,2,*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué),吉林長(zhǎng)春 130117;2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130012)

人參(PanaxginsengC. A. Mey)為“百草之王”,其功效有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津安神等,其富含的生物活性物質(zhì)主要包括人參總多糖、人參總皂苷、人參總蛋白等。人參多糖具有增強(qiáng)免疫力[1]、促進(jìn)造血、降血糖、抗利尿、抗衰老、抗血栓、抗菌、抗炎、抗腫瘤等多種功能。

肝臟在糖異生與糖酵解的作用下維持著人體的能量動(dòng)態(tài)平衡?；钚匝?eactive oxygen species,ROS)引發(fā)的氧化應(yīng)激在多種疾病的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用,肝臟受損及肝臟糖異生功能異常與氧化應(yīng)激息息相關(guān)[2]。目前,恢復(fù)機(jī)體糖異生功能,降低氧化應(yīng)激帶來(lái)的損傷,修復(fù)肝功能成為研究熱點(diǎn)[3]。已有大量研究關(guān)于生物活性物質(zhì)對(duì)肝臟的保護(hù)作用,Jeon等探究了人參的有效物質(zhì)對(duì)人體肝臟的保護(hù)作用[4];王榮等探究了五味子多糖對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用[5]；隨著現(xiàn)代研究的不斷深入,研究人員發(fā)現(xiàn)人參較其他功能性植物的應(yīng)用更加廣泛,不但能夠提高機(jī)體免疫力,同時(shí)能夠保護(hù)肝細(xì)胞免受損傷[6]。

但從氧化應(yīng)激的機(jī)理方向闡述,人參中的何種成分對(duì)肝細(xì)胞受損后發(fā)揮保護(hù)作用尚未研究。本研究通過(guò)構(gòu)建 H2O2誘導(dǎo)的體外大鼠肝細(xì)胞氧化損傷模型,探討人參多糖對(duì)受損肝細(xì)胞的影響和相關(guān)機(jī)制,為下一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大鼠肝細(xì)胞BRL-3A 武漢普諾賽生命科技有限公司;MEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗溶液、胰酶 美國(guó)Hyclone公司;胎牛血清 美國(guó)Gibco 公司;DMSO 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;ELISA試劑盒 上海朗頓有限公司;人參樣品 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥大健康創(chuàng)新中心提供;H2O2溶液 sigma公司;羅丹明123、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 BD Pharmingen TM;ROS檢測(cè)試劑盒 賽默飛世爾科技公司。

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司;超凈臺(tái) 蘇州凈化有限公司;In-finite200 Pro多功能微孔板分析儀 瑞士Tecan公司;FlowSight多維全景流式細(xì)胞儀 Amnis公司;中空纖維系統(tǒng) 上海子起生物科技有限公司;凍干機(jī) 深圳市依米科技有限公司;真空干燥箱 上海雅程儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人參有效物質(zhì)的制備

1.2.1.1 人參總蛋白的制備 采用堿提酸沉的方法[7],將100 g人參經(jīng)過(guò)粉粹后,過(guò)三號(hào)篩(50目),加入10倍量的堿水(pH為8)低溫浸提4 h,過(guò)濾,以3500 r/min離心5 min,取上清以0.22 μm中空纖維柱過(guò)濾,濾液以HCl溶液調(diào)至等電點(diǎn),靜置1 h后,7000 r/min離心10 min,所得沉淀即為人參總蛋白,凍干機(jī)凍干,稱(chēng)其重量,人參總蛋白收率為3.5%,經(jīng)BCA試劑盒檢測(cè)測(cè)得其純度為75%。

1.2.1.2 人參總多糖的制備 采用水提醇沉的方法[8],將100 g人參經(jīng)過(guò)粉碎后,過(guò)三號(hào)篩(50目),進(jìn)行100 ℃沸水提取,第一次10倍水,第二次8倍水,分別煎煮2、1 h,過(guò)濾后濾液合并,3500 r/min離心5 min,濃縮,用蒸餾水定容至200 mL,加入4倍體積的無(wú)水乙醇使藥液終濃度為80%的醇濃度進(jìn)行醇沉,使其在4 ℃冰箱過(guò)夜,離心后所得沉淀即為粗多糖,之后進(jìn)行sevage法脫蛋白,減壓真空干燥箱烘干,人參總多糖收率為7.8%,經(jīng)苯酚-濃硫酸法測(cè)得純度為63.4%。

