劉 柱1,徐瀟穎1,趙超群1,陳萬勤1,梁晶晶1,毛思浩1,華 穎

(1.浙江省食品藥品檢驗研究院,浙江杭州 310052;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,浙江杭州 310053)

孔雀石綠(malachite green,MG)和結(jié)晶紫(crystal violet,CV)都屬于人工合成的三苯基甲烷類堿性染料,工業(yè)上常用于紙張、皮革、紡織工藝品的染色,因具有較強(qiáng)的殺菌、消毒作用且價格低廉,因此被違規(guī)用于水產(chǎn)品的養(yǎng)殖和運(yùn)輸過程中,防治魚、蝦等水產(chǎn)品的水霉病、爛鰓病以及寄生蟲病等,以延長水產(chǎn)品的存活時間[1-4]。在魚、蝦等水產(chǎn)品中,孔雀石綠和結(jié)晶紫常被發(fā)現(xiàn),甚至在魚苗中亦能檢測到[5-6]。孔雀石綠、結(jié)晶紫對人類都具有嚴(yán)重的毒副作用,能抑制骨髓造血功能,引起人類的再生障礙性貧血、粒細(xì)胞缺乏癥、新生兒、早產(chǎn)兒灰色綜合征等疾病,低濃度的藥物殘留也能導(dǎo)致病原菌的耐藥性[7-8]。其代謝物-隱性孔雀石綠(leuco malachite green,LMG)和隱性結(jié)晶紫(leuco crystal violet,LCV)的毒性則更強(qiáng)[9],因此,世界各國均已禁止在水產(chǎn)品養(yǎng)殖和儲運(yùn)過程中使用孔雀石綠[10],我國2002年農(nóng)業(yè)部公告第235號《動物性食品中獸藥最高殘留限量》將MG列為禁用藥物[11],但近年來依然存在非法使用的問題,給水產(chǎn)品行業(yè)和消費(fèi)者安全帶來嚴(yán)重影響[12]。

水產(chǎn)品中MG、CV、LMG、LCV殘留量低,基質(zhì)復(fù)雜,前處理和檢出技術(shù)要求高,目前國內(nèi)外對水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫和其代謝產(chǎn)物的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[13-15]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[16-18]。其中HPLC-MS/MS法靈敏度高、選擇性好,成為最為常用的方法,但HPLC-MS/MS容易受到基質(zhì)效應(yīng)的影響,因此目前常采用同位素稀釋法降低質(zhì)譜的基質(zhì)效應(yīng),提高檢測結(jié)果的可靠性[19]。有關(guān)HPLC法和LC-MS/MS法檢測孔雀石綠的不確定評價方法常有報道[20-23],而采用同位素稀釋-UPLC-MS/MS法檢測水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫和其代謝產(chǎn)物的不確定度評定方法的研究報道基本空缺。本研究采用的方法主要依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19857-2005[24]規(guī)定的同位素內(nèi)標(biāo)LC-MS/MS法,同時為了提高結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性,在國家標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)上增加了D6-結(jié)晶紫(D6-CV)和D6-隱色結(jié)晶紫(D6-LCV)兩個同位素內(nèi)標(biāo),并簡化了前處理步驟。

測量不確定度是表征合理地賦予被測量之值的分散性,與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)[25],其數(shù)值的大小反映了測量結(jié)果質(zhì)量的高低,并直接與檢驗結(jié)果的合格判定相關(guān)[26-27]。本實驗參考JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[25]及CNAS-GL006-2019《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[28],通過對同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物方法的不確定度進(jìn)行評定,期望為實驗室質(zhì)量控制提供科學(xué)、準(zhǔn)確、可信的依據(jù),同時為采用同位素內(nèi)標(biāo)法測量其他獸藥殘留量的不確定度評定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

