方 艷， 岳 出， 李 潔， 郭媛媛， 王茂林

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 成都 610064)

1 引 言

甘藍(lán)型油菜(BrassicanapusL.)是世界上重要的油料作物之一[1]. HY5轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物眾多生理過(guò)程具有調(diào)節(jié)作用[2]，屬于亮氨酸拉鏈(bZIP)家族[3]. 該家族轉(zhuǎn)錄因子參與植物對(duì)病原體的防御過(guò)程，花的發(fā)育和種子的成熟以及光和激素信號(hào)傳遞及反應(yīng)過(guò)程等[4].植物bZIP類(lèi)的蛋白在結(jié)合表達(dá)基因的DNA序列時(shí)，會(huì)優(yōu)先與包含特定作用元件的DNA序列結(jié)合，因此植物bZIP類(lèi)蛋白會(huì)偏向于優(yōu)先識(shí)別有G-box (CACGTG)、 A-box (TACGTA)、C-box (GACGTC)等原件的序列[5].堿性亮氨酸拉鏈基本結(jié)構(gòu)是以亮氨酸殘基開(kāi)頭每6個(gè)氨基酸形成的7肽單元；多個(gè)七肽單元可穩(wěn)定二聚化[6].擬南芥中bZIP家族有78個(gè)成員，這些轉(zhuǎn)錄因子依據(jù)功能和結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)被細(xì)分為十三組，目前為止，這些成員的其中四十多個(gè)尚未做系統(tǒng)的功能和序列的分析[7].HY5及其同源基因HYH都含有COP1(Constitutive Photomorphogenesis1)相互作用結(jié)構(gòu)域并有相似的功能，被單獨(dú)分到了的一組，二者常常被一起研究.擬南芥HY5突變體在光照條件下具有細(xì)長(zhǎng)的下胚軸的表型，在該突變體中過(guò)表達(dá)功能區(qū)完整的HYH可以彌補(bǔ)長(zhǎng)的下胚軸表型[8]，說(shuō)明擬南芥HY5基因與其同源基因HYH在功能上冗余.擬南芥中光形態(tài)建成應(yīng)答調(diào)控機(jī)制的研究揭示了HY5在光應(yīng)答中的中關(guān)鍵的調(diào)控作用[2]，HY5調(diào)控著基因組中上千個(gè)光誘導(dǎo)基因的表達(dá)[9].近年來(lái)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，HY5不僅參與光信號(hào)響應(yīng)，還可能參與非生物脅迫等過(guò)程[10-11]，HY5轉(zhuǎn)錄因子位于調(diào)控的中心.但目前針對(duì)甘藍(lán)型油菜BnHY5基因的研究較少，對(duì)非生物脅迫方面的研究也未見(jiàn)報(bào)道.基于該轉(zhuǎn)錄因子的重要作用，在甘藍(lán)型油菜中研究其表達(dá)模式是非常必要的.本文研究分析了油菜BnHY5表達(dá)模式及脅迫逆響應(yīng)，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)其功能與油菜遺傳改良奠定基礎(chǔ).

2 材料與方法

2.1 材 料

甘藍(lán)型油菜(BrassicanapusL.)科樂(lè)油1號(hào)種植于植物光照培養(yǎng)室.

2.2 方 法

2.2.1 RNA提取和cDNA合成 油菜總RNA的提取用植物總RNA提取試劑盒(E.Z.N.A R6627-02Plant RNA Kit OMEGA公司)，操作按照提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行.提取高質(zhì)量的RNA后立即進(jìn)行cDNA的合成.總RNA反轉(zhuǎn)錄使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ONE-Step-gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒；TRANSGENE公司).cDNA合成后于-20 ℃保存?zhèn)溆?(體系為20 μL，其中總RNA含量在500 ng～5 μg).

2.2.2 甘藍(lán)型油菜BnHY5基因全長(zhǎng)cDNA的克隆 以Genbank中已經(jīng)公布的甘藍(lán)型油菜(BrassicanapusL.)數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)的HY5和HYH各個(gè)基因開(kāi)放閱讀框序列同源部分設(shè)計(jì)特異性引物.

以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用凝膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后連接T克隆載體，藍(lán)白斑篩選后挑取單菌落進(jìn)行重組子鑒定，將陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，送至華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序.引物序列為見(jiàn)表1.

