崔云前，襲祥雨，吉春暉，杜俊杰

齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（濟(jì)南 250353）

酵母絮凝是啤酒酵母的一項(xiàng)重要特性，對(duì)于釀造啤酒具有極其重要意義。1976年，法國(guó)的Louis Pasteur在研究啤酒酵母時(shí)發(fā)現(xiàn)其存在這方面性狀[1]。酵母絮凝是酵母細(xì)胞在發(fā)酵液中由發(fā)散的懸浮狀態(tài)聚集成團(tuán)然后快速沉降的一種現(xiàn)象。絮凝是啤酒發(fā)酵過(guò)程中酵母細(xì)胞大量沉淀的前提條件，因此絮凝特性的改變通常意味著沉淀現(xiàn)象的變化。在發(fā)酵過(guò)程中，絮凝時(shí)機(jī)非常重要。在麥汁發(fā)酵完全之前，不應(yīng)過(guò)早發(fā)生絮凝，因?yàn)檫^(guò)早絮凝會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵遲緩或停滯，最終的啤酒含有高殘留糖和令人不滿意的風(fēng)味特征。相反，啤酒發(fā)酵快結(jié)束時(shí)，大量酵母細(xì)胞凝聚，結(jié)團(tuán)后沉降過(guò)程有助于發(fā)酵液澄清。啤酒酵母菌種類不同，生理特性不同，因而絮凝性存在巨大差異。

1 絮凝的機(jī)理

國(guó)內(nèi)外對(duì)于啤酒酵母絮凝性的研究有數(shù)百年歷史，但對(duì)于啤酒酵母絮凝機(jī)理的復(fù)雜性，還沒(méi)有得出準(zhǔn)確定論。根據(jù)對(duì)已有研究的總結(jié)，啤酒酵母絮凝的機(jī)理主要有幾種假說(shuō)。

1.1 鈣橋假說(shuō)

Ca2+存在時(shí)，相鄰的酵母細(xì)胞間通過(guò)細(xì)胞外壁的羧基與之相連，形成細(xì)胞的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而絮凝沉降下來(lái)[2]。這個(gè)假說(shuō)沒(méi)能解釋清楚絮凝過(guò)程中出現(xiàn)糖抑制現(xiàn)象和細(xì)胞間特異性相互作用。

1.2 外源絮凝素假說(shuō)

有些酵母細(xì)胞表面帶有絮凝素，貼近細(xì)胞壁并且選擇性地結(jié)合相鄰酵母細(xì)胞壁上的甘露糖殘基，Ca2+在其中起到激活絮凝素作用。發(fā)酵液中的游離甘露糖占據(jù)絮凝素結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，絮凝素便不能再與細(xì)胞壁上的甘露糖殘基相結(jié)合。有些不含有絮凝素的酵母也能發(fā)生絮凝現(xiàn)象，原因是其含有與絮凝素結(jié)構(gòu)相似的絮凝劑[3]。只在絮凝性酵母上發(fā)現(xiàn)過(guò)絮凝供體，且該物質(zhì)對(duì)蛋白酶敏感；絮凝受體在絮凝性酵母及非絮凝性酵母上都存在，對(duì)蛋白酶不敏感，且受甘露糖的專一性抑制。絮凝性酵母和非絮凝性酵母都可以合成絮凝素，兩者差別在于絮凝性酵母在其生長(zhǎng)過(guò)程中可以連續(xù)合成并釋放絮凝素，而非絮凝性酵母則不具備這一特性[4]。因此，酵母的絮凝性取決于絮凝素能否被釋放。

1.3 基因調(diào)控假說(shuō)

酵母細(xì)胞的絮凝基因是FLO1、FLO2、FLO4、FLO11和Lg-FLO1，此外FLO5、FLO9基因與FLO1基因具有高度同源性，它們表達(dá)的絮凝素也會(huì)使得釀酒酵母發(fā)生絮凝現(xiàn)象[5]。其中，F(xiàn)LO1、FLO5、FLO9基因控制細(xì)胞與細(xì)胞間具有相互黏附作用，使Lg-FLO1基因編碼絮凝素與甘露聚糖結(jié)合。絮凝基因活躍表達(dá)時(shí)會(huì)產(chǎn)生絮凝素，從而導(dǎo)致酵母發(fā)生絮凝現(xiàn)象。但是由于調(diào)節(jié)絮凝的基因家族數(shù)量較多，且十分不穩(wěn)定，每一個(gè)基因都具有復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制，并且受外界環(huán)境的影響比較大。不同種類的酵母絮凝基因的不穩(wěn)定和差異等因素都會(huì)造成絮凝困難。