孔雀石綠(MG)(純度≥95%)、結(jié)晶紫(CV)(純度≥92.5%)、隱色孔雀石綠(LMG)(純度≥98.5%)、隱色結(jié)晶紫(LCV)(純度≥99%) 德國Dr. Ehrenstorfer公司;同位素內(nèi)標(biāo)D5-孔雀石綠(D5-MG)(純度≥99.7%)、D6-結(jié)晶紫(D6-CV)(純度≥99.1%)、D6-隱色孔雀石綠(D6-LMG)(純度≥100%)、D6-隱色結(jié)晶紫(D6-LCV)(純度≥99.9%) 德國WITEGA公司;實驗用水產(chǎn)品(鱸魚、鯽魚、明蝦) 杭州市當(dāng)?shù)爻?乙腈、甲醇 色譜醇，德國Merck公司;試驗用水 為Milli-pore超純水;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

AB-5500 QTRAP超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 配有ESI電噴霧離子源，美國AB SCIEX公司;Shimadzu LC-30AD超高效液相色譜儀 日本島津公司;Milli-Q Gradient超純水儀 法國Millipore公司;高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo Fisher公司;Multi-Prep多樣品均質(zhì)器 美國Pro Scientific公司;全自動氮吹濃縮儀 美國Biotage公司;MS3渦旋混合器 德國IKA公司;XPE-205電子天平 瑞士Mettler Toledo公司;固相萃取裝置 美國Waters公司;中性氧化鋁固相萃取柱 規(guī)格6 mL,500 mg,美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品儲備液和稀釋液的配制 分別準(zhǔn)確稱取MG、LMG、CV、LCV各10.0 mg(精確至0.01 mg)至100 mL容量瓶中,用乙腈溶解并定容,即得100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液;用移液槍分別精密移取0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液至50 mL容量瓶中,用乙腈定容,即得混合標(biāo)準(zhǔn)工作液a(1000 μg/L);用移液槍精密移取1.0 mL 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液a至10 mL容量瓶中,用乙腈定容,即得混合標(biāo)準(zhǔn)工作液b(100 μg/L)。

分別精密稱取D5-MG、D6-LMG、D6-CV、D6-LCV各3.0 mg(精確至0.01 mg)至20 mL容量瓶中,用乙腈溶解并定容,即得同位素內(nèi)標(biāo)儲備液;用可調(diào)移液槍分別準(zhǔn)確移取各同位素內(nèi)標(biāo)儲備液溶液0.5～50 mL容量瓶中用乙腈定容,即得1.5 μg/mL的同位素內(nèi)標(biāo)工作液。

1.2.2 樣品前處理 精密稱取5.0 g(精確至0.0001 g)已混勻的樣品于50 mL離心管中,加入100 μL同位素內(nèi)標(biāo)工作液,再加入8 mL乙腈,超聲振蕩提取2 min,8000 r/min勻漿提取30 s,然后再4000 r/min離心5 min,轉(zhuǎn)移上清液移至25 mL容量瓶中;用玻棒搗碎離心管中的沉淀,再用8.0 mL乙腈按照上述操作重復(fù)提取一次,上清液合并至25 mL容量瓶中,用乙腈定容,搖勻備用。

精確移取2.0 mL樣品提取溶液加至已活化(使用前用5 mL乙腈活化)的中性氧化鋁柱上,用3 mL乙腈洗脫兩次,收集全部流出液和洗脫液于10 mL試管中,35 ℃下氮?dú)獯抵两?加入2.0 mL初始流動相,漩渦溶解復(fù)溶,0.22 μm微孔濾膜過濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶中用于LC-MS/MS分析。

1.2.3 色譜條件 色譜柱:Waters Atlantis T3(150 mm×2.1 mm,5.0 μm)或相同效能色譜柱;流動相采用10 mmol/L 乙酸銨溶液和乙腈;流速:0.4 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:5 μL;梯度洗脫程序見表1。

