楊 陽 高文雅 陶仕英 牛建昭 趙丕文 王燕霞 饒晨晨 楊 蕾

乳腺癌是常見的女性惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)生率和病死率呈不斷上升的趨勢，嚴重影響女性的身心健康[1]。研究表明，乳腺癌的發(fā)生與雌激素的刺激密切相關(guān)，降低患者體內(nèi)雌激素水平可以抑制腫瘤生長[2]。臨床多采用手術(shù)切除、放療、化療等治療方法,但這些治療方法對患者的身體均存在不同程度的損害，因此，尋找有效治療腫瘤且不良反應小的抗腫瘤藥物成為近年來研究的一個重要方向。紫草素(shikonin，SK)是一種萘醌類化合物，從中藥紫草的根中提取，是紫草主要的有效成分?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)紫草素還具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用[3]。

雌激素信號通路在調(diào)節(jié)乳腺癌細胞增殖和凋亡中發(fā)揮著重要作用,ERα是雌激素信號通路中的關(guān)鍵因子[4，5]。多項研究表明，cyclin D1是可能受雌激素影響的重要細胞周期調(diào)控蛋白之一, ERα的促有絲分裂作用能夠促進細胞和動物組織中細胞周期調(diào)節(jié)蛋白cyclin D1的表達[6，7]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)SK干預后通過調(diào)節(jié)cyclin D1周期蛋白可影響人宮頸癌SiHa細胞的周期，誘導細胞G0/G1期阻滯，MCF-7是ER陽性乳腺癌細胞，雌激素具有促進ER 陽性腫瘤增殖的作用[8，9]。本實驗模擬雌激素存在的體內(nèi)環(huán)境，研究SK對MCF-7細胞周期蛋白D1的影響。

材料與方法

1.藥物：左旋紫草素購自中國食品藥品檢定研究所。原藥品用無水乙醇作為溶劑配制，最終稀釋濃度至(1×10-8)～(1×10-6)mol/L。陽性對照組雌二醇(estrodiol，E2)購自美國Sigma公司，用無水乙醇配制，最終稀釋濃度為1×10-8mol/L[10]。

2.材料：高糖DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；RPMI 1640 Medium(ATCC Modification，美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；活性炭-葡聚糖苷處理的胎牛血清(CDT-FBS，美國Hyclone公司)；0.05%胰蛋白酶(美國Invitrogen公司)；MTT(美國Sigma 公司)；DMSO(美國Sigma 公司)；Cyclin D1抗體(美國Proteintech公司)。

3.細胞培養(yǎng)：人乳腺癌MCF-7細胞購自北京協(xié)和醫(yī)學院細胞中心。在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基溶液中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5% CO2的培養(yǎng)箱，保持37℃恒溫及相對飽和濕度。每隔3～4天進行傳代，實驗開始前4天用PBS洗滌，洗滌后改用無酚紅DMEM(含5% CDT-FBS)培養(yǎng)液培養(yǎng)，使細胞對雌激素樣物質(zhì)的敏感度增加，同時可以減少來自細胞自身的雌激素對實驗結(jié)果的干擾。細胞生長達到80%融合時，進行消化傳代，選擇對數(shù)生長期的細胞實驗。實驗分為空白對照組、紫草素處理組(SK組，1×10-6mol/L、1×10-7mol/L和1×10-8mol/L)、雌二醇處理組(E2組，1×10-8mol/L)。