2 影響酵母絮凝性的因素

2.1 麥芽及麥汁組成

麥芽中含有酵母超前絮凝（PYF）因子，可以造成酵母提前絮凝。麥芽的PYF因子對(duì)啤酒酵母的絮凝性影響較大，PYF因子活力越低，酵母絮凝性越小，反之PYF因子活力越高，酵母絮凝性越強(qiáng)[6]。PYF因子大小受大麥品種、品質(zhì)、制麥等過(guò)程中微生物污染的影響。Jibiki等[7]認(rèn)為在制麥前對(duì)大麥進(jìn)行清洗，有助于減緩PYF因子對(duì)酵母絮凝的影響，因?yàn)槎鄶?shù)PYF因子附著在大麥表面且溶于水，提前絮凝會(huì)造成麥汁中糖的降解速度減慢，利用率降低，發(fā)酵不徹底。

麥汁中的糖為酵母提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這些成分缺乏時(shí)，會(huì)使得酵母細(xì)胞表面的疏水性增強(qiáng)，進(jìn)而誘導(dǎo)酵母細(xì)胞發(fā)生絮凝現(xiàn)象。周波等[8]研究表明，麥汁濃度越高，酵母細(xì)胞就越難凝聚，尤其是在含高濃度葡萄糖的麥汁中，酵母不易絮凝；但在含高濃度麥芽糖的麥汁中，酵母絮凝容易絮凝。葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖均可抑制酵母絮凝，且三者之中葡萄糖抑制作用最低。

麥汁中的氨基酸可為酵母生長(zhǎng)繁殖提供氮源，因而對(duì)酵母絮凝有重要作用。麥汁中氨基酸含量不足時(shí)，酵母繁殖缺乏充足的可同化氮，繁殖速度會(huì)降低，新生細(xì)胞數(shù)目減少，從而導(dǎo)致酵母絮凝速度降低[9]。大米等輔料的存在，使得麥汁中可同化氮數(shù)量減少，也會(huì)從不同程度上減緩絮凝速度。

麥汁中金屬離子含量對(duì)酵母絮凝也有重要影響，特別是Ca2+濃度的大小對(duì)酵母絮凝性影響十分顯著[10]。Ca2+與細(xì)胞表面的羧基基團(tuán)相互作用可以產(chǎn)生“鈣橋效應(yīng)”，有利于酵母絮凝。它還是酵母健康生長(zhǎng)必需的礦物質(zhì)元素之一，是參加酵母代謝活動(dòng)所必需的，它雖然不直接參與酵母細(xì)胞的物質(zhì)組成，但是能以離子狀態(tài)控制細(xì)胞生理狀態(tài)[11]。另外Ca2+還會(huì)受其他同系物的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。此外，除了Ca2+外，Zn2+、Mg2+也可促進(jìn)酵母絮凝作用，但Ba2+、Pb2+、Na+、K+會(huì)抑制酵母的絮凝作用[28]，這些金屬離子對(duì)酵母絮凝的影響機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

由于酵母是兼性厭氧微生物，所以在有氧和無(wú)氧的環(huán)境下都能生存。麥汁中溶解氧含量不足時(shí)，新生健壯的酵母細(xì)胞數(shù)量減少，衰老、死亡的酵母細(xì)胞數(shù)量增多，從而使得酵母細(xì)胞的增殖率下降[12]，最終導(dǎo)致酵母過(guò)早但不完全絮凝；溶解氧含量過(guò)多時(shí)，酵母增殖速度加快，加快發(fā)酵速度，影響酵母細(xì)胞的正常代謝，加快細(xì)胞衰老或死亡速率，使得酵母提前絮凝。酵母在缺氧的培養(yǎng)基中的不良生長(zhǎng)和絮凝現(xiàn)象，可以通過(guò)向培養(yǎng)基中添加多角甾醇和油酸使之發(fā)生改變，這表明氧氣通過(guò)影響不飽和脂肪和固醇的合成作用從而間接地影響酵母的絮凝[5]。因此，麥汁中適量的氧含量對(duì)于酵母絮凝性具有重要作用。