表1 色譜分離梯度洗脫程序Table 1 Chromatographic gradient elution program

1.2.4 質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧離子源,正離子掃描;掃描方式:多重反應(yīng)監(jiān)測;電離電壓:5500 V;離子源溫度:500 ℃;氣簾氣流速:30 L/min;碰撞氣流量:5 L/min;電源;化合物定性離子對、定量離子對、錐孔電壓(DP)、碰撞能量(CE)見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS parameters

注:“*”表示定量離子。

在1.2.3和1.2.4的色譜分析條件和質(zhì)譜分析條件下,MG、LMG、CV、LCV可以獲得較好的分離度,如圖1和圖2所示,表明分析條件合理,可以進(jìn)行不確定度評定。

圖1 MG、LMG、CV、LCV的提取離子譜圖Fig.1 Extracted ion chromalograms of MG,LMG,CV,LCV

圖2 D5-MG、D6-LMG、D6-CV、D6-LCV的提取離子譜圖Fig.2 Extracted ion chromalograms of D5-MG,D6-LMG,D6-CV and D6-LCV

1.2.5 數(shù)學(xué)模型的建立 根據(jù)水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物殘留量的測定原理和方法,待測物中被測物質(zhì)殘留量的計算公式:

式中:X為試樣中被測物質(zhì)的殘留量,μg/kg;C為從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的試樣測定液中被測物質(zhì)的質(zhì)量濃度,μg/L;V為試樣溶液的定容體積,mL;m為試樣溶液代表試樣的質(zhì)量;f為進(jìn)樣重復(fù)性、樣品預(yù)處理過程等因素。

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線由最小二乘法進(jìn)行線性擬合而成,同位素內(nèi)標(biāo)法定量,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線以峰面積計算得到待測組分的質(zhì)量濃度。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、體積量取等影響不確定度的相關(guān)因素之間采取多元回歸分析,確定多個變量的因果關(guān)系,建立預(yù)測的數(shù)學(xué)模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析

從測量過程和數(shù)學(xué)模型,對同位素內(nèi)標(biāo)稀釋-LC-MS/MS法檢測水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物殘留量的測定結(jié)果影響的各種不確定度分離進(jìn)行分析,具體引入的不確定度來源的因果圖如圖3所示。

圖3 同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱性孔雀石綠、隱性結(jié)晶紫的殘留量的不確定度來源Fig.3 Uncertainty source for determination of malachite green, crystal violet,leuco malachite green and leuco crystal violet in aquatic products by isotope dilution-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

從圖3中可以看出,影響測定結(jié)果不確定度的主要來源有:a.對照品濃度,配制過程引入的不確定度urel(c);b.樣品稱量引入的不確定度urel(m);c.樣品前處理過程中移取和量取體積引入的不確定urel(V);d.測試過程中曲線擬合以及隨機(jī)效應(yīng)引入的不確定度urel(f),包括重復(fù)性、回收率、樣品均勻性和代表性等因素引入的不確定度。

2.2 待測物引入的不確定度

待測物(C)的不確定度來源由兩個因素組成,即標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制和由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合時所產(chǎn)生的不確定度。其中標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制包括儲備液配制、稀釋及標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制3個部分[29-31]。

2.2.1 配制標(biāo)準(zhǔn)儲備液和稀釋液引入的測量不確定度urel(c)(屬于B類不確定度評定) 配制標(biāo)準(zhǔn)儲備液和稀釋液引入的不確定度由以下幾個分項構(gòu)成:a.MG、LMG、CV、LCV四種標(biāo)準(zhǔn)品本身引入的不確定度urel(c1);b.稱取標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度urel(c2);c.10 mL容量瓶定容引入的不確定度urel(c3);d.50 mL容量瓶兩次稀釋、定容引入的不確定度urel(c4)和urel(c5);e.l mL可調(diào)移液器兩次移液引入的不確定度urel(c6)和urel(c7);以及配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線引入的不確定度urel(c8)。