1.2.1.3 人參總皂苷的制備 采用超聲波提取法[9-11],將100 g人參經(jīng)過(guò)粉碎后,過(guò)三號(hào)篩(50目),以60%的乙醇溶液提取,料液比1∶30 (g/mL),提取溫度70 ℃,超聲30 min后3500 r/min離心5 min,取上清,水浴80 ℃蒸干乙醇后,減壓真空干燥箱烘干,人參總皂苷收率為8.3%,根據(jù)保健食品功效成分及衛(wèi)生指標(biāo)檢驗(yàn)規(guī)范測(cè)得純度為70%。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) BRL-3A細(xì)胞于含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液在37 ℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[12-13]。

1.2.3 氧化應(yīng)激模型的建立 使用MEM培養(yǎng)基將H2O2稀釋至25 μmol/L,采用細(xì)胞計(jì)數(shù)器將大鼠肝細(xì)胞(BRL-3A)密度調(diào)整到3×104個(gè)/mL加到96孔板中,每孔100 μL,放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中,24 h后將原培養(yǎng)基去除,氧化應(yīng)激模型組每孔加入含有H2O2,終濃度為25 μmol/L的MEM培養(yǎng)基100 μL,放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中,作用2 h,即得到氧化應(yīng)激損傷模型。

1.2.4 人參提取物對(duì)氧化應(yīng)激模型的保護(hù)作用 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí),吸出培養(yǎng)基,加入0.25%胰酶1 mL,室溫放置1～2 min待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞消化至圓形時(shí),將胰酶吸出,加入3 mL的MEM培養(yǎng)基,使用吹管將細(xì)胞輕輕吹打下來(lái),以1100 r/min的轉(zhuǎn)速,離心5 min,計(jì)數(shù),均勻地鋪至細(xì)胞培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24 h后,分為對(duì)照組、損傷組和給藥組。對(duì)照組:MEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng);損傷組:加入終濃度為 25 μmol/L H2O2溶液培養(yǎng)肝細(xì)胞2 h,隨后吸出,補(bǔ)加MEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;給藥組:加入終濃度為25 μmol/L H2O2溶液培養(yǎng)肝細(xì)胞2 h,隨后吸出,分別用含有人參多糖(0.4、0.8、1.6 mg/mL)、蛋白(0.4、0.8、1.6 mg/mL)皂苷(0.04、0.08、0.16 mg/mL)的MEM培養(yǎng)基作用于受損傷的肝細(xì)胞,在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h[14]。

1.2.5 MTT法測(cè)定細(xì)胞活力 BRL-3A細(xì)胞密度調(diào)整到3×104個(gè)/mL加到96孔板中,每孔100 μL,按照實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)處理后每孔加入 MTT溶液30 μL,37 ℃繼續(xù)孵育4 h,終止培養(yǎng),加入150 μL DMSO溶解,設(shè)置空白孔調(diào)零,酶標(biāo)儀上振蕩3 min后在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔OD值,記錄并計(jì)算細(xì)胞存活率[15]。

1.2.6 SOD及MDA含量的檢測(cè) 采用ELISA試劑盒法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的SOD及MDA的變化情況,將各組細(xì)胞消化洗滌后至液氮中反復(fù)凍融三次,以2000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min,仔細(xì)收集上清用于測(cè)定[16]。

1.2.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè) BRL-3A細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板,密度調(diào)整到3×104個(gè)/mL,每孔2 mL,按照實(shí)驗(yàn) 1.2.4 分組干預(yù)處理后收集細(xì)胞,用PBS洗滌細(xì)胞3次,1500 r/min離心5 min,取沉淀,加入200 μL 1×Binding buffer懸浮細(xì)胞,之后加入5 μL Annexin V-EGFP混勻后,加入5 μL Propidium Iodied混勻,室溫避光反應(yīng)15 min,用流式細(xì)胞儀檢測(cè),激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)Em=530 nm。Annexin V-EGFP的綠色熒光通過(guò)FITC通道檢測(cè),PI紅色熒光通過(guò)PI通道檢測(cè)。熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞作為對(duì)照，去除光譜重疊和設(shè)定十字門(mén)的位置[17]。