2.2 酵母

絮凝現(xiàn)象是酵母本身固有的一種特性，不同類型酵母細(xì)胞之間遺傳基因、細(xì)胞結(jié)構(gòu)等均存在差異，因此導(dǎo)致不同種類的酵母之間絮凝性不同。一般情況下，母細(xì)胞比新生酵母細(xì)胞更容易發(fā)生絮凝。這是因?yàn)槟讣?xì)胞可以產(chǎn)生絮凝素，并且在母細(xì)胞繁殖幾代之后，細(xì)胞表面褶皺增多，更容易發(fā)生凝聚現(xiàn)象[13-17]。新生細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖活力旺盛，不易絮凝。

Speers等[18]研究表明，絮凝開始時(shí)酵母細(xì)胞表面疏水性（CSH）和表面電荷發(fā)生變化，即在絮凝開始時(shí)，細(xì)胞表面疏水性增加、電荷減少。據(jù)報(bào)道，隨著細(xì)胞到達(dá)指數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞表面的疏水性迅速增加，并在酵母細(xì)胞的穩(wěn)定期達(dá)到較高的穩(wěn)定水平[19]。指數(shù)生長(zhǎng)期的子細(xì)胞較小，因而細(xì)胞表面疏水性低，這些子細(xì)胞的疏水性明顯低于老細(xì)胞[20]。細(xì)胞表面疏水性在保持絮凝分子的正確構(gòu)象方面起重要作用[21]，使穩(wěn)定期的絮凝分子更加有活力。與拉格酵母細(xì)胞相比，艾爾酵母細(xì)胞具有更系統(tǒng)的疏水性，且負(fù)電荷少[22]。除了有助于形成絮凝物之外，艾爾酵母細(xì)胞疏水性更大的現(xiàn)象可能解釋了為什么在傳統(tǒng)的啤酒發(fā)酵過(guò)程中啤酒菌株的絮凝物與CO2氣泡有關(guān)，并上升到啤酒表面，而拉格酵母菌株的絮凝物則下沉到底部[23]。在許多現(xiàn)代釀酒廠，艾爾酵母菌株也沉入大型圓錐形發(fā)酵容器（CCV）的發(fā)酵底部。在大型圓錐形發(fā)酵罐中，較大的靜水壓力可能會(huì)限制附著在酵母絮凝物上CO2氣泡的大小，增加的湍流可能會(huì)使CO2氣泡從絮凝物上分離，但也可能有意或無(wú)意選擇艾爾酵母細(xì)胞的沉淀突變體，以便于從底部進(jìn)行回收。

在啤酒釀造過(guò)程中，掌握好酵母添加量對(duì)于保持酵母菌種的優(yōu)良性狀和保持啤酒發(fā)酵的順利進(jìn)行至關(guān)重要。添加過(guò)多酵母，會(huì)使得麥汁中α-氮被迅速同化，導(dǎo)致酵母在發(fā)酵后期缺乏充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，造成降糖和還原雙乙酰困難，影響酵母細(xì)胞的絮凝性；添加過(guò)少的酵母，會(huì)使得起發(fā)慢，pH下降速度減慢，形成大量高級(jí)醇，且發(fā)酵液容易感染雜菌，造成酵母絮凝性變差。

在酵母細(xì)胞的傳代過(guò)程中絮凝性會(huì)發(fā)生變化。一般來(lái)說(shuō)，前幾代酵母往往絮凝性弱于高代酵母，但是過(guò)高的代數(shù)又會(huì)導(dǎo)致酵母絮凝性降低。有研究表明，酵母?jìng)鞔黾咏湍感跄缘囊蛩赜?個(gè)：（1）酵母細(xì)胞的使用代數(shù)增加，改變酵母細(xì)胞壁的某些功能；（2）酵母細(xì)胞在傳代過(guò)程中基因突變頻率高，從而導(dǎo)致絮凝的FLO1、FLO5、Lg-FLO1基因的突變頻率增加，導(dǎo)致絮凝概率增加[24]。

酵母在發(fā)酵罐中要遵循一定的沉降規(guī)律，因此回收酵母時(shí)，要按照“掐頭去尾取中間”原則。先沉降下來(lái)的多為衰老或死亡的活性較差的酵母細(xì)胞，還混有大量冷凝固物及沉渣雜質(zhì)，絮凝性較差；中層為發(fā)酵指數(shù)期的酵母，活力和發(fā)酵能力最強(qiáng)，凝聚性較好；上層大多數(shù)是輕質(zhì)酵母，主要由落下的泡蓋和最后沉降下來(lái)的酵母細(xì)胞組成，活性差，沉降后其中混有蛋白質(zhì)、酒花樹脂等析出物和雜質(zhì)，絮凝性不及中層酵母[25]。

