朱小丹 董若曦 陳 燕 姚馨怡 許文娟 樊伯珍 夏 紅

卵巢儲(chǔ)備減退(diminished ovarian reserve, DOR)指女性卵母細(xì)胞的數(shù)量減少和(或)質(zhì)量下降，伴抗苗勒管激素水平降低，竇卵泡數(shù)減少，F(xiàn)SH升高，表現(xiàn)為生育能力下降[1]。近年來(lái)，隨著腫瘤癌癥發(fā)病年輕化，化療藥物使用所導(dǎo)致的卵巢儲(chǔ)備低下引起了臨床的關(guān)注。對(duì)于化療性卵巢損傷的保護(hù)，目前臨床使用的各種方法和藥物均存在一定的局限性。白藜蘆醇(resveratrol，RVT)是一種存在于葡萄、花生根莖和多種藥用植物中的1,2-二苯乙烯化合物多酚，有較強(qiáng)大的抗氧化功能，能阻止血小板凝聚，防止人體低密度脂蛋白氧化，清除自由基，并能改善修復(fù)卵母細(xì)胞損傷，改善卵母細(xì)胞質(zhì)量，減輕氧化損傷所致老化和與年齡相關(guān)的疾病[2]。筆者所在課題組在前期的實(shí)驗(yàn)中研究證實(shí)白藜蘆醇預(yù)防性應(yīng)用對(duì)順鉑化療后大鼠卵巢功能有一定的保護(hù)作用[3]。本研究擬在前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，基于PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，探討白藜蘆醇改善大鼠的化療性卵巢損傷的分子機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用大劑量的化療藥物后所導(dǎo)致的卵巢儲(chǔ)備減退，提供有效的保護(hù)方法和科學(xué)依據(jù)。

材料與方法

1.材料來(lái)源:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)8周齡雌性Wistar大鼠，體質(zhì)量180～200g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)室清潔級(jí)，室溫20～25℃，相對(duì)濕度45%～55%。喂食無(wú)特殊病原體(SPF)級(jí)鼠飼料及凈化水，每天光照12h，入籠1周后，每天按時(shí)行陰道涂片，顯微鏡下觀察動(dòng)情周期，選擇有正常動(dòng)情周期的30只大鼠入組實(shí)驗(yàn)。

2．實(shí)驗(yàn)試劑：順鉑凍干粉購(gòu)自山東齊魯制藥有限公司；白藜蘆醇購(gòu)自上海祥弘生物科技有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR抗體均購(gòu)自美國(guó) Cell Signaling Technology(CST)公司。BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；PVDF 膜購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad公司。

3．實(shí)驗(yàn)分組及處理：30只雌性Wistar大鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組、化療組(順鉑組)、化療給藥組(白藜蘆醇+順鉑組)，每組10只大鼠。在21天的實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)照組不給于任何藥物處理，化療組給予0.9%NaCl溶液1ml/d灌胃，按照前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)篩選出藥物的有效劑量，化療給藥組給予白藜蘆醇25mg/(kg·d)溶于0.9%NaCl溶液1ml中灌胃。在實(shí)驗(yàn)第15天，除對(duì)照組外，其余兩組大鼠均稱(chēng)重后，單次給予順鉑(5mg/kg)，用0.9%NaCl溶液稀釋至2ml，注射入腹腔內(nèi)[3]。

4.標(biāo)本提取及檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)第21天，各組大鼠完成全部給藥后24h，對(duì)所有大鼠進(jìn)行麻醉，處死各組大鼠，取出雙側(cè)卵巢。(1)HE染色：4%甲醛固定，石蠟包埋后連續(xù)切片，HE染色，在光鏡下觀察卵巢形態(tài)及卵泡發(fā)育情況。(2)TUNEL凋亡檢測(cè)：切片常規(guī)脫蠟入水，加入Labeling Buffer混勻后將切片置于濕盒中，37℃溫箱溫育2h。抗體稀釋液 1∶100 稀釋生物素化地高辛抗體，TBS洗滌，DAPI染色液輕度復(fù)染，ddH2O水洗?？篃晒馑p封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。每張片子隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞和區(qū)域內(nèi)的總細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比(%)，即調(diào)亡指數(shù)(apoptotic index, AI)。(3)Western blot法檢測(cè)：卵巢組織蛋白提取，進(jìn)行BCA蛋白定量，再行蛋白變性，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，封閉后分別行一抗孵育，二抗孵育后，將顯影液按照比例配置，避光保存。于暗室中，將條帶取出在吸水紙表面印干，將配置好的顯影液按照一個(gè)條帶200μl的量，均勻涂于膜上。根據(jù)說(shuō)明書(shū)設(shè)置好曝光條件，曝光拍照。

