鄭小蘭 邱大健 張 怡

微小RNA(miRNA)是由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的長度約22nt的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA分子，序列具有高度保守型，在組織和細(xì)胞中特異性高，自1993年蠕蟲秀麗隱桿線蟲首次發(fā)現(xiàn)以來，已有大量研究表明miRNA可在各個生理過程如生物發(fā)育、脂肪代謝，細(xì)胞過程如細(xì)胞分化、增殖和凋亡中發(fā)揮重大作用，在血管生成、病變以及心血管疾病等過程中亦可發(fā)揮重要作用[1～3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-155(miR-155)在血管相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[4]。同時，miR-155也參與了天然免疫應(yīng)答和特異性免疫應(yīng)答，其在活化的各種免疫細(xì)胞中表達(dá)普遍升高，是免疫系統(tǒng)最主要的miRNA之一[5]。miR-155轉(zhuǎn)錄來自于21號染色體B細(xì)胞整合簇區(qū)域，對應(yīng)的是非編碼RNA的一個外顯子，主要表達(dá)在造血細(xì)胞。miR-155可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞，血管平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞的生物學(xué)功能[6，7]。然而，關(guān)于miR-155對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)增殖與遷移功能的影響尚不清楚。本研究探討了miR-155對HUVEC增殖與遷移功能的影響。

材料與方法

1.材料：HUVEC購自中國科學(xué)院武漢生物細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)均購自美國Hyclone公司；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；NucleoZOL試劑盒購自日本TaKaRa公司；0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司；miR-155 mimic、mimic NC、 miR-155 inhibitor、inhibitor NC、miR-155及U6反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR引物均購自廣州銳博生物科技有限公司；水溶性四唑鹽(WST)試劑盒購自中國江蘇碧云天生物技術(shù)公司。

2.HUVEC的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：HUVEC用含有100mg/L鏈霉素、1×105U/L青霉素、含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中。細(xì)胞生長融合到培養(yǎng)板75%～80%時，將0.25%胰蛋白酶加入到培養(yǎng)板中進(jìn)行消化，待內(nèi)皮細(xì)胞皺縮變圓時，加入含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化，1200×g、3min離心，收集已消化的細(xì)胞，在超凈臺中吸去上清，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸，將細(xì)胞濃度調(diào)至細(xì)胞數(shù)為1×105/ml，均勻接種于6孔板(2毫升/孔)過夜后，細(xì)胞生長約40%～50%，棄去原培養(yǎng)液，PBS液清洗3次后換成無血清DMEM培養(yǎng)基。采用Lipofectamine 3000分別在HUVECs各組中轉(zhuǎn)染miR-155 mimic、mimic NC、miR-155 inhibitor及inhibitor NC。饑餓處理6～8h后換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h后提取RNA進(jìn)行檢測。

3.qRT-PCR檢測miR-155表達(dá)：按照NucleoZOL試劑盒說明書提取4組實驗細(xì)胞總RNA，加入1ml異丙醇沉淀RNA，DEPC水溶解后，取RNA溶液1μl于Nano2000上檢測RNA的濃度和純度，取A260/280比值1.8～2.0為合格標(biāo)準(zhǔn)，可繼續(xù)用于試驗。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，并以cDNA作為模板進(jìn)行qRT-PCR檢測，以U6為內(nèi)參，miR-155引物序列為：上游引物：5′-GGAGGTTAATGCTAATCGTGATAG-3′；下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。qRT-PCR分析采用2-△△CT方法，實驗重復(fù)3次。

4.WST-1檢測HUVEC增殖活力：采用WST-1法檢測各組細(xì)胞連續(xù)3天的增殖情況。96孔板每孔加入細(xì)胞密度為1×105/ml的HUVEC懸液100μl，每組設(shè)置3個復(fù)孔，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)使其貼壁，對各組細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法如上述，分別于轉(zhuǎn)染后0、24、48、72h對各組細(xì)胞增殖活力進(jìn)行檢測：每孔加入WST-1試劑10μl，培養(yǎng)箱避光孵育3～4h，用酶標(biāo)儀檢測450nm波長處的吸光度(A)值，試驗重復(fù)3次。