此外，酵母的共絮凝也會(huì)影響絮凝現(xiàn)象。Stewart等[26]研究表明，Labatt啤酒廠艾爾酵母是兩種酵母的混合物，單獨(dú)在麥汁中培養(yǎng)時(shí)，這2種酵母是非絮凝狀的，但這2種酵母在接種數(shù)量相等的麥汁中，發(fā)酵結(jié)束時(shí)酵母絮凝效果良好。因此，共絮凝可以促進(jìn)絮凝現(xiàn)象發(fā)生。

2.3 理化指標(biāo)

pH能改變酵母細(xì)胞表面的帶電狀態(tài)，從而影響酵母細(xì)胞之間相互碰撞概率，增加氫離子濃度可以降低細(xì)胞表面所帶電荷。pH越接近酵母細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，越有利于絮凝現(xiàn)象的發(fā)生[27]。因此發(fā)酵液pH 4.2～4.7時(shí)，酵母絮凝性最好。

溫度也是影響酵母絮凝性的重要因素。發(fā)酵液中溫度過(guò)低時(shí)，酵母繁殖速度慢，起發(fā)延緩，發(fā)酵液容易感染細(xì)菌；溫度過(guò)高時(shí)，酵母繁殖速度快，加快菌種退化速度，易造成酵母衰老、死亡，絮凝性高。對(duì)于不同的酵母的最適溫度有所不同，因此，對(duì)于酵母絮凝的最佳溫度并沒(méi)有確定的說(shuō)法。

2.4 其他物質(zhì)

Jin等[29]研究表明，增加酒精體積分?jǐn)?shù)能夠提高細(xì)胞表面疏水性，使絮凝速度增加。在一定程度上，乙醇是有機(jī)溶劑，可溶于水，能改變?nèi)芤航殡姵?shù)，局部介電常數(shù)的改變會(huì)降低細(xì)胞間電荷排斥力，暴露細(xì)胞表面疏水位點(diǎn)，增加細(xì)胞間相互作用，促進(jìn)酵母的絮凝作用[30]。但是單連菊等[31]研究表明，酒精含量在2%以下時(shí)，絮凝性變化不大。超過(guò)這個(gè)范圍后，隨著酒精含量升高，酵母絮凝性明顯減弱。

高濃度的尿素是一種蛋白質(zhì)變性劑，可以直接作用于蛋白質(zhì)分子，減少細(xì)胞間相互疏水作用，改變氫鍵穩(wěn)定性，通常用于檢測(cè)蛋白質(zhì)可逆展開構(gòu)象穩(wěn)定性[30]。尿素對(duì)絮凝現(xiàn)象的抑制作用是暫時(shí)的，去除后可恢復(fù)絮凝能力。這一現(xiàn)象說(shuō)明尿素通過(guò)可逆反應(yīng)改變酶絮凝素分子構(gòu)象，可使酵母喪失絮凝能力。但是，酵母細(xì)胞在高濃度尿素的緩沖液中過(guò)夜后，酶絮凝素分子發(fā)生變性，不能再恢復(fù)其原有絮凝能力[7]。

甲基-α-D-吡喃甘露糖苷（α-MMP）是甘露糖的疏水性衍生物。α-MMP可與酵母甘露聚糖的末端甘露聚糖殘基競(jìng)爭(zhēng)酶絮凝素受體，抑制酵母絮凝素的疏水性而對(duì)酵母絮凝產(chǎn)生抑制作用[30]。

2.5 微生物污染

啤酒釀造過(guò)程中的雜菌主要有乳酸菌、野生酵母，其中感染野生酵母會(huì)使得菌種退化、死亡甚至出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，造成酵母提前絮凝，而乳酸菌會(huì)引起啤酒酵母的異常絮凝。微生物污染會(huì)使啤酒中帶有不良風(fēng)味，通過(guò)嚴(yán)格控制釀造過(guò)程的生理衛(wèi)生條件可防治微生物污染。

3 酵母絮凝對(duì)啤酒品質(zhì)和風(fēng)味的影響

在啤酒的工業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)中，啤酒酵母在發(fā)酵結(jié)束時(shí)絮凝有利于酵母的回收和發(fā)酵液的澄清過(guò)程。但是正常生產(chǎn)實(shí)踐中存在2種不正常絮凝現(xiàn)象：在發(fā)酵液未發(fā)酵完全時(shí)提前絮凝；發(fā)酵結(jié)束后酵母不絮凝。不論是哪種情況發(fā)生，都會(huì)影響啤酒品質(zhì)和風(fēng)味。