由于本方法采用的是同位素內(nèi)標(biāo)稀釋法,同位素內(nèi)標(biāo)濃度不參與測量結(jié)果的計算,因此在此過程中可不考慮同位素內(nèi)標(biāo)配制的不確定度,只評估在繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線時加入同位素內(nèi)標(biāo)時引入的不確定度。

表3 標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液配制過程中引入的不確定度Table 3 Uncertainty resulting from standard solution preparation

2.2.1.3 10 mL容量瓶定容引入的不確定度urel(c3) 本實驗所用10 mL容量瓶(A級)在20 ℃條件下的允差Δ為±0.02 mL,取矩形分布,則由定容引入的不確定度為:

2.2.1.4 50 mL容量瓶兩次稀釋定容引入的不確定度urel(c4)、urel(c5) 本實驗所用50 mL容量瓶(A級)在20 ℃條件下的允差Δ為±0.05 mL,取矩形分布,則由定容引入的不確定度為:

2.2.1.6 配制標(biāo)準(zhǔn)系列引入的不確定度urel(c8)(屬于B類不確定度評定) 分別使用200和1000 μL的移液器,分別精密移取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液b(100 μg/L)50、100、200、400、600、800、1000 μL,置于10 mL容量瓶中,再使用50 μL的移液器向每個容量瓶中加入40 μL內(nèi)標(biāo)工作液,最終用初始流動相定容即得標(biāo)準(zhǔn)系列。按照J(rèn)JG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[33]和JJG 646-2006《移液器檢定規(guī)程》的要求,配制標(biāo)準(zhǔn)系列過程中所使用的玻璃量器和移液器引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表3。

則由標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制過程中引入的相對不確定度為:

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)及處理Table 4 Standard curve data and processing

通過研究配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液過程中的不確定度評定發(fā)現(xiàn),相對于非同位素內(nèi)標(biāo)法而言,不確定度的來源中增加了因添加同位素內(nèi)標(biāo)時引入的不確定度,因此應(yīng)用同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行檢測時,應(yīng)將同位素內(nèi)標(biāo)稀釋至合適的濃度,以便在標(biāo)準(zhǔn)系列工作液配制時添加適當(dāng)?shù)耐凰貎?nèi)標(biāo)溶液體積,降低因配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液引入的不確定度。

2.2.2 采用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求得試樣濃度過程引入的不確定度urel(Cpred)(屬于B類評定) 對“2.2.1.6”配制的7個水平的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液,其對應(yīng)的濃度為0.5、1、2、4、6、8、10 μg/L,按照“1.2.3”和“1.2.4”的方法重復(fù)測定2次,測得4種化合物的峰面積和相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)峰面積,結(jié)果如表4所示,以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(μg/L)為橫坐標(biāo),以化合物和相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo),得到MG、LMG、CV和LCV的回歸方程、截距和線性決定系數(shù)R2結(jié)果如表5所示。

各化合物擬合而成的線性回歸方程為Y=aX+b(b為截距,a為斜率),對購買的陽性樣品中各待測化合物進(jìn)行6次重復(fù)測定,其結(jié)果見表5,根據(jù)樣品中各待測化合物與對應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)的比值,利用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性回歸方程求得相應(yīng)的濃度,根據(jù)貝塞爾公式,標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合標(biāo)準(zhǔn)偏差為:

式中:S(A)為標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合標(biāo)準(zhǔn)偏差;Ai為標(biāo)準(zhǔn)溶液與內(nèi)標(biāo)溶液響應(yīng)值的比值;Ci為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的濃度,μg/L;n為標(biāo)準(zhǔn)溶液測定的總次數(shù)(不包含0點(diǎn));a為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率;b為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距。

將表4和表5中的數(shù)據(jù)帶入S(A)計算公式,得出MG的S(A)=0.0181091;LMG的S(A)=0.00724365;CV的S(A)=0.0118181;LCV的S(A)=0.00332523。

則由最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線所引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計算式為:

