王 均， 黃 震

(四川大學生命科學學院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室, 成都 610065)

1 引 言

2018年8月11日，在RNA干擾現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)20周年之際，首例siRNA藥物Patisiran通過美國FDA審批并正式上市[1-2].功能核酸在疾病治療，預防和診斷領域中掀起醫(yī)藥革命的浪潮.雖然未修飾的功能核酸(例如siRNA)介導的基因沉默具有無限潛力，但化學修飾通常被用來改善siRNA的代謝穩(wěn)定性，體內遞送和藥代動力學特性，主要包括2′-甲氧基修飾(2′-O-Me)、2′-氟基化修飾(2′-F)、2′-氧烯丙基修飾(2′-O-allyl)、2,4-二硝基苯基醚修飾(2′-O-DNP)、4′-硫代修飾(4′-S)、硫磷代修飾(phosphorothioate linkages, PS)和5-溴尿嘧啶修飾(5-bromouracil)[3]等.其中，磷硫代修飾(硫原子取代磷酸位點的非橋鍵氧原子，即磷酸酯基PO變?yōu)榱虼姿狨セ鵓S)因能有效提高siRNA的核酸酶抗性而被廣泛應用于基因功能鑒定和臨床試驗等研究領域[4].目前，硫磷代siRNA(PS-siRNA)的合成方式主要有兩種：化學合成和體外酶促轉錄合成，由于硫代磷酸酯基(PS)是具有手性的，其可產生Sp和Rp兩種不同的非對映異構體[5]，因此，化學合成PS-siRNA時，如不控制底物單體的立體特異性，通常會得到具有不同生化性質的PS-siRNA混合物，且目前尚無高效合成立體特異性硫磷代寡聚核苷酸的化學合成體系[6].此外，相關研究發(fā)現(xiàn)化學合成得到的PS-siRNA的基因敲除活性與天然siRNA相當[7]或更低[8]，且具有較明顯的細胞毒性[9].與化學合成相比，Griffiths等人發(fā)現(xiàn)：用T7 RNA聚合酶體外轉錄合成磷硫代RNA時，T7 RNA聚合酶能特異性識別并結合-磷硫代核苷三磷酸(NTPaS)的Sp異構體，在RNA延伸過程中，其發(fā)生構型翻轉，最終得到Rp型的磷硫代RNA純凈物[10].同時，與富含Sp手性中心的PS-siRNA相比，富含Rp手性中心的PS-siRNA具有更大的血清穩(wěn)定性和更有效的基因沉默活性[6]，因此，用T7 RNA聚合酶轉錄合成的Rp型PS-siRNA可能具有更高的核酸酶抗性和生物學活性.

另外近年來，實驗研究發(fā)現(xiàn)PLK1基因過表達于多種類型的人類腫瘤組織中，如神經膠質瘤[11]、甲狀腺癌[12]、頭頸部鱗狀細胞癌[13]、黑色素瘤[14]、結直腸癌[15]、食管癌[16]、卵巢癌[17]、乳腺癌[18]和前列腺癌[19]. 自然，它被認為是腫瘤性疾病和病毒性疾病的潛在治療靶點[20-21].為了進一步探索磷硫代修飾的潛在應用價值，本文針對癌癥治療靶點PLK1，設計了3條特異性siRNA序列，并用T7 RNA聚合酶和NTPaS體外轉錄合成了PS-siRNAs，探究了PLK1 nat-siRNAs和PLK1 PS-siRNAS血清穩(wěn)定性和基因沉默活性的差異性.實驗發(fā)現(xiàn)酶促合成的PS-siRNAs能在不影響siRNA基因沉默活性的基礎下，顯著提高siRNA的血清穩(wěn)定性.因此，酶促合成的PS-siRNA可作為siRNA的應用形式，以延長siRNA的生物活性半衰期，使其基因干擾效果持續(xù)時間更長，為腫瘤性疾病和病毒性疾病等疑難雜癥的治療帶來新的希望.