結(jié) 果

1.各組大鼠卵巢組織病理學(xué)變化:對(duì)照組大鼠卵巢切片可見(jiàn)各級(jí)生長(zhǎng)卵泡，黃體數(shù)目較多，血管豐富，間質(zhì)腺少見(jiàn)?；熃M卵巢切片可見(jiàn)卵巢萎縮，各級(jí)卵泡數(shù)明顯減少，黃體退化，間質(zhì)區(qū)有不同程度的炎細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維化。化療給藥組卵巢切片可見(jiàn)卵巢結(jié)構(gòu)較化療組有明顯改善，可見(jiàn)卵泡總數(shù)增多，間質(zhì)纖維化程度有所減輕，且可見(jiàn)一定數(shù)量的黃體,詳見(jiàn)圖1。

2.各組大鼠卵巢細(xì)胞凋亡比較：TUNEL凋亡試劑盒檢查，綠色熒光點(diǎn)代表凋亡細(xì)胞，與對(duì)照組比較，化療組熒光明顯增強(qiáng)，熒光區(qū)域明顯增大，且呈點(diǎn)線(xiàn)狀分布，凋亡指數(shù)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4211.70，P=0.000)，表明造模成功。與化療組比較，化療給藥組綠色熒光顯著減弱，熒光區(qū)域減小，呈星點(diǎn)狀分布，凋亡指數(shù)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=2180.32,P=0.000)。，詳見(jiàn)表1、圖2。

圖1 各組大鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)(HE,×40)A.對(duì)照組；B.化療組；C.化療給藥組

表1 各組大鼠卵巢細(xì)胞凋亡指數(shù)

與對(duì)照組比較，*P=0.000；與化療組比較，#P=0.000

3.各組的大鼠卵巢組織中PI3K/Ak/mTOR的相關(guān)蛋白表達(dá)：與對(duì)照組比較，化療組的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR的蛋白表達(dá)則可見(jiàn)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p-PI3K/PI3K:F=328.44,P=0.000; p-Akt/Akt:F=471.04,P=0.000; p-mTOR/mTOR:F=398.72,P=0.000)；而與化療組比較，化療給藥組的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR的蛋白表達(dá)均可見(jiàn)明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p-PI3K/PI3K:F=161.52,P=0.000; p-Akt/Akt:F=391.08,P=0.000; p-mTOR/mTOR:F=185.00,P=0.000)，詳見(jiàn)圖3、表2。

圖2 各組大鼠卵巢細(xì)胞的凋亡情況(TUNEL，×400)A.對(duì)照組；B.化療組；C.化療給藥組

圖3 各組大鼠卵巢組織中PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

討 論

研究發(fā)現(xiàn)，組織形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)方法能證明卵巢損傷，例如竇卵泡、閉鎖卵泡計(jì)數(shù)和血清激素濃度測(cè)定[4]。筆者研究組在前期的研究中，通過(guò)檢測(cè)各級(jí)卵泡數(shù)及血清抗苗勒管激素(AMH)成功造模DOR大鼠。在本研究中，筆者采用組織病理學(xué)、TUNEL凋亡和Western blot法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)大鼠化療后卵巢損傷的保護(hù)及作用機(jī)制。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以減少化療導(dǎo)致的卵巢細(xì)胞的凋亡，增加各級(jí)生長(zhǎng)卵泡，并能增加化療損傷大鼠卵巢組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)，提示白藜蘆醇能改善順鉑化療導(dǎo)致的大鼠卵巢損傷，其機(jī)制可能與激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。

表2 各組大鼠卵巢組織中相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較

與對(duì)照組比較，*P=0.000；與化療組比較，#P=0.000

近年來(lái)，隨著化療藥物進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)，腫瘤和免疫性疾病的緩解和治愈率正在穩(wěn)步提高。但化療可能導(dǎo)致DOR，生育能力下降，甚至發(fā)生早發(fā)性卵巢衰竭 (premature ovarian failure，POF)。順鉑是目前臨床中一種廣泛應(yīng)用的化療藥物，用于治療大多數(shù)類(lèi)型的癌癥。研究發(fā)現(xiàn)，順鉑可促使人原始卵泡的破壞和卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致以AMH分泌減少、卵泡細(xì)胞凋亡增加以及動(dòng)情周期紊亂等為特征的卵巢衰竭[5,6]。筆者經(jīng)過(guò)前期造模實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可得出，順鉑5mg/kg腹腔單次注射可造成Wistar大鼠卵巢受損，AMH血清水平降低，成功制備出卵巢儲(chǔ)備低下的動(dòng)物模型[3]。

