,2

(1.天津科技大學,生物工程學院,工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室 暨天津市工業(yè)微生物重點實驗室,天津 300457;2.天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術工程中心,天津 300457;3.仲愷農業(yè)工程學院,動物科技學院,廣東廣州 510225;4.廣州優(yōu)藍海洋生物科技有限公司,廣東廣州 510530)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一類以高血糖為特征的代謝紊亂綜合癥。臨床上將其分為2種類型[1],分別為胰島素依賴性的1型糖尿病以及非胰島素依賴性的2型糖尿病。1型糖尿病是由于先天或后天胰島素分泌缺陷引起的,多發(fā)于青少年;2型糖尿病(Type 2 diabetes,T2DM)主要因為胰島素分泌不足或胰島素代謝失效[2]所引起的,常伴隨如神經性病變、腎病、心腦血管疾病等[3-4]多種慢性并發(fā)癥發(fā)生,患者年齡層較高,常見于中年或老年人,并且總糖尿病患者中有90%左右是2型糖尿病患者。作為糖尿病患者大國,我國在糖尿病的防治方面面臨著巨大的挑戰(zhàn)。

傳統(tǒng)的抗2型糖尿病策略主要是藥物治療結合飲食及運動調節(jié)。目前,二甲雙胍、格列本脲、阿卡波糖等為臨床上常見的口服抗糖尿病藥物。然而,這些可用的抗糖尿病藥物尚存在一些可能導致器官損傷或胃腸道功能障礙等不良反應。因此,尋找天然的,特別是食品源的降血糖活性物質,開發(fā)新的降血糖功能食品依然是大健康研究領域的重要熱點之一[5]。

近些年,從動植物等天然食品資源中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了殼寡糖、水蘇糖、燕麥β-葡聚糖等具有改善糖尿病功效的食源性功能糖類[6-8],其中,殼寡糖是N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和氨基葡萄糖(GlcN)以β-1,4糖苷鍵連接、聚合度為2～10的寡聚物,是自然界中存在的由殼聚糖水解產生的堿性寡糖。其具有抗氧化、抗炎、降膽固醇、調節(jié)免疫和抗腫瘤等多種特性[9-13],而且目前已被批準為新食品原料。另外,研究發(fā)現(xiàn)來源于白蕓豆的α-淀粉酶抑制劑作為一種植物來源的天然物質,具有明顯降低餐后血糖的功效[14-15]。在前期研究中,依照現(xiàn)代藥學理論,經過優(yōu)化配方,開發(fā)了以殼寡糖、水蘇糖、燕麥β-葡聚糖、白蕓豆提取物等為主要原料的新型“殼糖平”復合固體飲料。在此基礎上,本研究利用T2DM小鼠模型,就殼糖平對糖尿病糖脂代謝紊亂的影響作用,展開較為系統(tǒng)的分析,為其合理應用及保健食品申報奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼糖平及殼寡糖 廣州優(yōu)藍海洋生物科技有限公司;昆明小鼠 健康雄性清潔級,4周齡(體重18～22 g),生產許可證:SCXK(軍)2007-004,合格證號:00549571;高脂飼料和基礎飼料 中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心;阿卡波糖片(Acar) 杭州中美華東制藥有限公司;總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、谷草轉氨酶試劑盒(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)試劑盒 南京建成生物工程研究所。

SpectraMax id3酶標儀 美谷分子儀器有限公司;TGL-16C型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;96孔實時定量PCR儀 美國ABI公司;正置熒光顯微鏡 日本Olympus。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組和2型糖尿病小鼠模型的建立 健康雄性SPF昆明小鼠70只(4周齡,(20±2) g)。按照體重隨機分組分為7組,每組10只,分組和飼喂劑量為:正常對照組(NFD)、模型組(T2DM+PBS)、陽性對照阿卡波糖(50 mg/kg)組(T2DM+Acar)、殼寡糖(80 mg/kg)組(T2DM+COS)、殼糖平低劑量(40 mg/kg)組(T2DM+LKTP)、殼糖平中劑量(80 mg/kg)組(T2DM+MKTP)、殼糖平高劑量(120 mg/kg)組(T2DM+HKTP)。以基礎飼料適應性喂養(yǎng)小鼠一周后,T2DM、T2DM+Acar、T2DM+COS、T2DM+LKTP、T2DM+MKTP和T2DM+HKTP組小鼠禁食不禁水12 h并稱量體重,采用65 mg/kg 鏈脲佐菌素(STZ)連續(xù)3 d進行腹腔注射,造模期間飼喂高脂飼料。注射藥物5 d后,小鼠尾靜脈取血,測定小鼠的血糖;空腹血糖水平≥7.0 mmol/L,餐后2 h血糖水平≥11.1 mmol/L為造模成功[16-17],從第3周后開始連續(xù)灌胃4周,灌胃期間正常對照組小鼠飼喂基礎飼料,其它組小鼠飼喂高脂飼料。