1.2.8 線(xiàn)粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)的檢測(cè) BRL-3A細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板,密度調(diào)整到3×104個(gè)/mL,每孔2 mL,按照實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)處理后收集細(xì)胞,用PBS洗滌細(xì)胞3次,加入羅丹明123使其終濃度為2 μmol/L,37 ℃避光孵育30 min,1500 r/min離心5 min,棄上清,加入PBS洗滌細(xì)胞3次,最后加入200 μL PBS重懸細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè),激發(fā)波長(zhǎng)507 nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)529 nm檢測(cè)藥物作用前后熒光強(qiáng)弱[18]。

1.2.9 ROS水平檢測(cè) 用MEM培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA,終濃度為10 μmol/L。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后,棄掉培養(yǎng)液,每孔加入500 μL濃度為2 μmol/L的 DCFH-DA,在37 ℃的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30～60 min。用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞3次,去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA,注意不要將細(xì)胞吸出。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。使用激發(fā)波長(zhǎng)488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)525 nm,檢測(cè)藥物作用前后熒光的強(qiáng)弱。

1.2.10 G6P、PEPCK、ATP酶及肝糖原含量變化 將各組細(xì)胞消化洗滌后至液氮中反復(fù)凍融三次,2000 r/min離心20 min,仔細(xì)收集上清液用于測(cè)定,采用ELISA法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的G6P、PEPCK、ATP酶及肝糖原的變化[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均做三次平行實(shí)驗(yàn),采用SPSS Statistics 17.0計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差。通過(guò)GraphPad prism軟件進(jìn)行處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),進(jìn)行t值檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參提取物對(duì)H2O2損傷BRL-3A細(xì)胞的保護(hù)作用

圖1 人參總多糖對(duì)BRL-3A細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of total ginseng polysaccharides on the activity of BRL-3A cells注:*為給藥組與損傷組的對(duì)比呈顯著關(guān)系,*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01);***表示差異非常顯著(P<0.001),****表示差異極其顯著(P<0.0001);#為損傷組與空白對(duì)照組的對(duì)比呈顯著關(guān)系,#表示差異顯著(P<0.05),##表示差異極顯著(P<0.01);###表示差異非常顯著(P<0.001),####表示差異極其顯著(P<0.0001);圖2～圖5,圖7～圖12同。

通過(guò)對(duì)比人參的三種有效物質(zhì)得到如下結(jié)果,經(jīng)過(guò)分析之后,人參總多糖優(yōu)于人參總蛋白與人參總皂苷,體現(xiàn)在損傷細(xì)胞對(duì)人參總多糖有濃度依賴(lài)性,如圖1,人參多糖作用后,三個(gè)給藥濃度(0.4、0.8、1.6 mg/mL)的細(xì)胞存活率較損傷組均有所上升,并且中、高劑量有顯著性差異(P<0.05)。同一濃度的總多糖(圖1)與總蛋白(圖3)比較,總多糖恢復(fù)作用較好,總蛋白對(duì)細(xì)胞的作用不強(qiáng),并且1.6 mg/mL的總蛋白作用后呈下降趨勢(shì)。由圖2可知,人參總皂苷對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯保護(hù)作用,細(xì)胞存活率無(wú)上升趨勢(shì)。故在體外實(shí)驗(yàn)篩選中,最終選定人參總多糖進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步探討多糖發(fā)揮作用的機(jī)制[20-21]。

圖2 人參總皂苷對(duì)BRL-3A細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effects of total ginsenosides on the activity of BRL-3A cells

圖3 人參總蛋白對(duì)BRL-3A細(xì)胞活力的影響Fig.3 Effects of total ginseng protein on the activity of BRL-3A cells