2.2.3BnHY5基因序列分析 目的基因測(cè)序結(jié)果用DNAMAN軟件和NCBI中的BLAST工具進(jìn)行比對(duì)分析.BnHY5蛋白理化性質(zhì)利用在線軟件Expasy-Protparam分析[15]和NCBI在線工具完成，使用SOPMA對(duì)BnHY5蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)[12]，而蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型用Swiss Model在線工具分析.使用使用鄰接法推斷了進(jìn)化歷史，MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)[13].

2.2.4BnHY5 基因在各時(shí)期各器官的表達(dá)模式分析及脅迫處理 分別取光照和黑暗下的幼苗材料，苗期(兩葉一心期、四葉一心期)、抽薹期、花期的根、莖、葉材料.取樣后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?油菜盆栽培養(yǎng)至2～3片真葉，將油菜根部泥土洗凈置于1/2霍格蘭溶液中繼續(xù)培養(yǎng).培養(yǎng)至3～4片真葉進(jìn)行脅迫激素處理和脅迫處理.激素處理為150 μmol/L ABA和GA3，分別添加0.05%的乙醇和0.01%的Tween-20表面活性劑[1]噴施葉面，空白對(duì)照噴施含同濃度乙醇和表面活性劑的清水.將甘藍(lán)型油菜幼苗分別放置40 ℃光照培養(yǎng)箱做高溫處理，和4 ℃冷室內(nèi)做低溫處理，正常光照；鹽脅迫，鎘脅迫處理分別在培養(yǎng)液中添加含150 mmol/L的氯化鈉，150 μmol/L氯化鎘，未經(jīng)過(guò)任何處理的材料作為空白對(duì)照.所有材料在處理后，0、3、6、9、12、24和48 h(高溫脅迫、低溫脅迫處理后每隔2 h)進(jìn)行一次取樣.取生長(zhǎng)狀況一致的幼苗地上部分，液氮冷凍后于-80 ℃保存.每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值.

2.2.5BnHY5基因在逆境脅迫和外源激素處理下表達(dá)模式分析BnHY5基因的qPCR預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了定量的最佳退火溫度(56 ℃)和模板濃度.以甘藍(lán)型油菜管家基因β-actin(GenBank登錄號(hào)AF111812)為內(nèi)參[1]，設(shè)計(jì)特異性熒光定量引物，qPCR引物序列見(jiàn)表2.

表2 qPCR引物

qPCR檢測(cè)BnHY5基因在不同脅迫處理后不同時(shí)間段的表達(dá)情況.熒光定量PCR儀為美國(guó)Bio-Rad CFX96[1].熒光定量試劑盒Trans Start Tip Green qPCR Supper Mix(TRANSGENE生物公司).qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL：10 μL 2× Master Mix；1 μL模板cDNA(0.3 μg/μL)；正反向引物各0.4 μL(10 μmol/L)；8.2 μL 的dd H2O.qRT-PCR采用三步法，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性30 s；42個(gè)循環(huán)(94 ℃ 5 s；56 ℃ 15 s；72 ℃ 10 s)同時(shí)繪制熔解曲線.反應(yīng)結(jié)束后，目標(biāo)基因的相對(duì)定量用2-ΔΔCt法[14]計(jì)算，每個(gè)樣品都進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn).數(shù)據(jù)采用SPSS 20進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

3 結(jié)果與分析

3.1 BnHY5基因全長(zhǎng)的克隆與編碼蛋白質(zhì)分析

BnHY5及其同源基因PCR擴(kuò)增見(jiàn)圖1(a)(b).測(cè)序結(jié)果利用NCBI在線工具Blastn比對(duì)，成功獲得HY5基因及同源基因HYH，命名為BnHY5和BnHYH.并且在油菜中它們存在多個(gè)基因，BnHY5有四個(gè)基因HY5-1(BnC09HY5.1；795bp)；HY5-2(BnA10HY5；825bp)；HY5-3(BnA02HY5；738bp)；HY5-4(BnC03HY5.2；752bp).而B(niǎo)nHYH克隆到三個(gè)基因HYH-1，HYH-2，HYH-3.發(fā)現(xiàn)BnHY5-1與甘藍(lán)型油菜預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子HY5基因(LOC106391328)核苷酸序列相似性為99%.與擬南芥的HY5序列相似性為83.08%，與甘藍(lán)的HY5序列相似性為98%.油菜HY5轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列的N端有能與 COP1 相互作用的結(jié)構(gòu)域，C端則是bZIP結(jié)構(gòu)域.同時(shí)，油菜中HY5基因四個(gè)重復(fù)基因的COP1 interaction區(qū)域與其主要作用結(jié)構(gòu)域亮氨酸拉鏈的氨基酸序列基本上一致.

