崔云前，襲祥雨，吉春暉，杜俊杰

齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，山東省微生物工程重點實驗室（濟南 250353）

酵母絮凝是啤酒酵母的一項重要特性，對于釀造啤酒具有極其重要意義。1976年，法國的Louis Pasteur在研究啤酒酵母時發(fā)現(xiàn)其存在這方面性狀[1]。酵母絮凝是酵母細(xì)胞在發(fā)酵液中由發(fā)散的懸浮狀態(tài)聚集成團(tuán)然后快速沉降的一種現(xiàn)象。絮凝是啤酒發(fā)酵過程中酵母細(xì)胞大量沉淀的前提條件，因此絮凝特性的改變通常意味著沉淀現(xiàn)象的變化。在發(fā)酵過程中，絮凝時機非常重要。在麥汁發(fā)酵完全之前，不應(yīng)過早發(fā)生絮凝，因為過早絮凝會導(dǎo)致發(fā)酵遲緩或停滯，最終的啤酒含有高殘留糖和令人不滿意的風(fēng)味特征。相反，啤酒發(fā)酵快結(jié)束時，大量酵母細(xì)胞凝聚，結(jié)團(tuán)后沉降過程有助于發(fā)酵液澄清。啤酒酵母菌種類不同，生理特性不同，因而絮凝性存在巨大差異。

1 絮凝的機理

國內(nèi)外對于啤酒酵母絮凝性的研究有數(shù)百年歷史，但對于啤酒酵母絮凝機理的復(fù)雜性，還沒有得出準(zhǔn)確定論。根據(jù)對已有研究的總結(jié)，啤酒酵母絮凝的機理主要有幾種假說。

1.1 鈣橋假說

Ca2+存在時，相鄰的酵母細(xì)胞間通過細(xì)胞外壁的羧基與之相連，形成細(xì)胞的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而絮凝沉降下來[2]。這個假說沒能解釋清楚絮凝過程中出現(xiàn)糖抑制現(xiàn)象和細(xì)胞間特異性相互作用。

1.2 外源絮凝素假說

有些酵母細(xì)胞表面帶有絮凝素，貼近細(xì)胞壁并且選擇性地結(jié)合相鄰酵母細(xì)胞壁上的甘露糖殘基，Ca2+在其中起到激活絮凝素作用。發(fā)酵液中的游離甘露糖占據(jù)絮凝素結(jié)合位點時，絮凝素便不能再與細(xì)胞壁上的甘露糖殘基相結(jié)合。有些不含有絮凝素的酵母也能發(fā)生絮凝現(xiàn)象，原因是其含有與絮凝素結(jié)構(gòu)相似的絮凝劑[3]。只在絮凝性酵母上發(fā)現(xiàn)過絮凝供體，且該物質(zhì)對蛋白酶敏感；絮凝受體在絮凝性酵母及非絮凝性酵母上都存在，對蛋白酶不敏感，且受甘露糖的專一性抑制。絮凝性酵母和非絮凝性酵母都可以合成絮凝素，兩者差別在于絮凝性酵母在其生長過程中可以連續(xù)合成并釋放絮凝素，而非絮凝性酵母則不具備這一特性[4]。因此，酵母的絮凝性取決于絮凝素能否被釋放。

1.3 基因調(diào)控假說

酵母細(xì)胞的絮凝基因是FLO1、FLO2、FLO4、FLO11和Lg-FLO1，此外FLO5、FLO9基因與FLO1基因具有高度同源性，它們表達(dá)的絮凝素也會使得釀酒酵母發(fā)生絮凝現(xiàn)象[5]。其中，F(xiàn)LO1、FLO5、FLO9基因控制細(xì)胞與細(xì)胞間具有相互黏附作用，使Lg-FLO1基因編碼絮凝素與甘露聚糖結(jié)合。絮凝基因活躍表達(dá)時會產(chǎn)生絮凝素，從而導(dǎo)致酵母發(fā)生絮凝現(xiàn)象。但是由于調(diào)節(jié)絮凝的基因家族數(shù)量較多，且十分不穩(wěn)定，每一個基因都具有復(fù)雜的調(diào)節(jié)機制，并且受外界環(huán)境的影響比較大。不同種類的酵母絮凝基因的不穩(wěn)定和差異等因素都會造成絮凝困難。