2 材料與方法

2.1 材 料

2.1.1 細胞株 肝癌細胞株HepG2購自于ATCC細胞庫

2.1.2 主要試劑 胎牛血清(FBS)購自于Gibco生物公司；高糖培養(yǎng)基DMEM和胰蛋白酶購自于Hyclone生物公司；核酸siRNA marker，cDNA合成試劑盒和ECL顯色液購自全式金公司；RNA提取試劑盒購自于promaga 公司；Rfect小核酸轉染試劑購自于百代生物公司；qRT-PCR試劑購自于Takara生物公司；苯甲磺酰氟化物(PMSF)和RIPA裂解液均購自于索萊寶生物公司；BCA蛋白質定量試劑盒購自于康為世紀生物公司；anti-PLK1抗體和anti-GAPDH抗體購自于abcam公司；山羊抗兔IgG-HRP抗體和山羊抗鼠IgG-HRP抗體購自于Proteintech生物公司.

2.2 方 法

2.2.1 PLK1 siRNAs和PLK1 PS-siRNAs的體外轉錄合成及純化 以PLK1的mRNA序列為模板(GenBank序號為NM_005030)，設計靶向性敲除PLK1的siRNA序列(表1和2，其中，*表示該核苷酸位點為磷硫代核苷酸).如圖1所示，由于NTPaS的合成及應用挑戰(zhàn)，本文使用a-磷硫代三磷酸腺苷(ATPaS)、a-磷硫代三磷酸胞苷(CTPaS)和a-磷硫代三磷酸尿苷(UTPaS)[22]和T7聚合酶體外轉錄合成了部分磷硫代修飾的Rp-PS-siRNA[23].首先，在生工生物公司訂購合成PLK1-siRNAs的DNA單鏈模板(表1).在保證DNA模板純度極高的基礎上，將互補的100 μmol/L DNA單鏈退火成20 μmol/L的DNA雙鏈.依據(jù)轉錄體系加入各組分和兩組雙鏈DNA，混合均勻并輕微離心后，置于37 ℃水浴鍋中過夜孵育(同時合成正義鏈RNA和反義鏈RNA，合成的RNA可形成雙鏈).隨后用DNA酶Ⅰ消化DNA模板，RNase T1分解RNA一條鏈的GGG部分，并用苯酚-氯仿-異戊醇抽提法、乙醇沉淀法和超濾法進行樣品純化.最后，用12.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測樣品的純度和完整性.

表1 合成siRNA的DNA模板序列

表2 siRNA序列

(*表示該核苷酸的a磷酸位點氧原子被硫原子所取代)

2.2.2 PLK1 siRNAs和PLK1 PS-siRNAs的血清穩(wěn)定性試驗 5 μmol/L nat-siRNA或PS-siRNA分別與50%胎牛血清(FBS)等體積混合均勻，放置于37 ℃水域鍋中孵育.0、1、2、4、6、8、12和24 h小時后取2 μL樣品上樣，用12.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測siRNA或PS-siRNA的剩余量.Image J軟件分析三次獨立試驗的灰度值，并用Origin軟件制圖.

2.2.3 細胞培養(yǎng)與轉染試劑的篩選 將HepG2細胞(ATCC細胞庫)以5×103細胞/孔的密度接種于96孔組織培養(yǎng)板中，用含10% 胎牛血清(FBS, Gibco)的高糖培養(yǎng)基(DMEM, Hyclone)在37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)12 h.根據(jù)Lipofectamine 2000、Lipofectamine 3000、Ribofect轉染試劑和Rfect小核酸轉染試劑的廠家說明書，將帶熒光FAM基團的siRNA(轉染終濃度為10 nmol/L)與四種不同的轉染試劑混合均勻后，孵育HepG2細胞4 h，更換培養(yǎng)基，用熒光顯微鏡觀察其轉染效率的差異性.