1.2.2 小鼠血液樣品及器官的處理與保存 實驗結束后,小鼠禁食不禁水12 h并稱量體重,采取摘眼球法活體取血,取血完畢后采用斷頸法處死小鼠。將血液放室溫平衡10 min,3000 r/min離心10 min,取上清,-20 ℃保存,對小鼠進行解剖,摘取小鼠的肝臟和心臟,用無菌生理鹽水沖洗后吸干水分后快速稱重,計算肝臟和心臟指數。參考文獻方法[18],其計算公式為:臟器指數(%)=臟器重量/體重×100;同時將摘取的小鼠肝臟、心臟、升結腸、橫結腸、腎臟組織分裝于對應的離心管中,其中臟器組織的一部分迅速至于液氮罐中冷卻,保存于超低溫(-80 ℃)冰箱中。取臟器組織塊少量置于含福爾馬林溶液的離心管中,常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 小鼠血糖和血清各指標的檢測 從第2周開始直到實驗結束,期間每周均對小鼠空腹血糖進行測定。將1.2.2收集的小鼠血清用酶標儀進行TC、TG、HDL-C、LDL-C、AST、ALT含量的測定。根據公式計算動脈粥樣硬化指數:AI=(TC-HDL-C)/HDL-C。

1.2.4 肝臟組織和腎臟組織蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,簡稱HE染色)染色 對存放在固定液中的組織塊進行前處理,然后石蠟包埋并切片,隨后進行HE染色,通過正置顯微鏡觀察并獲取照片。

表1 實時定量檢測所設計引物序列Table 1 Primer design for real-time PCR

表2 各組小鼠實驗前后體重變化(M±SD,n=10)Table 2 Changes in body weight of mice before and after intervention(M±SD,n=10)

注:a表示與NFD組比較差異顯著(P<0.05),aa表示與NFD組比較差異極顯著(P<0.01);b表示與T2DM組比較差異顯著(P<0.05),bb表示與T2DM組比較差異極顯著(P<0.01);c表示與T2DM+Acar組比較差異顯著(P<0.05),cc表示與T2DM+Acar組比較差異極顯著(P<0.01);表3～表5同。

1.2.5 肝臟mRNA提取和檢測 將1.2.3保存的小鼠肝臟提取總RNA并逆轉錄成cDNA,使用表1設計的引物以SYBR Green PCR試劑檢測各目的基因的mRNA水平,以β-肌動蛋白為參照并通過2-ΔΔct方法計算結果。

1.2.6 蛋白質印跡分析 用蛋白質裂解緩沖液在冰上裂解肝臟組織30 min。使用8%～12% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質并通過電印跡法轉移到NC膜(nitrocellulose filter membrane),將膜置于含相應一抗(Rabbit monoclonal to HMGCR、PEPCK Monoclonal Antibody)溶液中4 ℃過夜孵育,再用相應的二抗(Goat anti-Rabbit、Goat anti-Mouse)抗體作用膜。通過紅外成像系統(tǒng)使目的蛋白成像可視。

1.3 數據分析

數據采用軟件SPSS 17.0進行統(tǒng)計學分析。實驗結果表示為平均值±標準偏差(M±SD)。P<0.05時,表示與比較組存在顯著差異,P<0.01表示與比較組差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 殼糖平對T2DM小鼠體重的影響

由表2可以看出,與對照組相比,其余各組小鼠體重顯著降低(P<0.05),說明糖尿病小鼠“三多一少”中體重減少明顯,符合糖尿病發(fā)病特征。與T2DM模型組比,殼糖平組以劑量依賴方式顯著減緩小鼠體重降低(P<0.05)。該結果表明殼糖平能夠減緩T2DM小鼠體重減輕的癥狀。