2 影響酵母絮凝性的因素

2.1 麥芽及麥汁組成

麥芽中含有酵母超前絮凝（PYF）因子，可以造成酵母提前絮凝。麥芽的PYF因子對啤酒酵母的絮凝性影響較大，PYF因子活力越低，酵母絮凝性越小，反之PYF因子活力越高，酵母絮凝性越強[6]。PYF因子大小受大麥品種、品質(zhì)、制麥等過程中微生物污染的影響。Jibiki等[7]認(rèn)為在制麥前對大麥進(jìn)行清洗，有助于減緩PYF因子對酵母絮凝的影響，因為多數(shù)PYF因子附著在大麥表面且溶于水，提前絮凝會造成麥汁中糖的降解速度減慢，利用率降低，發(fā)酵不徹底。

麥汁中的糖為酵母提供營養(yǎng)物質(zhì)，這些成分缺乏時，會使得酵母細(xì)胞表面的疏水性增強，進(jìn)而誘導(dǎo)酵母細(xì)胞發(fā)生絮凝現(xiàn)象。周波等[8]研究表明，麥汁濃度越高，酵母細(xì)胞就越難凝聚，尤其是在含高濃度葡萄糖的麥汁中，酵母不易絮凝；但在含高濃度麥芽糖的麥汁中，酵母絮凝容易絮凝。葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖均可抑制酵母絮凝，且三者之中葡萄糖抑制作用最低。

麥汁中的氨基酸可為酵母生長繁殖提供氮源，因而對酵母絮凝有重要作用。麥汁中氨基酸含量不足時，酵母繁殖缺乏充足的可同化氮，繁殖速度會降低，新生細(xì)胞數(shù)目減少，從而導(dǎo)致酵母絮凝速度降低[9]。大米等輔料的存在，使得麥汁中可同化氮數(shù)量減少，也會從不同程度上減緩絮凝速度。

麥汁中金屬離子含量對酵母絮凝也有重要影響，特別是Ca2+濃度的大小對酵母絮凝性影響十分顯著[10]。Ca2+與細(xì)胞表面的羧基基團(tuán)相互作用可以產(chǎn)生“鈣橋效應(yīng)”，有利于酵母絮凝。它還是酵母健康生長必需的礦物質(zhì)元素之一，是參加酵母代謝活動所必需的，它雖然不直接參與酵母細(xì)胞的物質(zhì)組成，但是能以離子狀態(tài)控制細(xì)胞生理狀態(tài)[11]。另外Ca2+還會受其他同系物的競爭性抑制。此外，除了Ca2+外，Zn2+、Mg2+也可促進(jìn)酵母絮凝作用，但Ba2+、Pb2+、Na+、K+會抑制酵母的絮凝作用[28]，這些金屬離子對酵母絮凝的影響機制有待進(jìn)一步研究。

由于酵母是兼性厭氧微生物，所以在有氧和無氧的環(huán)境下都能生存。麥汁中溶解氧含量不足時，新生健壯的酵母細(xì)胞數(shù)量減少，衰老、死亡的酵母細(xì)胞數(shù)量增多，從而使得酵母細(xì)胞的增殖率下降[12]，最終導(dǎo)致酵母過早但不完全絮凝；溶解氧含量過多時，酵母增殖速度加快，加快發(fā)酵速度，影響酵母細(xì)胞的正常代謝，加快細(xì)胞衰老或死亡速率，使得酵母提前絮凝。酵母在缺氧的培養(yǎng)基中的不良生長和絮凝現(xiàn)象，可以通過向培養(yǎng)基中添加多角甾醇和油酸使之發(fā)生改變，這表明氧氣通過影響不飽和脂肪和固醇的合成作用從而間接地影響酵母的絮凝[5]。因此，麥汁中適量的氧含量對于酵母絮凝性具有重要作用。