2.2.4 qRT-PCR分析 在qRT-PCR分析中，用RNA提取試劑盒提取總RNA后，使用反轉錄試劑盒合成cDNA.根據(jù)人類PLK1 mRNA(GenBank序號為NM_005030)和GAPDH mRNA(GenBank序號為NM_002046)的序列，設計PLK1和GAPDH基因的PCR引物(表3).隨后，以1 μL cDNA作為模板，用Ex-Taq酶(Takara)對PLK1和GAPDH進行PCR擴增.95 ℃預變性5 s；95 ℃×5 s、55 ℃×10 s、72 ℃×10 s擴增40個周期；95 ℃×10 s、60 ℃×60 s、97 ℃×1 s一個周期后得到熒光曲線.利用羅氏LC96軟件，以管家基因GAPDH mRNA作為內源參考標準，采用ΔCT法測定PLK1 mRNA的相對表達量.通過熔融曲線分析驗證了PCR產物的特異性.

表3 引物序列

2.2.5 蛋白質印跡分析 在蛋白質印跡分析中，用含PMSF的RIPA裂解液提取總蛋白后，使用BCA蛋白質定量試劑盒測定各樣品的總蛋白濃度.用10% SDS-PAGE凝膠電泳分離15 μg總蛋白樣品(200 V電泳1h)，將36 kD GAPDH蛋白和68 kD PLK1從SDS-PAGE凝膠中轉移到0.2 μm PVDF膜上(冰浴條件下，200 mA轉膜2 h).5%脫脂奶粉封閉1 h后，4 ℃過夜孵育anti-PLK1抗體(兔單克隆抗體，1∶2 000稀釋)和anti-GAPDH抗體(鼠單克隆抗體，1∶5 000稀釋).用TBST緩沖液以1∶2 000的稀釋比例分別稀釋山羊抗兔IgG-HRP抗體和山羊抗鼠IgG-HRP抗體，室溫孵育二抗1 h.最后用ECL化學發(fā)光法進行顯色，以管家基因GAPDH的蛋白作為內源參考標準，歸一化后得到靶基因PLK1蛋白的相對表達量.

3 結果與討論

3.1 nat-siRNAs和PS-siRNAs的體外轉錄合成

如圖1所示，利用T7聚合酶體外轉錄合成siRNAs，用12.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測樣品的純度和完整性，得到了純度較高的PLK1 nat-siRNAs和PLK1 PS-siRNAs.

3.2 PS-siRNA血清穩(wěn)定性試驗

不同的化學修飾能不同程度地提高siRNA核酸酶穩(wěn)定性，使其進入生物體后不易被核酸水解酶降解并可持久發(fā)揮藥效，為了驗證酶促合成的PS-siRNAs是否能增強siRNA的核酸酶抗性，比較nat-siRNAs和PS-siRNAs血清穩(wěn)定性的差異是至關重要的.如圖2所示，隨著時間的延長，PS-siRNAs的剩余量明顯高于nat-siRNAs的剩余量.與FBS孵育24 h后，當剩余天然siRNA1含量為21.51%時，剩余的PS-siRNA1含量為71.6%(P< 0.01)，同時，PS-siRNA2和PS-siRNA3的剩余量也顯著性高于相對應的nat- siRNAs(68.37%versus 32.27%,P< 0.01; 63.99% versus 19.05%,P< 0.01).這表明酶促合成的PS-siRNA能顯著性增強siRNA的血清穩(wěn)定性，從而可作為siRNA的儲存形式以延長siRNA的半衰期，為siRNA實現(xiàn)低劑量高效果提供可能性，為siRNA臨床應用和新藥研發(fā)領域奠定理論基礎.

圖1 PLK1 nat-siRNAs和PS-siRNAs的轉錄合成1.磷硫代修飾寡聚核糖核苷酸結構示意圖；B. PLK1 siRNAs長度為25bp；泳道1、5為非特異siRNA序列；泳道2、6為siRNA1序列；泳道3、7為siRNA2序列；泳道4、8為siRNA3序列.Fig.1 Synthesis of PLK1 nat-siRNAs和PS-siRNAsStructure of phosphothioate oligonucleotides; B. The length of PLK1 siRNAs supposed to be 25 bp; lane 1 and 5 are non-specific siRNA; lane 2 and 6 are siRNA1, lane 3 and 7 are siRNA2; lane 4 and 8 are siRNA3.