2.2 殼糖平對T2DM小鼠臟器指數的影響

由表3可以看出,與對照組(NFD)小鼠相比,其余各組小鼠肝臟指數和心臟指數顯著增大(P<0.05),臟器指數能夠反應臟器的健康狀況[19],2型糖尿病聯(lián)合高脂飲食會使得小鼠器臟發(fā)生脂質堆積及發(fā)生病變,繼而使得臟器指數增大。與模型組(T2DM)相比,殼糖平組以劑量依賴方式顯著降低T2DM小鼠肝臟和心臟指數(P<0.05)。該結果表明殼糖平能夠顯著逆轉T2DM小鼠臟器脂質堆積(P<0.05)和病變。

表3 殼糖平對T2DM小鼠臟器指數的影響(M±SD,n=10)Table3 Effect of Ke Tang Ping on organ index in T2DM mice(M±SD,n=10)

2.3 殼糖平對T2DM小鼠血糖及血脂指標的影響

由圖1可以看出,與對照組(NFD)小鼠相比,其余各組小鼠血糖顯著升高(P<0.05),說明T2DM模型小鼠成功建立。與模型組(T2DM)相比,殼糖平組以劑量依賴方式顯著降低T2DM小鼠血糖(P<0.05),并且隨實驗時間延長穩(wěn)步下降。

表4 殼糖平對T2DM小鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C的含量的影響(M±SD,n=10)Table 4 Effect of Ke Tang Ping on serum TC,TG,HDL-C and LDL-C levels in T2DM mice(M±SD,n=10)

究其原因,可能是殼糖平的主要組成原料殼寡糖、水蘇糖不能或難以被腸道消化酶水解,所以在小腸中不能被吸收,因此不會影響血糖水平和機體內胰島素的正常功能,而這些低聚糖可被腸道菌吸收利用,并且β-葡聚糖是水溶性膳食纖維,可以促進腸道有益菌群的生長與定殖,進而發(fā)揮調節(jié)機體血糖水平作用[8,20];另外,白蕓豆提取物中α-淀粉酶抑制劑可快速消化吸收淀粉類食物,也能夠發(fā)揮控制血糖的作用[21-22]。

圖1 殼糖平攝入4周對T2DM小鼠空腹血糖的影響(n=10)Fig.1 Effects of Ke Tang Ping on fasting blood glucose levels of the T2DM mice treated for four weeks(n=10)

圖2 各實驗組小鼠肝臟病理切片的觀察(20×)Fig.2 Pathological examination of liver tissue from experiment mice(20×)

Liu等[23]研究表明T2DM的異常血糖水平往往伴隨著血脂水平的紊亂;由表4可知,與NFD組相比,T2DM組小鼠的TG、TC、LDL-C極顯著上升,而HDL-C極顯著下降(P<0.01),表明小鼠血清脂質水平發(fā)生改變,二型糖尿病小鼠模型造模成功。與T2DM模型組相比,殼糖平組能夠顯著降低T2DM小鼠血清中TG、TC、LDL-C水平,而提高HDL-C水平(P<0.05);說明殼糖平在調節(jié)T2DM小鼠脂質代謝紊亂方面發(fā)揮作用。

并且,與T2DM組相比,殼糖平組可顯著降低AI值(P<0.05),表明殼糖平可能會輔助減少動脈粥樣硬化相關疾病的發(fā)生概率。

2.4 殼糖平對T2DM小鼠血清AST、ALT的含量的影響

由表5可知,與對照組(NFD)小鼠相比,其余各組小鼠血清AST、ALT水平指數極顯著增大(P<0.01);T2DM小鼠糖代謝障礙,導致脂肪在肝臟中蓄積,引起脂肪肝,造成肝損傷[19];與T2DM組相比,殼糖平組以劑量依賴方式顯著降低血清AST、ALT水平(P<0.05);說明殼糖平能夠顯著恢復T2DM小鼠肝損傷。

表5 殼糖平對T2DM小鼠血清AST、ALT的含量的影響(M±SD,n=10)Table 5 Effect of Ke Tang Ping on AST and ALT in T2DM mice(M±SD,n=10)

