鄧 丹， 丁顯平,2， 何嬌雨， 林小莉

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 成都 610064； 2.特色生物資源研究與利用川渝共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 成都 610064)

1 引 言

研究報(bào)道， 不孕不育發(fā)病率約占世界育齡夫婦的15%， 其中男性因素約占30% ～40%[1-2].無(wú)精子癥、少精子癥、畸形精子癥和弱精子癥(AZS)是4種常見(jiàn)的男性不育疾病.因此， 探索弱精子癥的分子機(jī)制， 對(duì)于診斷和治療男性不育具有重要的意義[3].到目前為止， 已經(jīng)證實(shí)了一些易感基因與男性特發(fā)性AZS相關(guān)， 如鞭毛軸絲微管蛋白家族蛋白2(Tektin2)[4]、前列腺睪丸蛋白1(PATE1)[5]、生精蛋白1(SEMG1)[6]、軸絲動(dòng)力蛋白重鏈1(DNAH1)[7].

在哺乳動(dòng)物中， 外周致密纖維(ODFs)是精子鞭毛中主要的張力承載元件， 在附睪運(yùn)輸和射精過(guò)程中， 鞭毛所累積的剪切力主要通過(guò)ODFs蛋白傳遞到鞭毛底部[1, 3].ODF1作為ODFs中一種主要的蛋白組成部分， 然而到目前為止， 國(guó)內(nèi)該基因與弱精子癥男性不育的相關(guān)性研究仍較少[8]， 因此， 本實(shí)驗(yàn)旨在探究ODF1基因的多態(tài)性與四川地區(qū)男性特發(fā)性弱精子癥的相關(guān)性.

2 材料與方法

2.1 材 料

2.1.1 組織樣本 選擇2016年11月到2017年9月就診于四川生殖衛(wèi)生研究中心附屬醫(yī)院的弱精子癥男性不育患者為病例組， 選擇精液參數(shù)正常的男性(至少育有一個(gè)自然受孕孩子)為對(duì)照組.年齡22～35歲(各組年齡無(wú)差異，P>0.05)， 研究對(duì)象需符合以下所有條件: ①根據(jù)第5版世界衛(wèi)生組織(WHO)的標(biāo)準(zhǔn)， 所有精液樣本進(jìn)行3次常規(guī)精液參數(shù)檢測(cè)分析， 精液量>2.0 mL， 正?？捎行越M的精液(對(duì)照組：精子密度<20 × 106/mL， A級(jí)精子>25% 或A + B級(jí)精子>50%)和弱精子癥患者的精液(病例組：精子活力A級(jí)精子<25% 或A + B級(jí)精子<50% )；②參考中國(guó)的研究與歐洲男科學(xué)院的診斷標(biāo)準(zhǔn)， 選擇無(wú)Y 染色體微缺失(AZF)的DNA樣本為實(shí)驗(yàn)對(duì)象[6]；③排除已知其他非遺傳因素的造成的男性弱精子癥不育， 如職業(yè)病危害、隱睪、酗酒、抽煙和不良生活習(xí)慣等[5].所有受試對(duì)象均簽署知情同意書(shū)， 本研究已經(jīng)倫理委員會(huì)審核通過(guò).

2.1.2 主要試劑 胰蛋白酶(北京全式金)；瓊脂糖(美國(guó)Invitorgen 公司)；Taq DNA 聚合酶 (北京全式金)；核酸染料(北京天根生物科技有限公司)；DNA Ladder Maker(北京全式金)；Giemsa染料(濰坊康華生物生物科技有限公司)；秋水仙素溶液(濰坊康華生物生物科技有限公司)；DNA提取試劑盒(北京全式金)；Taq DNA 聚合酶(北京全式金)；蛋白酶K(上海生工).

2.1.3 主要儀器 精液參數(shù)自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)MIX7.5(清華同方)；Hema9600PCR擴(kuò)增儀(中國(guó)杭州朗基有限公司)；KQ-100E超聲波清洗器(江蘇常州奧森電器有限公司)；DYY-6D電泳儀(北京六一儀器廠)；GSG-2000凝膠成像系(美國(guó)BIO-RA公司)；Milli-Q超純水儀(美國(guó)Millipore公司)；HH420恒溫水浴箱( 江蘇常州奧森電器有限公司)；染色體圖像分析系統(tǒng)(捷克Laboratory Imagin公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海博遠(yuǎn)實(shí)業(yè)).

2.2.1 精液分析 按照第5版《人類(lèi)精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》進(jìn)行精液參數(shù)分析， 將采集的新鮮精液樣本37 ℃孵育液化約 30 min 后， 放入精子參數(shù)自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)儀器中進(jìn)行自動(dòng)分析， 包括精液濃度， 精子活力等.