3.3 轉染試劑的篩選

由于不同轉染試劑有著不同的化學性質和遞送機制，不同細胞株對不同的轉染試劑的敏感程度各不相同.為了篩選出肝癌細胞株HepG2的最佳轉染試劑，對常見的四種轉染試劑Lipofectamine 2000、Lipofectamine 3000、Ribofect轉染試劑和Rfect小核酸轉染試劑的轉染效率進行了分析和比較.結果如圖3所示，與Lipofectamine 2000、Lipofectamine 3000、ribofect轉染試劑的轉染效率相比，Rfect小核酸轉染試劑的轉染效率最大.因此，在后續(xù)的基因沉默試驗中，采用Rfect轉染試劑來遞送nat-siRNAs和PS-siRNAs.

圖2 nat-siRNAs與PS-siRNAs的血清穩(wěn)定性

A.nat-siRNA1與PS-siRNA1的血清穩(wěn)定性；B. nat-siRNA2與PS-siRNA2的血清穩(wěn)定性；C. nat-siRNA3與PS-siRNA3的血清穩(wěn)定性. 條形代表標準偏差，數(shù)據(jù)收集于三次獨立試驗.

Fig.2 Serum stability of nat-siRNAs and PS-siRNAs

A.Serum stability of nat-siRNA1 and PS-siRNA1; B. Serum stability of nat-siRNA2 and PS-siRNA2; C. Serum stability of nat-siRNA3 and PS-siRNA3. Bars represent the standard deviation, Data collected from three independent experiments.

圖3 不同轉染試劑的轉染效率對比

A.Lipofectamine 2000；B. Lipofectamine 3000；C. Ribofect轉染試劑；D. Rfect小核酸轉染試劑.

Fig.3 Comparison of different transfection reagents

A.Lipofectamine 2000; B. Lipofectamine 3000; C. ribofect transfection reagent; D. rfect small nucleic acid transfection

3.4 nat-siRNAs和PS-siRNAs的基因沉默效果

過去相關研究表明：化學合成得到的PS-siRNA通常為混合物，且其基因敲除活性與天然siRNA相當或更低.為了探究酶促合成的PS-siRNA在顯著提高siRNA血清穩(wěn)定性的同時，是否影響siRNA的生物學功能，采用qRT-PCR和Western blotting等半定量辦法分析比較了nat-siRNA和PS-siRNA的基因沉默效果.結果如圖4所示，在mRNA水平上，以PBS組作為對照組，當25 nmol/L siRNA1使PLK1的mRNA表達量降低45%時，等劑量的PS-siRNA1敲降了43.2%的PLK1 mRNA；同時，PS-siRNA2 和PS-siRNA3的基因沉默活性也相似于對應的nat-siRNAs(38.7% versus 46.2%; 20% versus 27%).在蛋白質水平上，PS-siRNA1、PS-siRNA2與PS-siRNA3的干擾活性均相似于對應的nat-siRNAs，(61.1% versus 61.9%; 63.06% versus 55.2%; 20.3% versus 25.6%).經分析對比發(fā)現(xiàn)：序列特異性的siRNAs或PS-siRNAs使PLK1 mRNA和PLK1蛋白質的相對表達量均顯著下降.其中，等劑量情況下，特異性序列1與序列2的基因沉默活性相似，且顯著性高于特異序列3的RNA干擾效率，這表明了同一基因的不同敲除靶點具有不同的基因沉默效率，進而印證了siRNA序列設計的重要性.此外，與nat-siRNAs相比，PS-siRNAs的特異性干擾效果沒有明顯的變化.因此，通過酶促生物合成的方式，硫磷代修飾能在不影響siRNA基因沉默活性的基礎上，顯著性增加siRNA的血清穩(wěn)定性，延長PS-siRNAs的半衰期，使其干擾效果持續(xù)時間更長，為PS-siRNAs用于腫瘤性疾病和病毒性疾病治療提供可能性.