2.5 殼糖平對T2DM小鼠肝和腎組織的影響

圖3 各實驗組小鼠腎臟病理切片的觀察(20×)Fig.3 Pathological examination of kidney tissue from experiment mice(20×)

小鼠肝和腎組織HE染色結果如圖2所示,NFD組小鼠肝細胞形態(tài)、大小正常、核膜核仁清楚、核圓居中、肝小葉結構正常,肝板之間分界明顯,肝竇清晰可見;T2DM模型組小鼠肝組織結構出現(xiàn)病理變化,如肝竇受壓變窄甚至消失、肝細胞大小不一,核膜核仁模糊、肝索排列無序,肝纖維化和脂肪變性嚴重。同樣的,如圖3所示,與NFD組小鼠腎切片相比較,模型組(T2DM)小鼠腎小球體積增大,細胞數增多,腎小球毛細血管擴張,出現(xiàn)空泡變性。而殼糖平各組肝臟和腎臟脂肪變性癥狀及纖維化得到一定程度的恢復。該結果說明殼糖平具有良好保護肝臟和腎臟、緩解糖尿病的作用。

圖4 殼糖平調節(jié)葡萄糖代謝中關鍵基因mRNA水平和蛋白水平Fig.4 The level of key genes’ mRNA and protein in glucose metabolism regulated by Ke Tang Ping注:(A)PEPCK mRNA水平;(B)HMGCR mRNA水平;(C)G6pase mRNA水平;(D)SREBP-2 mRNA水平;(E)CYP7A1 mRNA水平;(F)LDLR mRNA水平;(G)PEPCK、HMGCR蛋白水平。#表示與NFD組比較差異顯著(P<0.05),##表示與NFD組比較差異極顯著(P<0.01);*表示與T2DM組比較差異顯著(P<0.05),**表示與T2DM組比較差異極顯著(P<0.01),n=8。

2.6 殼糖平對T2DM小鼠肝組織mRNA水平和蛋白水平的脂質代謝影響

研究已發(fā)現(xiàn),糖尿病中的肝胰島素抵抗與過量葡萄糖輸出,糖異生相關基因表達升高和糖原合成減少有關[24]。PEPCK是糖異生中的限速酶,而G6Pase在糖原分解的關鍵基因,肝臟G6Pase和PEPCK的表達增加與T2DM中肝糖原代謝受損有關[25-26]。此外,HMGCR是膽固醇合成的限速酶,而CYP7A1是一種參與膽固醇合成的酶,LDLR和SREBP-2基因是脂類物質代謝的關鍵轉錄因子。在本研究中,為了探討殼糖平對T2DM誘導的異常葡萄糖代謝的潛在機制,從mRNA和蛋白水平對小鼠肝臟組織中PEPCK、G6Pase、HMGCR、SREBP-2、CYP7A1、LDLR基因的變化情況進行了檢測。結果顯示(圖4):與正常組(NFD)相比,模型組(T2DM)小鼠PEPCK、G6Pase、HMGCR、SREBP-2基因極顯著上調(P<0.01),CYP7A1和LDLR極顯著下調(P<0.01),說明T2DM組小鼠葡萄糖代謝紊亂同時伴隨著膽固醇代謝異常,因此PEPCK、G6Pase、HMGCR、SREBP-2基因表達被異常激活,而LDLR和CYP7A1基因表達被抑制。與T2DM組相比,殼糖平干預可降低PEPCK、G6Pase、HMGCR、SREBP-2基因表達,而上調LDLR和CYP7A1基因表達。這些結果表明殼糖平可以改善葡萄糖代謝紊亂和膽固醇代謝異常,維持機體內糖脂代謝平衡。

3 結論

本研究結果顯示:殼糖平可減緩甚至消除T2DM小鼠體重的減少,而且能夠顯著降低小鼠血糖、血脂、AST和ALT水平并逆轉肝腎損傷(P<0.05),這些作用可能與其下調G6Pase、PEPCK、SREBP-2、HMGCR,上調LDLR、CYP7A1,從而通過糖原異生和糖原生成途徑調節(jié)葡萄糖及脂質代謝紊亂有關。這些發(fā)現(xiàn)提示:殼糖平適當劑量具有潛在輔助治療二型糖尿病的效果。