2.2.2 核型分析 采集的外周血細(xì)胞在植物凝集素作用下， 在RPMI-1640培養(yǎng)液中37 ℃， 培養(yǎng)72 h獲得大量分裂中期的細(xì)胞， 加入秋水仙素使分裂中期的細(xì)胞停止分裂；再經(jīng)低滲膨脹處理， 防止染色體之間相互重疊和纏繞；最后用甲醇和冰醋酸(3∶1) 將細(xì)胞固定于載玻片上， 經(jīng)Giemsa染色后， 在光學(xué)顯微鏡和染色體圖像分析儀中根據(jù)染色體的形狀及G顯帶的相對(duì)位置對(duì)所有的染色體進(jìn)行計(jì)數(shù)、分類(lèi).

2.2.3 Y染色體微缺失(AZF)檢測(cè) 采用多重PCR擴(kuò)增的方法檢測(cè)Y染色體微缺失(AZF)片段.參考中國(guó)的研究與歐洲男科學(xué)院的診斷標(biāo)準(zhǔn)， 選取AZF微缺失三個(gè)區(qū)域中的7個(gè)代表序列標(biāo)記位點(diǎn)(STS)， 如：AZF a區(qū)域：sY86、USP9Y；AZF b區(qū)域：sY127、sY134；AZF c區(qū)域：sY254、sY255[8](表1).

2.2.4 提取基因組DNA 采用DNA提取試劑盒提取精子全基因組DNA.將精子重新懸浮在無(wú)菌水中， 與含有20 mg/mL蛋白酶K和結(jié)合緩沖液3的溶解溶液混合， 室溫下溶解10 min.將裂解液加入離心柱， 結(jié)合DNA.清洗結(jié)合的DNA， 從離心柱中洗脫.所有的DNA樣品于-20 ℃下保存， 備用.

表1 AZF 區(qū)域的 6 個(gè) STS 位點(diǎn)引物

2.2.5 PCR擴(kuò)增 利用表2的引物對(duì)ODF1基因的兩個(gè)外顯子和部分側(cè)翼內(nèi)含子序列進(jìn)行了PCR擴(kuò)增. PCR擴(kuò)增條件如下：預(yù)變性(95 ℃， 5 min)， 變性(94 ℃， 30 s)， 退火(56 ℃， 30 s)， 延伸(70 ℃， 30 s).擴(kuò)增體系總體積為25 μL， 包括：10 ×buffer 3.0 μL， dNTPs 2.5 μL， 雙蒸水9.6 μL， 正、反引物各1.0 μL， DNA模板6 μL.所有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳， 采用全能凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察檢測(cè).合格樣品送往上海生工測(cè)序.

表2 ODF1基因的擴(kuò)增引物

注：F forward primer， R reverse primer

2.2.6 基因突變分析 使用MEGA對(duì)所有測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)、分析.采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析， 用χ2檢驗(yàn)和哈迪溫伯格平衡定律分析比較對(duì)照組和病例組， 使用非條件Logistic回歸方程計(jì)算OR比值和 95% 置信區(qū)間(95% CI)， 衡量弱精子癥與變異基因型相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)，P<0.05 時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.從蛋白模型網(wǎng)站PMP(http://www.protein model portal.org)獲取ODF1蛋白的3D結(jié)構(gòu).通過(guò)生物信息學(xué)軟件PROVEAN軟件 (http://provean.jcvi.org/index.php)預(yù)測(cè)變異體對(duì)ODF1蛋白功能的影響.此外， 利用ExPASy-ProtScale (http://web.expasy. org/protscale/) 分析錯(cuò)義突變對(duì)ODF1蛋白親疏水性的影響.

3 結(jié) 果

3.1 對(duì)照組與病例組精液參數(shù)對(duì)比分析

經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的精液分析、染色體G顯帶分析和AZF微缺失等步驟， 此次實(shí)驗(yàn)總共挑選出符合條件的病例組106例(四川地區(qū)特發(fā)性弱精子癥男性不育患者)和對(duì)照組104例(具有正常孕育史的男性)， 兩組精子濃度、精子活力(A+B級(jí))均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)， 而年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3).