2.2 氧化應(yīng)激模型中SOD、MDA的含量變化

肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激模型中H2O2導(dǎo)致SOD、MDA的含量急劇變化。SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶,可催化超氧陰離子和H2O2發(fā)生反應(yīng),MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化的關(guān)鍵標(biāo)志物,可間接反映細(xì)胞遭受氧自由基損害的嚴(yán)重程度,協(xié)調(diào)氧化和抗氧化的平衡[22]。由圖4、圖5可以看出,損傷組胞內(nèi)的SOD下降、MDA上升,破壞了機(jī)體平衡。經(jīng)不同濃度的人參總多糖作用后,其氧化應(yīng)激的相應(yīng)指標(biāo)得到了極大的改善,即給藥組SOD上升,MDA下降,其中各濃度組MDA含量，中、高濃度組SOD含量較損傷組有顯著差異(P<0.05),并隨著人參多糖濃度的增加,保護(hù)作用增強(qiáng),使受損肝細(xì)胞趨于正常水平。

2.3 細(xì)胞凋亡結(jié)果

圖4 MDA的含量變化Fig.4 MDA content change

圖5 SOD的含量變化Fig.5 SOD content change

圖7 人參總多糖對(duì)線(xiàn)粒體膜電位的影響Fig.7 Effects of total polysaccharide of ginseng on mitochondrial membrane potential

采用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染色定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡程度,其中R4與R5分別表示晚期凋亡與早期凋亡的細(xì)胞[23],由圖6結(jié)果顯示經(jīng)不同濃度人參總多糖保護(hù)后可顯著降低H2O2誘導(dǎo)的BRL-3A細(xì)胞凋亡(P<0.05),細(xì)胞早期凋亡與晚期凋亡均有所改善,在人參總多糖低濃度的作用下,減少了細(xì)胞的早期凋亡,中、高濃度作用下,同時(shí)減少了早期與晚期凋亡。隨著濃度的升高,其保護(hù)作用逐漸增強(qiáng),減少了細(xì)胞凋亡的發(fā)生,為下一步探究藥物發(fā)揮作用的機(jī)制提供基礎(chǔ)。

2.4 線(xiàn)粒體膜電位的檢測(cè)

線(xiàn)粒體膜電位異常作為細(xì)胞凋亡發(fā)生的最早期事件,研究發(fā)現(xiàn),在凋亡信號(hào)的刺激下,線(xiàn)粒體的膜電位丟失,使線(xiàn)粒體膜的通透性發(fā)生變化,各種凋亡因子會(huì)從線(xiàn)粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中,從而導(dǎo)致了線(xiàn)粒體膜電位的下降[24]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖7)顯示經(jīng)過(guò)氧化氫損傷后,線(xiàn)粒體膜電位下降,隨著人參總多糖藥物濃度的上升,經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定后,線(xiàn)粒體膜電位的中值均有顯著性提高(P<0.05)。

圖6 人參總多糖對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Effects of total polysaccharide of ginseng on cell apoptosis

2.5 ROS含量變化

細(xì)胞中活性氧(ROS)等自由基主要由線(xiàn)粒體產(chǎn)生,高濃度的ROS會(huì)造成氧化損傷,導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能的喪失,最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡[25],結(jié)果如圖8所示,肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激模型中導(dǎo)致?lián)p傷組ROS升高,通過(guò)低、中、高三個(gè)濃度的人參總多糖作用后,其氧化應(yīng)激的ROS指標(biāo)逐漸下降,并有顯著性差異(P<0.05)，使受損肝細(xì)胞得到保護(hù)。

圖8 人參總多糖對(duì)ROS的影響Fig.8 Effect of total polysaccharide of ginseng on ROS

2.6 糖異生功能的恢復(fù)(G6P、PEPCK及ATP酶)

糖異生的作用是為人體提供能量,是肝臟的功能之一,如圖9、圖10所示,損傷組與空白對(duì)照組比較,糖異生的關(guān)鍵酶含量顯著下降(P<0.05),影響了糖異生的功能,從而影響了肝細(xì)胞生成糖原的能力。經(jīng)過(guò)低、中、高三個(gè)濃度的人參總多糖作用后G6P、PEPCK的活力恢復(fù)。推測(cè)人參多糖作用后,激發(fā)了G6P、PEPCK所在的信號(hào)通路,為下一步QPCR與WB水平檢測(cè)提供數(shù)據(jù)支撐。

圖9 人參總多糖作用下G6P的變化情況Fig.9 Changes in G6P under the action of total polysaccharides from ginseng