2.2 酵母

絮凝現(xiàn)象是酵母本身固有的一種特性，不同類型酵母細(xì)胞之間遺傳基因、細(xì)胞結(jié)構(gòu)等均存在差異，因此導(dǎo)致不同種類的酵母之間絮凝性不同。一般情況下，母細(xì)胞比新生酵母細(xì)胞更容易發(fā)生絮凝。這是因為母細(xì)胞可以產(chǎn)生絮凝素，并且在母細(xì)胞繁殖幾代之后，細(xì)胞表面褶皺增多，更容易發(fā)生凝聚現(xiàn)象[13-17]。新生細(xì)胞生長繁殖活力旺盛，不易絮凝。

Speers等[18]研究表明，絮凝開始時酵母細(xì)胞表面疏水性（CSH）和表面電荷發(fā)生變化，即在絮凝開始時，細(xì)胞表面疏水性增加、電荷減少。據(jù)報道，隨著細(xì)胞到達(dá)指數(shù)生長期，細(xì)胞表面的疏水性迅速增加，并在酵母細(xì)胞的穩(wěn)定期達(dá)到較高的穩(wěn)定水平[19]。指數(shù)生長期的子細(xì)胞較小，因而細(xì)胞表面疏水性低，這些子細(xì)胞的疏水性明顯低于老細(xì)胞[20]。細(xì)胞表面疏水性在保持絮凝分子的正確構(gòu)象方面起重要作用[21]，使穩(wěn)定期的絮凝分子更加有活力。與拉格酵母細(xì)胞相比，艾爾酵母細(xì)胞具有更系統(tǒng)的疏水性，且負(fù)電荷少[22]。除了有助于形成絮凝物之外，艾爾酵母細(xì)胞疏水性更大的現(xiàn)象可能解釋了為什么在傳統(tǒng)的啤酒發(fā)酵過程中啤酒菌株的絮凝物與CO2氣泡有關(guān)，并上升到啤酒表面，而拉格酵母菌株的絮凝物則下沉到底部[23]。在許多現(xiàn)代釀酒廠，艾爾酵母菌株也沉入大型圓錐形發(fā)酵容器（CCV）的發(fā)酵底部。在大型圓錐形發(fā)酵罐中，較大的靜水壓力可能會限制附著在酵母絮凝物上CO2氣泡的大小，增加的湍流可能會使CO2氣泡從絮凝物上分離，但也可能有意或無意選擇艾爾酵母細(xì)胞的沉淀突變體，以便于從底部進(jìn)行回收。

在啤酒釀造過程中，掌握好酵母添加量對于保持酵母菌種的優(yōu)良性狀和保持啤酒發(fā)酵的順利進(jìn)行至關(guān)重要。添加過多酵母，會使得麥汁中α-氮被迅速同化，導(dǎo)致酵母在發(fā)酵后期缺乏充足的營養(yǎng)物質(zhì)，造成降糖和還原雙乙酰困難，影響酵母細(xì)胞的絮凝性；添加過少的酵母，會使得起發(fā)慢，pH下降速度減慢，形成大量高級醇，且發(fā)酵液容易感染雜菌，造成酵母絮凝性變差。

在酵母細(xì)胞的傳代過程中絮凝性會發(fā)生變化。一般來說，前幾代酵母往往絮凝性弱于高代酵母，但是過高的代數(shù)又會導(dǎo)致酵母絮凝性降低。有研究表明，酵母傳代增加酵母絮凝性的因素有2個：（1）酵母細(xì)胞的使用代數(shù)增加，改變酵母細(xì)胞壁的某些功能；（2）酵母細(xì)胞在傳代過程中基因突變頻率高，從而導(dǎo)致絮凝的FLO1、FLO5、Lg-FLO1基因的突變頻率增加，導(dǎo)致絮凝概率增加[24]。

酵母在發(fā)酵罐中要遵循一定的沉降規(guī)律，因此回收酵母時，要按照“掐頭去尾取中間”原則。先沉降下來的多為衰老或死亡的活性較差的酵母細(xì)胞，還混有大量冷凝固物及沉渣雜質(zhì)，絮凝性較差；中層為發(fā)酵指數(shù)期的酵母，活力和發(fā)酵能力最強，凝聚性較好；上層大多數(shù)是輕質(zhì)酵母，主要由落下的泡蓋和最后沉降下來的酵母細(xì)胞組成，活性差，沉降后其中混有蛋白質(zhì)、酒花樹脂等析出物和雜質(zhì)，絮凝性不及中層酵母[25]。

