇

試驗(yàn)以不添加OPO原料的嬰幼兒配方乳粉作為基質(zhì)粉，準(zhǔn)確稱取1 g基質(zhì)粉，向其中加入3 g OPO標(biāo)準(zhǔn)品，以無(wú)水乙醚與石油醚的比例分別為1︰1，1︰2和2︰1為變量條件測(cè)定OPO含量，每個(gè)變量重復(fù)測(cè)定6次，測(cè)得結(jié)果如表1所示。

表1 以萃取劑比例為變量試驗(yàn)結(jié)果 g/100 g

基質(zhì)粉中OPO含量如圖4所示。已知基質(zhì)粉中OPO含量約為1.72 g/100 g，加入標(biāo)準(zhǔn)品后的奶粉OPO理論含量約為4.72 g/100 g。表1表明，當(dāng)無(wú)水乙醚︰石油醚比例為1︰1時(shí)，測(cè)定結(jié)果最接近于最終理論值。綜合比較，選擇無(wú)水乙醚與石油醚的比例1︰1作為前處理最優(yōu)條件之一。

圖4 基質(zhì)粉OPO色譜圖

綜上所述，前處理?xiàng)l件的最終選擇為：氨水體積1 mL、水解溫度65 ℃、萃取劑用量（a）、無(wú)水乙醚與石油醚的比例1︰1。

2.2 色譜條件優(yōu)化

程序升溫（a）色譜圖如圖5所示。采用（a）程序升溫，內(nèi)標(biāo)物峰與目標(biāo)峰的出峰時(shí)間均在13 min左右，內(nèi)標(biāo)物峰與目標(biāo)峰分離效果不理想且峰型不好，雜峰較多，無(wú)法準(zhǔn)確定位內(nèi)標(biāo)物峰與目標(biāo)峰，為定量分析帶來(lái)困難。程序升溫（b）色譜圖如圖6所示。采用（b）程序升溫，內(nèi)標(biāo)物峰與目標(biāo)峰的出峰時(shí)間均在12 min左右，內(nèi)標(biāo)物峰與目標(biāo)峰分離效果理想且峰型良好，幾乎無(wú)雜峰，可以準(zhǔn)確定位內(nèi)標(biāo)物峰與目標(biāo)峰，適用于測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中的OPO含量。

2.3 精密度測(cè)定

對(duì)同一添加OPO的乳粉樣品進(jìn)行6次重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算OPO含量并進(jìn)行精密度分析，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表2。RSD值為2.57%，小于5%，表明儀器及方法的精密度與重現(xiàn)性良好，測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中的OPO具有較高的準(zhǔn)確度。

2.4 加標(biāo)回收率測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.1 g樣品，依次添加3個(gè)不同水平的OPO標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定6次，按上述試驗(yàn)條件操作，計(jì)算回收率，結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，加標(biāo)回收率平均為92.97%±5%，可以滿足分析方法對(duì)于加標(biāo)回收率的要求，可以證明采用該方法測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中的OPO具有較高的準(zhǔn)確度，效果良好。

圖5 采用程序升溫（a）色譜圖

圖6 采用程序升溫（b）色譜圖

表2 精密度測(cè)定結(jié)果

表3 回收率測(cè)定結(jié)果

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)性

對(duì)不同濃度的OPO混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果如圖7所示?？梢钥闯鰳?biāo)準(zhǔn)曲線濃度在0.1～0.5 g/100 g范圍內(nèi)，含量與峰面積線性關(guān)系最好，證明該方法響應(yīng)值與校正曲線一致度高，線性回歸方程為y=583.34x-13.858，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。

圖7 OPO標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 檢出限與定量限測(cè)定

以相當(dāng)于3倍信噪比待測(cè)液的量計(jì)算，得出OPO的最低檢出限為0.04 g/100 g；以相當(dāng)于10倍信噪比待測(cè)液的量計(jì)算，得出OPO的最低定量限為0.14 g/100 g。

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用氣相色譜法測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中OPO的含量，通過(guò)乙醚與石油醚提取乳粉中的脂肪，經(jīng)過(guò)無(wú)水硫酸鈉脫水、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮等處理，結(jié)果表明其RSD為2.57%，回收率為92.97%±5%；在0.1～0.5 g/100 g范圍內(nèi)，R2為0.999 8，檢出限為0.04 g/100 g，定量限為0.14 g/100 g。該方法操作簡(jiǎn)便、精密度高、回收率良好、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于嬰幼兒配方乳粉中OPO含量的檢測(cè)。