(a)BnHY5

(b)BnHYH

1.BnHY5-1；2.BnHY5-2；3.BnHY5-3；4-5.BnHY5-4 1-2.BnHYH-1；3-4.BnHYH-2；5.BnHYH-3

圖1 基因全長(zhǎng)PCR擴(kuò)增

M.DNA marker；number.PCR products

Fig.1 Full-length PCR amplification ofBnHY5 and BnHYH genes

擬南芥、甘藍(lán)、蕪菁HY5氨基酸序列與油菜HY5氨基酸序列比對(duì)見(jiàn)圖2.與擬南芥HY5氨基酸序列相比，油菜的氨基酸序列存在四處氨基酸不同.另外，BnHY5氨基酸序列中部50個(gè)氨基酸處AtHY5氨基酸序列少了4個(gè)氨基酸RESG(精氨酸，谷氨酸，絲氨酸，甘氨酸)這四個(gè)氨基酸均為親水性較強(qiáng)的氨基酸；并且在bZIP的LZ(亮氨酸拉鏈)基本結(jié)構(gòu)區(qū)即七肽單元區(qū)末尾處存在個(gè)別氨基酸的差異，例如肽鏈50個(gè)氨基酸處擬南芥的氨基酸是纈氨酸，而油菜的卻是蘇氨酸.甘藍(lán)型油菜與兩個(gè)親本甘藍(lán)和蕪菁的HY5氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)蛋白序列76與158個(gè)氨基酸處，甘藍(lán)型油菜氨基酸差異與親本蕪菁和甘藍(lán)有著相同的特點(diǎn)：甘藍(lán)的為G，蕪菁的為S，油菜HY5-1的為G，HY5-2的為S(圖2).

圖2 擬南芥HY5蛋白與蕪菁、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜HY5蛋白氨基酸序列比對(duì)

Fig.2 Amino acid sequence comparison ofBnHY5 with arabidopsis AtHY5 and HY5 of brassica rape, brassica oleracea amino acid sequence

3.2 BnHY5蛋白理化性質(zhì)分析與結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

3.2.1 BnHY5蛋白理化性質(zhì)分析

表3 BnHY5蛋白的理化性質(zhì)

BnHY5-1蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為18 037.82，不穩(wěn)定指數(shù)為61.67，為不穩(wěn)定類(lèi)蛋白；等電點(diǎn)為9.29；親水性的平均值(GRAVY)為-1.198.結(jié)果表明，該蛋白為不穩(wěn)定、親水性蛋白.

3.2.2 BnHY5蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) BnHY5蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要顯示蛋白結(jié)構(gòu)域主要是α-螺旋結(jié)構(gòu)，另外在非結(jié)構(gòu)域部分為無(wú)規(guī)則卷曲和片層結(jié)構(gòu)，以及少量β-折疊.構(gòu)象均存在亮氨酸拉鏈α螺旋以及enhancer-binding protein beta區(qū)域(CCAAT)，進(jìn)一步證明屬于bZIP家族.BnHY5氨基酸序列預(yù)測(cè)得到三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象有2種：BnHY5-1和BnHY5-4的構(gòu)象如圖B1，而B(niǎo)nHY5-2，BnHY5-3的構(gòu)象如圖B2；而擬南芥AtHY5轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列預(yù)測(cè)得到的三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象有兩個(gè)獨(dú)立構(gòu)象(圖3)，B3、B4為分開(kāi)的兩個(gè)獨(dú)立構(gòu)象，B5為合在一起的構(gòu)象.根據(jù)BnHY5和AtHY5構(gòu)象差異可以看出比擬南芥HY5能夠產(chǎn)生的構(gòu)象類(lèi)型更為簡(jiǎn)單，推測(cè)甘藍(lán)型油菜的HY5轉(zhuǎn)錄因子的作用功能更有可能與其他的轉(zhuǎn)錄因子相互作用以起到調(diào)控作用.