圖10 人參總多糖對(duì)PEPCK的影響Fig.10 Effect of total polysaccharide of ginseng on PEPCK

經(jīng)損傷后同樣影響了肝細(xì)胞線(xiàn)粒體中ATP酶的改變,ATP酶為評(píng)價(jià)線(xiàn)粒體功能與能量代謝的重要指標(biāo),如圖11所示。給藥后ATP 酶的活力較損傷組極顯著上升(P<0.01),人參總多糖可能通過(guò)改善線(xiàn)粒體的功能來(lái)恢復(fù)受損肝細(xì)胞的功能[26],同時(shí),ATP酶與G6P給藥后含量顯著升高(P<0.05),分析可能與過(guò)氧化氫與藥物共同誘導(dǎo)所致。

圖11 人參總多糖對(duì)ATP酶的影響Fig.11 Effect of total polysaccharide of ginseng on atpase

2.7 肝糖原的含量變化

肝糖原是人體生命運(yùn)動(dòng)能量的重要來(lái)源,肝臟作為能量代謝的樞紐,其重要作用是產(chǎn)生糖原,糖原的儲(chǔ)存量可直接影響機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力[27],如圖12所示,損傷組經(jīng)過(guò)損傷之后,肝糖原的含量減少,低、中、高人參總多糖干預(yù)后,肝糖原含量呈梯度增長(zhǎng),提高糖原儲(chǔ)備量有助于糖異生功能的恢復(fù),給藥組肝糖原含量比損傷組明顯升高,即增加能量物質(zhì)的儲(chǔ)備能力增強(qiáng),肝臟糖異生功能恢復(fù),從而恢復(fù)受損肝細(xì)胞的功能。

圖12 人參總多糖對(duì)肝糖原的影響Fig.12 Effect of total polysaccharide of ginseng on hepatic glycogen

3 結(jié)論與討論

本研究采用了過(guò)氧化氫對(duì)肝細(xì)胞損傷,模擬氧化應(yīng)激的損害,實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M顯示肝糖原含量下降,SOD降低,MDA升高,表明肝細(xì)胞功能已受到損傷,當(dāng)糖原含量不足,不能為生命活動(dòng)提供充足能量時(shí),進(jìn)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生,同時(shí)大量的ROS將會(huì)破壞肝臟線(xiàn)粒體功能及糖異生功能等[28],高進(jìn)濤等研究了氧化應(yīng)激對(duì)Hacat細(xì)胞的保護(hù)作用;李雪惠等探討了氧化應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞危害[29-30],均通過(guò)SOD與MDA的變化初步闡述了氧化應(yīng)激造成的損傷,但對(duì)于藥物對(duì)氧化應(yīng)激造成損傷的保護(hù)作用機(jī)制尚未研究。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為能量代謝與ATP的產(chǎn)生息息相關(guān),線(xiàn)粒體及糖異生功能受損導(dǎo)致肝臟不能進(jìn)行正常的能量代謝,肝糖原產(chǎn)生量減少,肝功能作用減弱。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,人參多糖作用后,肝臟產(chǎn)生肝糖原的量較損傷組有顯著性上升(P<0.05),同時(shí)葡萄糖-6-磷酸酶與磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶含量上升,糖異生作用在一定程度下恢復(fù),人參具有雙向調(diào)節(jié)的作用,當(dāng)糖異生功能過(guò)強(qiáng)時(shí),及時(shí)對(duì)其進(jìn)行抑制[31]。

氧化應(yīng)激導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷使細(xì)胞中的SOD穩(wěn)態(tài)被破壞,而MDA的增加影響了ATP的釋放,阻礙了肝細(xì)胞線(xiàn)粒體的功能,人參多糖作用后,肝細(xì)胞凋亡較損傷組減弱,線(xiàn)粒體膜電位回升,ATP酶含量升高,故肝臟能量代謝功能恢復(fù),人參多糖經(jīng)過(guò)升高SOD,降低MDA來(lái)減輕氧化應(yīng)激帶來(lái)的損傷。

本研究表明,人參多糖對(duì)氧化應(yīng)激造成的肝細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)作用,而氧化應(yīng)激與人體疲勞等息息相關(guān),故為下一步人參補(bǔ)氣提供數(shù)據(jù)支撐。