4.免疫組織化學技術(shù)檢測cyclin D1蛋白表達：MCF-7細胞消化后計數(shù)，以5×104個/毫升的細胞密度接種至24孔板。待細胞貼壁后，換含有1×10-8mol/L雌二醇和1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L SK的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48h后終止。吸去各孔培養(yǎng)基，每孔加入1ml PBS清洗3min×2次后，加入100μl的4%多聚甲醛固定20min，PBS清洗3min×3次；加入0.01%的Triton 于37℃恒溫箱搖勻，孵育20min，PBS清洗3min×3次；加入0.3%的過氧化氫甲醇溶液，孵育10min，PBS清洗3min×3次；使用免疫組化試劑盒血清工作液進行封閉，20min后甩去；滴加一抗，冰箱4℃孵育，過夜后取出，用PBS沖洗5min；滴加二抗，37℃恒溫箱孵育15min，PBS沖洗5min×3次；滴加辣根酶標記鏈霉素卵白素工作液，室溫孵育15min，PBS沖洗5min×3次；DAB染色，避光放置10min，鏡下觀察，自來水沖洗后用蘇木素復染10s，迅速沖洗。置于倒置顯微鏡下拍片，拍照前每孔加入1ml的PBS避免細胞干燥， 400倍放大倍數(shù)每孔隨機選擇6個視野，使用免疫組化軟件Image pro plus進行灰度測量分析。

5．Western blot法檢測cyclin D1蛋白的表達：MCF-7細胞消化計數(shù)后，以5×104個/毫升的細胞密度接種至24孔板。細胞貼壁后，換含有1×10-8mol/L雌二醇和1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L SK的DMEM培養(yǎng)液。藥物作用48h后，在收集的細胞中加入細胞裂解液，12000×g離心5min，對上清液蛋白含量進行測定、分析。蛋白變性之后開始上樣，SDS-PAGE 電泳(濃縮膠80V，分離膠120V)，80V電壓轉(zhuǎn)膜75min。將PVDF膜置于5%的脫脂奶粉溶液中在37℃恒溫箱振搖1h封閉，分別加cyclin D1、GAPDH一抗，4℃冰箱孵育過夜。加二抗(HRP 標記)在37℃恒溫箱振搖1h后，將PVDF膜放入ECL混合液，在室溫條件下水平搖床孵育5min，最后進行X線片曝光，顯影、定影、掃描后，以GAPDH表達量為對照，Image pro plus軟件觀察分析結(jié)果，計算并統(tǒng)計各組灰度值。

結(jié) 果

1.免疫組織化學技術(shù)檢測cyclin D1蛋白表達：紫草素作用MCF-7細胞48h后， cyclin D1蛋白棕黃色顆粒在細胞質(zhì)和細胞核中有陽性表達。其中雌二醇組表達量與空白對照組比較顯著增多；與空白對照組比較，SK各組表達較少，呈淡棕色，且cyclin D1蛋白表達量隨著SK濃度的升高逐漸被抑制(P<0.05)，詳見圖1。

2.Western blot法檢測紫草素1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L不同濃度組對cyclin D1蛋白表達的作用：與空白對照組比較，紫草素作用MCF-7細胞48h后，3個藥物濃度組1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L顯著降低了cyclin D1的表達，并且隨著濃度的升高表達量逐漸降低，其中1×10-6mol/L紫草素對cyclin D1表達的抑制作用最強(P<0.01),詳見圖2。

圖2 紫草素作用后MCF-7細胞中cyclin D1蛋白的表達水平與空白對照組比較， *P<0.05， **P<0.01

3.Western blot法檢測紫草素在雌二醇環(huán)境下對cyclin D1蛋白表達的影響：與空白對照組比較，雌二醇干預后，cyclin D1的蛋白表達量有所提高；經(jīng)紫草素1×10-6mol/L單獨作用后，cyclin D1的蛋白表達含量有顯著降低(P<0.01)；雌二醇干預后，SK對cyclin D1蛋白量的表達同樣具有抑制作用(P<0.05)，詳見圖3。

圖3 紫草素對雌激素處理的MCF-7 cyclinD1蛋白表達的影響與空白對照組比較，*P<0.05, **P<0.01; E2+紫草素組;用1×10-8mol/L雌二醇處理后的SK組(1×10-6mol/L)組

討 論

乳腺癌是一種雌激素依賴性的惡性腫瘤,雌激素效應主要受ERα介導基因組途徑和非基因自途徑的調(diào)節(jié)，ERα在乳腺癌增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用，是一種經(jīng)典的核受體途徑[2]。研究發(fā)現(xiàn)，紫草素這種天然萘醌類化合物對ERα陽性表達的乳腺癌細胞具有抑制作用，但具體如何通過ERα信號通路發(fā)揮作用，還需要進一步研究和探討[11，12]。