此外，酵母的共絮凝也會影響絮凝現(xiàn)象。Stewart等[26]研究表明，Labatt啤酒廠艾爾酵母是兩種酵母的混合物，單獨在麥汁中培養(yǎng)時，這2種酵母是非絮凝狀的，但這2種酵母在接種數(shù)量相等的麥汁中，發(fā)酵結(jié)束時酵母絮凝效果良好。因此，共絮凝可以促進(jìn)絮凝現(xiàn)象發(fā)生。

2.3 理化指標(biāo)

pH能改變酵母細(xì)胞表面的帶電狀態(tài)，從而影響酵母細(xì)胞之間相互碰撞概率，增加氫離子濃度可以降低細(xì)胞表面所帶電荷。pH越接近酵母細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)等電點，越有利于絮凝現(xiàn)象的發(fā)生[27]。因此發(fā)酵液pH 4.2～4.7時，酵母絮凝性最好。

溫度也是影響酵母絮凝性的重要因素。發(fā)酵液中溫度過低時，酵母繁殖速度慢，起發(fā)延緩，發(fā)酵液容易感染細(xì)菌；溫度過高時，酵母繁殖速度快，加快菌種退化速度，易造成酵母衰老、死亡，絮凝性高。對于不同的酵母的最適溫度有所不同，因此，對于酵母絮凝的最佳溫度并沒有確定的說法。

2.4 其他物質(zhì)

Jin等[29]研究表明，增加酒精體積分?jǐn)?shù)能夠提高細(xì)胞表面疏水性，使絮凝速度增加。在一定程度上，乙醇是有機溶劑，可溶于水，能改變?nèi)芤航殡姵?shù)，局部介電常數(shù)的改變會降低細(xì)胞間電荷排斥力，暴露細(xì)胞表面疏水位點，增加細(xì)胞間相互作用，促進(jìn)酵母的絮凝作用[30]。但是單連菊等[31]研究表明，酒精含量在2%以下時，絮凝性變化不大。超過這個范圍后，隨著酒精含量升高，酵母絮凝性明顯減弱。

高濃度的尿素是一種蛋白質(zhì)變性劑，可以直接作用于蛋白質(zhì)分子，減少細(xì)胞間相互疏水作用，改變氫鍵穩(wěn)定性，通常用于檢測蛋白質(zhì)可逆展開構(gòu)象穩(wěn)定性[30]。尿素對絮凝現(xiàn)象的抑制作用是暫時的，去除后可恢復(fù)絮凝能力。這一現(xiàn)象說明尿素通過可逆反應(yīng)改變酶絮凝素分子構(gòu)象，可使酵母喪失絮凝能力。但是，酵母細(xì)胞在高濃度尿素的緩沖液中過夜后，酶絮凝素分子發(fā)生變性，不能再恢復(fù)其原有絮凝能力[7]。

甲基-α-D-吡喃甘露糖苷（α-MMP）是甘露糖的疏水性衍生物。α-MMP可與酵母甘露聚糖的末端甘露聚糖殘基競爭酶絮凝素受體，抑制酵母絮凝素的疏水性而對酵母絮凝產(chǎn)生抑制作用[30]。

2.5 微生物污染

啤酒釀造過程中的雜菌主要有乳酸菌、野生酵母，其中感染野生酵母會使得菌種退化、死亡甚至出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，造成酵母提前絮凝，而乳酸菌會引起啤酒酵母的異常絮凝。微生物污染會使啤酒中帶有不良風(fēng)味，通過嚴(yán)格控制釀造過程的生理衛(wèi)生條件可防治微生物污染。

3 酵母絮凝對啤酒品質(zhì)和風(fēng)味的影響

在啤酒的工業(yè)生產(chǎn)活動中，啤酒酵母在發(fā)酵結(jié)束時絮凝有利于酵母的回收和發(fā)酵液的澄清過程。但是正常生產(chǎn)實踐中存在2種不正常絮凝現(xiàn)象：在發(fā)酵液未發(fā)酵完全時提前絮凝；發(fā)酵結(jié)束后酵母不絮凝。不論是哪種情況發(fā)生，都會影響啤酒品質(zhì)和風(fēng)味。