5.細(xì)胞劃痕實驗檢測HUVEC遷移能力：取對數(shù)生長期HUVEC配制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為每孔2×105/ml，接種于6孔板(2毫升/孔)，過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁、生長成單細(xì)胞層時，用200μl槍頭垂直于孔板底面劃痕，用PBS洗滌3次，然后對各組細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，加入無血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別于轉(zhuǎn)染后0h和48h顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕寬度并拍照記錄，利用Image J軟件統(tǒng)計計算，遷移率(%)=(劃痕0h后劃痕寬度-劃痕48h后劃痕寬度)/劃痕0h后劃痕寬度，實驗重復(fù)3次。

結(jié) 果

1.qRT-PCR檢測miR-155的表達(dá)：miR-155過表達(dá)組的miR-155表達(dá)量明顯高于對照組(P=0.003)。與對照組比較，miR-155抑制組miR-155表達(dá)量顯著下降(P=0.000，圖1)。

圖1 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后各組miR-155表達(dá)量差異A.miR-155過表達(dá)；B.miR-155抑制

2.各組HUVEC的增殖活力比較：在24、48及72h，與對照組比較，miR-155過表達(dá)組WST-1檢測A值皆顯著降低(P<0.05)。與對照組比較，miR-155抑制組A值明顯升高(P<0.05)，詳見表1。

表1 WST-1法檢測各組細(xì)胞A值

3.miR-155對HUVEC遷移的影響:轉(zhuǎn)染了miR-155 mimic的細(xì)胞經(jīng)48h培養(yǎng)后其劃痕愈合速度較對照組慢，而轉(zhuǎn)染了miR-155 inhibitor的細(xì)胞劃痕愈合情況明顯優(yōu)于其對照組，經(jīng)Image J軟件及SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件計算，miR-155過表達(dá)組與其對照組遷移率比值為0.65，miR-155抑制組與其對照組遷移率比值為1.26，各組之間遷移率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞遷移能力比較(光鏡,×100)

討 論

miRNA是一類內(nèi)源性的小非編碼RNA，可通過與編碼蛋白質(zhì)mRNA的非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合而抑制蛋白質(zhì)翻譯或降解多肽[8]。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡等一系列過程，可以作為生物學(xué)標(biāo)志物來檢測各種疾病，包括癌癥、心血管疾病和自身免疫性疾病[9～12]。血管內(nèi)皮細(xì)胞是研究各種疾病，特別是血管相關(guān)疾病的重要細(xì)胞模型。而HUVEC因其具有分化潛能和新生血管內(nèi)皮細(xì)胞特性，獲取容易，所以目前對內(nèi)皮細(xì)胞功能的了解大部分是基于HUVEC的研究[13]。本實驗選用HUVEC為細(xì)胞模型，對進(jìn)一步探索和理解miRNA對內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響有重要意義。

miR-155是一種典型的多功能miRNA，在眾多血管細(xì)胞的調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用[14]。多項研究表明miR-155在腫瘤、膿毒血癥、免疫系統(tǒng)疾病、冠狀動脈粥樣硬化等多種疾病中發(fā)揮重要作用[15～17]。目前miR-155對內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響尚未完全闡明。miR-155可靶向作用于多種基因，調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，容易受到機(jī)體狀態(tài)的影響，故目前發(fā)現(xiàn)miR-155在不同的疾病中可發(fā)揮不同的作用[15～17]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-155過表達(dá)可抑制HUVEC的增殖與遷移功能，同時也驗證了抑制miR-155的表達(dá)可增強(qiáng)HUVEC增殖和遷移功能。Wang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可通過調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的纖維母細(xì)胞生長因子-2的表達(dá)而抑制HUVEC血管系統(tǒng)的形成。Yin等[19]研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可能通過靶向PI3K/Akt/mTOR通路而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬。Yee等[20]研究表明，miR-155可通過抑制腫瘤壞死因子-α和干擾素-γ表達(dá)而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞程序性死亡配體-1的產(chǎn)生。這些機(jī)制都可能對內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移功能造成影響。因此，miR-155對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖與遷移的影響過程可涉及多種因素，其機(jī)制不僅僅是受單一分子或基因所調(diào)控，其具體分子機(jī)制尚不明確，有待于進(jìn)一步研究。