3.2 ODF1基因的突變分析

對(duì)106例AZS患者的ODF1基因兩個(gè)外顯子和部分側(cè)翼內(nèi)含子序列進(jìn)行測(cè)序后， 我們發(fā)現(xiàn)2號(hào)外顯子里有三種核苷酸突變和兩種核苷酸缺失：P211P(c.C633G)、P214P(c.C642G)、S216N(c.G647A)、C221-P229delinsSPCNPCS(c.665del GCCCC TGCAACCCGTGCA， 缺失18 bp)和C218-P229delinsNPCSPCNPCS(c.656del ACCCCTGC AGCCCCTGCAACCCGTGCA， 缺失27 bp).病例組和對(duì)照組中c.C633G、c.C642G和18-bp缺失變異分布情況幾乎相同(P值>0.05)， 無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.然而， 與對(duì)照組相比， 等位基因中27- bp缺失變異體(OR=1.783， 95%CI=1.178-2.700，P=0.006)的頻率在弱精子癥患者中顯著增加(表4).此外， 錯(cuò)義突變c.G647A(OR=1.671， 95%CI=1.116-2.502，P=0.012)的基因型和等位基因頻率也與對(duì)照組有明顯的差異(表5)， 并且將216位的絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘於０?總之， 27-bp缺失突變和錯(cuò)義突變分散在病例組和對(duì)照組的比例有明顯差異(圖1).采用PMP蛋白質(zhì)的模擬軟件， 發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)突變均位于蛋白質(zhì)3D模型的側(cè)面褶皺區(qū)域， 是ODF1蛋白的功能區(qū)域(圖2)， 在人類(lèi)近緣的物種中具有相對(duì)較高的保守性.同時(shí)通過(guò)PROVEAN軟件分析， 錯(cuò)義突變被預(yù)測(cè)為中性突變， 而缺失突變則會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的功能有潛在損害， 且分值為-10.462(圖3).

表3病例組和對(duì)照組的基本信息

Tab.3Comparisonofageandsemenparameterbetweenasthenozoospermicgroupandcontrol

臨床參數(shù)對(duì)照組(n=104 )a病例組(n=106)aP年齡33.6±4.232.1±3.50.431精液濃度/(×106/mL)68.4±15.336.3±17.6<0.001快速精子活力/%37.3±4.68.1±5.1<0.001精子活力/% 62.61±6.219.8±7.6<0.001AZF微缺失無(wú)無(wú)核型46, XY46, XY后代個(gè)數(shù)1.4(1-3)0

注：a數(shù)據(jù)的平均值±SDP<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

表4 特發(fā)性弱精子癥和正常組中ODF1基因中27-bp缺失的基因型和等位基因頻率

注：A-G 為無(wú)缺失；A27G為缺失27-bp；A18G為缺失18-bp；CI為置信區(qū)間

*P<0.05 和**P<0.01具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

表5 特發(fā)性弱精子癥和正常組中ODF1(c.G647A)的基因型和等位基因頻率

注：*P<0.05和**P<0.01具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

圖1 ODF1基因中突變的序列峰圖

a圖為c.G647A的峰圖，從左到右依次為的野生純合子(GG)、突變雜合子(GA)、突變純合子(AA)；b圖為27-bp缺失的的峰圖，從上到下依次為野生純合子、缺失雜合子、缺失純合子; c圖為27-bp 缺失導(dǎo)致10個(gè)氨基酸缺失

Fig.1 Sequencing mutations of ODF1 gene

a. sequencing analysis of c.G647A from left to right: wild homozygote (GG), mutant heterozygote (GA), mutant homozygote (AA); b. sequencing analysis of 27-bp deletion from top to bottom: wild homozygote, deletion heterozygote, deletion homozygote；c. 27-bp deletion caused ten amino acids deletion

圖2 PMP蛋白質(zhì)模型軟件中ODF1的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型

a突變位點(diǎn)在ODF1蛋白三維結(jié)構(gòu)中的位置； b該模型基于42%序列標(biāo)識(shí)的目標(biāo)模板序列對(duì)齊

Fig.2 Protein structure model of ODF1 was given from the protein model portal

a. The location of mutation in ODF1 protein 3D structure; b. this model is based on target-template sequence alignment of 42% sequence identity

圖3 PROVEAN分析預(yù)測(cè)突變對(duì)ODF1蛋白功能影響

Fig.3 PROVEAN analysis predicts the effect of mutation on the function of ODF1 protein

圖4 Expasy-ProtScale軟件分析ODF1蛋白中S216N的親疏水性

Fig.4 The hydrophobicity of S216 N in ODF1 protein was analyzed by Expas-ProtScale software

4 討 論

精子活力即依靠精子尾部鞭毛的不斷擺動(dòng)完成向前運(yùn)動(dòng)的能力， 已經(jīng)被證實(shí)是引起男性不育的重要因素之一[9].AZS常表現(xiàn)為精子活力低下， 因此精子鞭毛的形態(tài)和結(jié)構(gòu)異常均可以導(dǎo)致精子運(yùn)動(dòng)障礙.大量研究顯示， 染色體異常、Y染色體微缺失和基因變異也與AZS有關(guān)聯(lián)[10-11].近年來(lái)隨著研究的不斷深入， 已鑒定了許多與精子形成密切相關(guān)的基因[4].