圖4 PLK1 nat-siRNAs和PLK1 PS-siRNAs的基因沉默效果

A.mRNA水平上，PLK1 nat-siRNAs和PLK1 PS-siRNAs的基因沉默效果；B, C. 蛋白水平上，PLK1 nat-siRNAs和PLK1 PS-siRNAs的基因沉默效果；1. PBS； 2. Rfect轉染試劑； 3. 非特異性nat-siRNA； 4. nat-siRNA1； 5. nat-siRNA2； 6. nat-siRNA3； 7. 非特異性PS-siRNA； 8. PS-siRNA1； 9. PS-siRNA2； 10. PS-siRNA3. 數(shù)據(jù)收集于3次獨立實驗，* ：P<0.05；**：P<0.01.

Fig.4 Gene silencing effects of PLK1 nat-siRNA and PLK1 PS-siRNA

A.Gene silencing effects of PLK1 nat-siRNAs and PLK1 PS-siRNAs at the level of RNA; B, C. Gene silencing effects of PLK1 nat-siRNAs and PLK1 PS-siRNAs at protein level; 1. PBS; 2. Rfect reagent; 3. non-specific nat-siRNA; 4. nat-siRNA1; 5. nat-siRNA2; 6. nat-siRNA3; 7. non-specific PS-siRNA; 8. PS-siRNA1; 9. PS-siRNA2; 10. PS-siRNA3; Data were collected from three independent experiments; *P<0.05; **:P< 0.01.

4 討 論

隨著首例siRNA藥物Patisiran的正式上市，具有基因沉默活性的天然siRNA和修飾性siRNA廣泛應用于疾病治療、預防和診斷相關領域.研究表明，對nat-siRNA不同基團進行不同的化學修飾可不同程度上增加或降低siRNA的核酸酶抗性，同時，過多的或不當?shù)幕瘜W修飾會使其不被RNA干擾機制所識別，從而降低siRNA的基因沉默活性.其中，磷硫代修飾因能有效提高siRNA的核酸酶抗性而被廣泛應用于基因功能鑒定和臨床試驗等研究領域.由于硫代磷酸酯基(PS)是具有手性的，其可產生Sp和Rp兩種不同的非對映異構體，因此，化學合成PS-siRNA時，通常會得到具有不同生化性質的PS-siRNA混合物，從而影響RNA干擾機制，使其基因敲除活性與天然siRNA相當或更低.與化學合成相比，酶促合成可得到具有更高核酸酶抗性和生物學活性的Rp-PS-siRNA純凈物.為了進一步探究磷硫代修飾的潛在應用價值，本文針對癌癥治療靶點PLK1，設計了3條特異性siRNA序列，用ATPaS、CTPaS、UTPaS和T7聚合酶體外轉錄合成了部分磷硫代修飾的Rp-PS-siRNA，探究了PLK1 nat-siRNAs和PLK1 PS-siRNAs血清穩(wěn)定性和基因沉默活性的差異性.結果發(fā)現(xiàn)，通過酶促生物合成的方式，磷硫代修飾能在不影響siRNA基因沉默活性的基礎下，顯著性提高siRNA的血清穩(wěn)定性.因此，酶促合成的PS-siRNA可作為siRNA的應用形式，以延長siRNA的生物活性半衰期，并為siRNA以及其它功能核酸的生物藥物創(chuàng)新和生物醫(yī)學臨床研究奠定理論和應用的一個新基礎.目前，盡管siRNA藥物研發(fā)領域中充滿難題和挑戰(zhàn)，針對越來越多的疾病表征多變性，只有從基因水平進行靶向性治療才能達到“治標治本”的效果.隨著相關技術的不斷改良、完善與進步，siRNA藥物的其它弱點(如脫靶性，免疫原性和低遞送率等)也終將被克服，siRNA將成為以基因表達調控為導向的第三代醫(yī)藥產業(yè)革命的中堅力量.