將相應(yīng)的數(shù)據(jù)帶入公式進(jìn)行計算,得出MG的u(Cpred)=0.055184;LMG的u(Cpred)=0.043917;CV的u(Cpred)=0.0308395;LCV的u(Cpred)=0.0472514。

2.3 樣品前處理過程引入的不確定度

2.3.2 添加內(nèi)標(biāo)溶液引入的不確定度urel(I)(屬于B類不確定度評定) 采用200 μL移液器移取100 μL混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液(1.5 μg/mL)至稱取的樣品中導(dǎo)致的不確定度urel(I)=urel(V200)=0.866%。

由于加入內(nèi)標(biāo)后,樣品中MG、LMG、CV和LCV與其對應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)D5-MG、D6-LMG、D6-CV、D6-LCV含量的比值不會因為體積的變化而變化,因此在樣品的前處理過程中提取液的定容體積、移取待凈化液的體積和凈化濃縮后的定容體積都對以化合物和相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)含量的比值沒有影響,因此這些過程對檢測結(jié)果的不確定度沒有影響。

2.4 回收率產(chǎn)生的不確定度urel(R)

表6 重復(fù)測定檢測結(jié)果Table 6 Repeatability of determination of MG,LMG,CV and LCV

注:“/”表示未進(jìn)行計算。

表7 重復(fù)測定檢測結(jié)果Table 7 Repeatability of determination of MG,LMG,CV and LCV

在6份空白魚肉樣品中添加MG、LMG、CV、LCV混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,使樣品中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物的濃度為20 μg/kg,按照“1.2.2”進(jìn)行樣品前處理,再按照“1.2.3”和“1.2.4”的方法利用同位素稀釋法進(jìn)行檢測,測得加標(biāo)回收的結(jié)果詳見表6。

2.5 測試重復(fù)性引入的不確定度urel(f)

測試過程隨機(jī)效應(yīng)引入的不確定度,包括樣品預(yù)處理過程、樣品經(jīng)中性氧化鋁柱凈化過程、進(jìn)樣重復(fù)性、樣品均勻性和代表性等影響因素,屬于A類不確定度評定。根據(jù)“2.2.2”表5中陽性樣品各待測化合物6次重復(fù)測定的結(jié)果計算該陽性樣品中MG、LMG、CV和LCV的含量見表7。

2.6 測量不確定度的評定與報告

計算得到MG、LMG、CV和LCV的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度詳見表8。

表8 MG,LMG,CV 和 LCV的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Table 8 List of relative uncertainty components for MG,LMG,CV and LCV

表9 不確定度評估結(jié)果Table 9 Uncertainty evaluation for the determination

3 結(jié)論

采用多種同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)同時測定水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱性孔雀石綠、隱性結(jié)晶紫殘留量的實驗過程中,稱量、提取、凈化和質(zhì)譜測定等過程均會引入不確定度,本研究系統(tǒng)深入地對樣品的稱量、玻璃儀器、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和稀釋、樣品重復(fù)性測定、加標(biāo)回收、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合等因素進(jìn)行綜合考量,結(jié)果表明,在樣品的前處理過程中提取液的定容體積、移取待凈化液的體積和凈化濃縮后的定容體積都對以化合物和相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)含量的比值沒有影響,因此這些過程對檢測結(jié)果的不確定度沒有影響。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過程引入的不確定度最大,其次是重復(fù)性,而標(biāo)準(zhǔn)溶液配制中又以標(biāo)準(zhǔn)曲線配制引入的不確定度最大,而樣品稱量引入的不確定度可忽略不計。因此,在實際操作過程中,可通過調(diào)整同位素內(nèi)標(biāo)的加標(biāo)體積,增加混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的測定次數(shù),增加平行樣品測定,保持超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀器較高的靈敏度,并定期對所涉儀器進(jìn)行檢定和提高操作人員的熟練水平,來減小測量不確定度,從而保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。