ODFs蛋白作為一種特異性表達(dá)在精子尾部的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)， 是支持精子運(yùn)動(dòng)的重要組成成分.它由9根縱向平行的柱狀蛋白圍繞而成， 每一根致密纖維都與其對(duì)應(yīng)二聯(lián)微管相互平行， 外周包裹著纖維鞘， 主要表達(dá)在精子尾部[12-13].ODF1和ODF2是ODFs種蛋白中最主要的兩種蛋白.ODF1蛋白的N末端是與亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)相似的兩性α螺旋結(jié)構(gòu)， C末端是重復(fù)的三肽結(jié)構(gòu)(Cys-Gly-Pro， CGP)[14-15].由于ODF1蛋白蜷曲成棒狀結(jié)構(gòu)， 因此推測(cè)， N末端的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)和C末端的三肽重復(fù)結(jié)構(gòu)在ODF1蛋白自身的作用或與其他蛋白相互作用中可能起著一定的作用， 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)精子運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)[9, 16].

在此次研究中， 我們發(fā)現(xiàn)ODF1基因中27-bp缺失變異體在弱精子癥患者中雜合子(A-G/A27G)和純合子(A27G/A27G)的頻率和為64.15%， 在對(duì)照組中為45.19%， 病例組和對(duì)照組之間的顯著性增加(OR=2.396， 95%CI=1.348～4.259，P=0.003)， 這表明27-bp缺失變異體可能增加精子形成過(guò)程中發(fā)生障礙的風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.783， 95%CI=1.178～2.700，P=0.006).且PROVEAN軟件預(yù)測(cè)這一缺失可能對(duì)蛋白質(zhì)功能造成潛在損害.借助MEGA軟件發(fā)現(xiàn)在這缺失的10個(gè)氨基酸序列中存在4個(gè)類(lèi)似的C-X-P的結(jié)構(gòu)(圖1)， Krausz等[12]研究表明果蠅中重復(fù)的三肽結(jié)構(gòu)(Cys-Gly-Pro， CGP)缺失直接導(dǎo)致功能精子中減少2倍的mRNA.Lourenco等[10]也證實(shí)了弱精子癥組中ODF1基因轉(zhuǎn)錄的mRNA明顯低于正常人， ODF1蛋白的平均帶強(qiáng)度較低， 數(shù)量較少.對(duì)于約為27 kDa的ODF1小分子蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)， 側(cè)面保守區(qū)域內(nèi)10個(gè)氨基酸的缺失可能直接對(duì)蛋白質(zhì)功能產(chǎn)生不利影響[17].除此之外， ODF1蛋白作為一種小的熱休克蛋白(sHSP)， 可以與其他蛋白相互影響， 如Sha等[18]發(fā)現(xiàn)SUN5基因中c.381delA突變不僅會(huì)導(dǎo)致SUN5蛋白的表達(dá)量下降， 也會(huì)改變ODF1蛋白的在精子尾部的分布情況.因此， ODF1基因中的4個(gè)類(lèi)似的C-X-P序列結(jié)構(gòu)缺失可能導(dǎo)致了ODF1基因轉(zhuǎn)錄的mRNA減少， 同時(shí)也會(huì)影響其他蛋白的表達(dá)量， 進(jìn)而引起弱精子癥患者精子的活力下降.

此外， 我們還檢測(cè)到一個(gè)錯(cuò)義突變(c.G647A)將216位的絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘於０?在PROVEAN軟件中被預(yù)測(cè)為中性突變， 但我們通過(guò)親水性觀測(cè)發(fā)現(xiàn)氨基酸的改變導(dǎo)致蛋白質(zhì)的表面的親疏水性下降(圖4)， 可引起蛋白質(zhì)在相應(yīng)位點(diǎn)疏水不平衡， 對(duì)蛋白質(zhì)的功能造成影響[4].因此， 需要進(jìn)一步評(píng)估錯(cuò)義突變帶來(lái)的影響.

綜上所述， 此次研究結(jié)果表明ODF1基因中27-bp缺失變異體極有可能與四川地區(qū)特發(fā)性弱精子癥男性不育相關(guān).考慮到區(qū)域遺傳差異和較小的樣本量， 未來(lái)需要擴(kuò)大研究標(biāo)本的數(shù)量以及選取來(lái)自不同區(qū)域的樣本， 為診斷和治療男性弱精子癥提供理論基礎(chǔ).