首先，絮凝會(huì)影響啤酒酵母的回收和再利用過(guò)程。絮凝性差的酵母往往會(huì)懸浮在發(fā)酵液當(dāng)中，沉降速度慢，不利于酵母的回收和再次利用。酵母長(zhǎng)時(shí)間懸浮在發(fā)酵液中易發(fā)生自溶和突變現(xiàn)象，自溶現(xiàn)象使得成品啤酒中帶有酵母味，口感變差；突變現(xiàn)象則會(huì)使酵母細(xì)胞向不確定的方向發(fā)生變異，使啤酒的穩(wěn)定性變差。而且回收后的酵母活力變差，下次使用時(shí)易引起發(fā)酵不完全等現(xiàn)象。

其次，絮凝性強(qiáng)的酵母可能會(huì)在發(fā)酵完成前凝集成團(tuán)而后懸浮于發(fā)酵液頂部或沉降于發(fā)酵液底部，使得發(fā)酵液中懸浮酵母細(xì)胞數(shù)量減少，減緩發(fā)酵速度；將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成乙醇能力降低，發(fā)酵度較低；雙乙酰的還原速度較慢，延長(zhǎng)工藝生產(chǎn)時(shí)間。絮凝性差的酵母在經(jīng)過(guò)低溫儲(chǔ)存后仍有大部分酵母細(xì)胞懸浮在啤酒中，易造成酒體渾濁、清酒過(guò)濾困難，增加分離酵母時(shí)所耗能源，增加啤酒損失[32]。

此外，絮凝性不同的酵母所釀造的啤酒中高級(jí)醇、揮發(fā)酯等風(fēng)味物質(zhì)的形成量和組成成分均存在顯著性差異，從而影響啤酒風(fēng)味。絮凝性過(guò)強(qiáng)的酵母會(huì)提前絮凝，使酵母降糖不完全，雙乙酰還原不完全，發(fā)酵度低，啤酒口感偏甜[33]；絮凝性差的酵母易懸浮在發(fā)酵液中產(chǎn)生自溶現(xiàn)象，在啤酒中產(chǎn)生自溶味、酵母味或者老化味，使啤酒風(fēng)味變差。

4 改善酵母絮凝性的途徑

選用品質(zhì)優(yōu)良的大麥原料[34]；保證麥汁中Ca2+濃度控制在合理范圍內(nèi)，建議釀造水中Ca2+濃度控制在100×10-6mol/L左右，麥汁中Ca2+合理濃度范圍。在60×10-6～100×10-6mol/L，啤酒中Ca2+合理濃度范圍在25×10-6～50×10-6mol/L[35]；保持麥汁中充足的麥芽糖、葡萄糖含量及α-N含量，使其在最適范圍內(nèi)；通過(guò)流量計(jì)穩(wěn)定控制麥汁充氧量6～10 mg/L[36]；制麥過(guò)程是控制PYF因子的重要環(huán)節(jié)，因?yàn)榇穗A段大麥發(fā)芽所需的水分、溫度和空氣等，恰好為微生物的生長(zhǎng)繁殖提供良好條件[37]。用基因工程手段改善酵母的絮凝性，培育絮凝性良好的酵母菌株[38]；采用10 ℃低溫進(jìn)行純種酵母擴(kuò)培，有利于增加零代酵母的絮凝性。采用25 ℃高溫進(jìn)行純種酵母擴(kuò)培，在培養(yǎng)的麥汁中添加鋅離子進(jìn)行酵母擴(kuò)培，可使零代酵母具有較好絮凝性[39]；發(fā)酵過(guò)程用溫控裝備保持溫度恒定，防止忽高忽低；生產(chǎn)過(guò)程中不使用雜菌污染的原料、酵母和釀造水等。定期清洗發(fā)酵裝置，防止產(chǎn)生雜菌污染。

5 展望

酵母絮凝是影響啤酒風(fēng)味和品質(zhì)的重要因素之一，引起國(guó)內(nèi)外各大啤酒廠廣泛關(guān)注。但在實(shí)際生產(chǎn)中，酵母絮凝性往往會(huì)同時(shí)受麥芽及麥汁組成、酵母、理化指標(biāo)等多種因素共同影響，因此對(duì)影響酵母絮凝性因素相互作用機(jī)理的進(jìn)一步研究，是未來(lái)發(fā)展方向，期望在工業(yè)生產(chǎn)中酵母絮凝得到更好控制。