首先，絮凝會影響啤酒酵母的回收和再利用過程。絮凝性差的酵母往往會懸浮在發(fā)酵液當(dāng)中，沉降速度慢，不利于酵母的回收和再次利用。酵母長時間懸浮在發(fā)酵液中易發(fā)生自溶和突變現(xiàn)象，自溶現(xiàn)象使得成品啤酒中帶有酵母味，口感變差；突變現(xiàn)象則會使酵母細(xì)胞向不確定的方向發(fā)生變異，使啤酒的穩(wěn)定性變差。而且回收后的酵母活力變差，下次使用時易引起發(fā)酵不完全等現(xiàn)象。

其次，絮凝性強的酵母可能會在發(fā)酵完成前凝集成團(tuán)而后懸浮于發(fā)酵液頂部或沉降于發(fā)酵液底部，使得發(fā)酵液中懸浮酵母細(xì)胞數(shù)量減少，減緩發(fā)酵速度；將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成乙醇能力降低，發(fā)酵度較低；雙乙酰的還原速度較慢，延長工藝生產(chǎn)時間。絮凝性差的酵母在經(jīng)過低溫儲存后仍有大部分酵母細(xì)胞懸浮在啤酒中，易造成酒體渾濁、清酒過濾困難，增加分離酵母時所耗能源，增加啤酒損失[32]。

此外，絮凝性不同的酵母所釀造的啤酒中高級醇、揮發(fā)酯等風(fēng)味物質(zhì)的形成量和組成成分均存在顯著性差異，從而影響啤酒風(fēng)味。絮凝性過強的酵母會提前絮凝，使酵母降糖不完全，雙乙酰還原不完全，發(fā)酵度低，啤酒口感偏甜[33]；絮凝性差的酵母易懸浮在發(fā)酵液中產(chǎn)生自溶現(xiàn)象，在啤酒中產(chǎn)生自溶味、酵母味或者老化味，使啤酒風(fēng)味變差。

4 改善酵母絮凝性的途徑

選用品質(zhì)優(yōu)良的大麥原料[34]；保證麥汁中Ca2+濃度控制在合理范圍內(nèi)，建議釀造水中Ca2+濃度控制在100×10-6mol/L左右，麥汁中Ca2+合理濃度范圍。在60×10-6～100×10-6mol/L，啤酒中Ca2+合理濃度范圍在25×10-6～50×10-6mol/L[35]；保持麥汁中充足的麥芽糖、葡萄糖含量及α-N含量，使其在最適范圍內(nèi)；通過流量計穩(wěn)定控制麥汁充氧量6～10 mg/L[36]；制麥過程是控制PYF因子的重要環(huán)節(jié)，因為此階段大麥發(fā)芽所需的水分、溫度和空氣等，恰好為微生物的生長繁殖提供良好條件[37]。用基因工程手段改善酵母的絮凝性，培育絮凝性良好的酵母菌株[38]；采用10 ℃低溫進(jìn)行純種酵母擴培，有利于增加零代酵母的絮凝性。采用25 ℃高溫進(jìn)行純種酵母擴培，在培養(yǎng)的麥汁中添加鋅離子進(jìn)行酵母擴培，可使零代酵母具有較好絮凝性[39]；發(fā)酵過程用溫控裝備保持溫度恒定，防止忽高忽低；生產(chǎn)過程中不使用雜菌污染的原料、酵母和釀造水等。定期清洗發(fā)酵裝置，防止產(chǎn)生雜菌污染。

5 展望

酵母絮凝是影響啤酒風(fēng)味和品質(zhì)的重要因素之一，引起國內(nèi)外各大啤酒廠廣泛關(guān)注。但在實際生產(chǎn)中，酵母絮凝性往往會同時受麥芽及麥汁組成、酵母、理化指標(biāo)等多種因素共同影響，因此對影響酵母絮凝性因素相互作用機理的進(jìn)一步研究，是未來發(fā)展方向，期望在工業(yè)生產(chǎn)中酵母絮凝得到更好控制。