近年來(lái)，在早發(fā)性卵巢功能不全的研究中，發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路不僅參與了卵母細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控及發(fā)育卵泡的增殖和分化，還能調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡[7]。PI3K是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，分別由催化亞基p110和調(diào)節(jié)亞基p85組成。p110亞基具有Ser/Thr激酶和磷脂酰肌醇激酶活性[8]。Akt也被稱(chēng)為蛋白激酶B，當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞外信號(hào)刺激時(shí)，細(xì)胞外刺激信號(hào)依賴(lài)于肌醇脂質(zhì)信號(hào)分子，經(jīng)過(guò)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)換并轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核，PI3K活化產(chǎn)生PIP3，導(dǎo)致Akt轉(zhuǎn)錄，Akt一旦在細(xì)胞膜上被完全激活，就會(huì)引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[9]。Pdk1是PI3K的主要調(diào)控信號(hào)，在小鼠卵母細(xì)胞中選擇性敲除Pdk1可導(dǎo)致小鼠卵巢損傷，而mTOR通路通過(guò)直接或間接調(diào)控上游的Akt，參與細(xì)胞生長(zhǎng)分化，促進(jìn)卵泡發(fā)育增殖[10]。筆者在研究中發(fā)現(xiàn)順鉑腹腔注射后，大鼠卵巢組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)減少。提示順鉑可能通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的活性，進(jìn)而導(dǎo)致卵巢細(xì)胞凋亡，卵泡生長(zhǎng)閉鎖。

白藜蘆醇是一種多酚類(lèi)，非類(lèi)黃酮類(lèi)抗氧化劑。它是在葡萄皮和高劑量紅葡萄酒中發(fā)現(xiàn)的植物抗毒素[11]。它具有抗炎，抗氧化和抗衰老的作用，通過(guò)上調(diào)細(xì)胞中的抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮抗氧化功能，也對(duì)自由基具有直接的破壞作用[12]。Banu等[13]研究了白藜蘆醇對(duì)暴露于6價(jià)鉻大鼠卵巢發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇處理顯著增加卵母細(xì)胞總數(shù)，閉鎖卵泡數(shù)目減少，并抑制了細(xì)胞凋亡以及卵泡從原始階段向其他階段的轉(zhuǎn)變階段，保護(hù)卵巢儲(chǔ)備能力。Liu等[14]在一項(xiàng)白藜蘆醇對(duì)大鼠年齡相關(guān)不孕癥的影響的研究中，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能保護(hù)免受年齡相關(guān)的生育力變化，促進(jìn)卵母細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量的恢復(fù)，并保持了健康的卵泡數(shù)量。Chen等[15]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對(duì)衰老大鼠的卵巢儲(chǔ)備有保護(hù)作用，使用白藜蘆醇治療的衰老大鼠有更健康的生長(zhǎng)卵泡和更少的閉鎖卵泡。Atli等[16]也研究證實(shí)了白藜蘆醇能增加了發(fā)育卵泡，減少閉鎖卵泡的數(shù)量，并能保護(hù)卵巢功能抵抗氧化損傷。這些研究發(fā)現(xiàn)支持白藜蘆醇延緩卵巢衰老的假說(shuō)。白藜蘆醇的這些作用可能與端粒長(zhǎng)度和端粒酶活性增加、生殖細(xì)胞功能障礙減少和SIRT1激活有關(guān)，白藜蘆醇可活化SIRT1，同時(shí)可以通過(guò)激活A(yù)MPK和LKB1來(lái)調(diào)控mTOR的活性。

本研究中，筆者按照前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，建立化療性卵巢損傷模型，給予預(yù)防性使用白藜蘆醇每日灌胃25mg/(kg·d)，連續(xù)給藥21天，組織學(xué)病理證實(shí)了化療給藥組的卵巢結(jié)構(gòu)較化療組有明顯改善，可見(jiàn)卵泡總數(shù)增多，間質(zhì)纖維化程度有所減輕，且可見(jiàn)一定數(shù)量的黃體。TUNEL凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與化療組比較，化療給藥組中綠色熒光顯著減弱，熒光區(qū)域減小，呈星點(diǎn)狀分布，表明白藜蘆醇有明顯抑制化療損傷性DOR大鼠卵巢細(xì)胞凋亡的作用。而Western blot法分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)白藜蘆醇預(yù)處理，化療后的卵巢組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)均明顯增多，提示白藜蘆醇可解除順鉑的抑制作用，使PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路活性增強(qiáng)，發(fā)揮其抑制凋亡的生物學(xué)功能，阻止卵巢細(xì)胞過(guò)度的凋亡。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了順鉑腹腔化療會(huì)破壞大鼠卵巢結(jié)構(gòu)，增加卵巢細(xì)胞凋亡，顯著降低各級(jí)生長(zhǎng)卵泡的數(shù)目。而白藜蘆醇的預(yù)防性使用，能夠減輕順鉑對(duì)大鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)的破壞及其對(duì)卵泡生長(zhǎng)過(guò)程的抑制作用，促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)，增加各級(jí)生長(zhǎng)卵泡數(shù)，其保護(hù)機(jī)制可能與激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。