本實驗結(jié)果顯示，作用MCF-7細胞48h后， SK各濃度組與空白對照組比較，顯著抑制了cyclin D1的表達，并且體現(xiàn)出濃度依賴性，即cyclin D1的表達量隨著SK濃度的升高逐漸降低，其中1×10-6mol/L紫草素對cyclin D1表達的抑制作用最強(P<0.01)。同時，為了進一步完善此實驗，探究在人體內(nèi)雌激素作用條件下SK是否對乳腺癌還具有相同的抑制作用，本實驗利用雌二醇模擬體內(nèi)雌激素環(huán)境，探究雌二醇干預后，SK是否仍對MCF-7細胞中的cyclin D1蛋白具有抑制作用。該部分結(jié)果顯示，與空白對照組比較，雌二醇單獨作用條件下cyclin D1蛋白表達量有所提高； 1×10-6mol/L SK單獨作用后，cyclin D1蛋白的表達量顯著降低(P<0.01)；雌二醇干預下，SK作用48h后，cyclin D1蛋白的表達量也有顯著降低(P<0.05)，這說明SK對MCF-7細胞中cyclin D1蛋白表達量的作用可能不受雌激素的影響，即在人體中SK可能會對乳腺癌具有非雌激素依賴性的抑制作用。

cyclin D1能夠精確調(diào)控細胞周期，從而維持細胞正常生長發(fā)育平衡，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，cyclin D1異常表達可導致細胞周期調(diào)控失衡，細胞增殖失調(diào)，從而促進腫瘤形成[14]。cyclin D1是重要的正性調(diào)節(jié)因子，作用于G1期，參與細胞周期G1/S期調(diào)控，具體機制為cyclin D1在G1期與CDK4/CDK6結(jié)合，并使其活化，活化的CDK4/CDK6能使Rb磷酸化，磷酸化的pRb活化雌二醇F促進了DNA的合成，促使細胞由G1期進入S期，最終cyclin D1的表達能夠促進細胞的分裂與增殖，當與其他基因或基因產(chǎn)物異常配合時，共同參與癌變的發(fā)生[15～17]。cyclin D1蛋白和乳腺的關(guān)系比較密切，研究顯示將小鼠的胚胎干細胞CCND1基因敲除后發(fā)現(xiàn)雖然缺乏cyclin D1蛋白表達的小鼠仍具有生存和生育能力，但是存在妊娠期乳腺腺泡發(fā)育障礙和泌乳功能的缺失。周春等[18]采用免疫組織化學方法檢測發(fā)現(xiàn)乳腺癌中cyclin D1蛋白陽性表達率明顯高于良性乳腺組織。筆者前期的研究發(fā)現(xiàn)，紫草素對人宮頸癌SiHa細胞的增殖具有抑制作用, 其誘導G0/G1期阻滯的機制可能和cyclin D1蛋白有關(guān)[8]。黃彩梅等[19]研究發(fā)現(xiàn)，人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞的增殖隨著紫草素濃度的增加及作用時間的延長逐漸被抑制，紫草素可能是通過對雌激素信號通路中ERα、cyclin D1、c-myc蛋白表達的抑制，起到抑制Ishikawa細胞增殖的作用。這些結(jié)果都提示cyclin D1對乳腺癌細胞的發(fā)生、發(fā)展存在關(guān)鍵的調(diào)控作用，而紫草素有可能對cyclin D1蛋白具有抑制作用。

本研究從ERα信號通路角度出發(fā)，在前期發(fā)現(xiàn)的SK可影響ERα陽性乳腺癌MCF-7細胞周期，將細胞阻滯于G0/G1期的基礎上，進一步探討調(diào)控周期的作用機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SK對cyclin D1的表達有抑制作用，并且這種抑制作用不受雌激素的影響，這為天然化合物從細胞周期角度調(diào)控ERα通路，進而調(diào)節(jié)cyclin D1的表達，最終破壞ERα陽性乳腺癌細胞的周期調(diào)控機制提供了一個可能性，但具體機制需要深入研究和探討。