圖3 BnHY5蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)B1.BnHY5蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)一類(lèi)預(yù)測(cè)構(gòu)象；B2．BnHY5蛋白三級(jí)二類(lèi)預(yù)測(cè)構(gòu)象；B5.AtHY5蛋白構(gòu)象1和構(gòu)象2共存時(shí)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)構(gòu)象；B3,B4為AtHY5蛋白構(gòu)象1和構(gòu)象2；Fig.3 Prediction of tertiary structure of BnHY5 protein

3.3 BnHY5蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

利用MEGA-X軟件[13]中Neighbor Joining算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖4)，使用泊松校正方法計(jì)算進(jìn)化距離，使用最大復(fù)合似然法計(jì)算進(jìn)化距離，

圖4 BnHY5蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析標(biāo)尺上數(shù)字代表堿基替換率，在分支旁邊顯示了相關(guān)分類(lèi)群在引導(dǎo)測(cè)試中聚集在一起的進(jìn)化樹(shù)的百分比(1 000個(gè)重復(fù)).Fig.4 Evolutionary relationships of BnHY5 protein

并以每個(gè)位點(diǎn)的堿基取代數(shù)為單位[17]. BnHY5與雙子葉植物十字花科物種中甘藍(lán)和蕪菁HY5的親源關(guān)系最近，與蕪菁的同源性為89%，與蘿卜的為86.8%.與白菜等HY5的蛋白具有較高的同源性.與亞麻薺的親源關(guān)系最遠(yuǎn)，蛋白同源性為42.86%.十字花科不同種屬的植物的bZIP作用結(jié)構(gòu)域是高度保守的.進(jìn)一步說(shuō)明bZIP家族蛋白的遺傳進(jìn)化是保守的.另外從進(jìn)化樹(shù)可以看出，甘藍(lán)型油菜HY5與雙子葉植物蘋(píng)果、芝麻HY5的親源關(guān)系較遠(yuǎn)；與單子葉植物水稻，玉米HY5的親源關(guān)系又比雙子葉植物的更遠(yuǎn).

3.4 BnHY5基因在油菜不同生長(zhǎng)期不同組織的表達(dá)分析

以β-actin為內(nèi)參，油菜中各個(gè)器官中BnHY5基因的表達(dá)情況如圖5(ss2、ss4表示苗期的二葉一心和四葉一心時(shí)期；bs表示抽薹期，fs表示花期).BnHY5基因在甘藍(lán)型油菜整個(gè)生長(zhǎng)周期中均要表達(dá)，但表達(dá)量存在差異.在油菜的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，葉中的表達(dá)量最高，根、莖中表達(dá)量遞減，同一生長(zhǎng)期莖中表達(dá)量最低.但在甘藍(lán)型油菜進(jìn)入生殖生長(zhǎng)期后發(fā)生變化，葉片中的表達(dá)量隨著植物體逐漸老化而逐漸降低.抽薹期根中的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；BnHY5-1花期莖中的表達(dá)量比抽薹期的高出1/3.在不斷膨大的油菜角果中的表達(dá)量也比較高，花中的表達(dá)量與同時(shí)期葉中的表達(dá)量相當(dāng).

(a)BnHY5-1 (b)BnHY5-2

(c)BnHY5-3 (d)BnHY5-4

圖5BnHY5基因在油菜不同發(fā)育時(shí)期不同器官的相對(duì)表達(dá)量

a,b,c表示P<0.05，同組數(shù)據(jù)間達(dá)到差異顯著

Fig.5 Relative expression ofBnHY5 gene in different organs of different stages of rape

3.5 甘藍(lán)型油菜BnHY5基因與同源基因BnHYH表達(dá)差異分析

光是影響HY5表達(dá)量變化的重要因素.分析甘藍(lán)型油菜BnHY5與其同源基因BnHYH在光照和黑暗下的表達(dá)差異.以β-actin為內(nèi)參基因，BnHY5-1的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)，BnHY5多個(gè)基因的表達(dá)量如圖6.甘藍(lán)型油菜HY5和HYH各基因光照下的表達(dá)量均高于黑暗下的表達(dá)量；但HYH各

圖6 甘藍(lán)型油菜幼苗光照與黑暗下重復(fù)基因的相對(duì)表達(dá)量

*:P<0.05，同個(gè)基因在光照下表達(dá)量與黑暗下的相比達(dá)到差異顯著

Fig.6 Relative expression of repeat genes in light and dark conditions ofBrassicanapusL.

基因在光照和黑暗下的表達(dá)差異要比HY5基因更大；并且在黑暗下，HYH的表達(dá)量趨近于0，說(shuō)明黑暗條件下油菜中主要發(fā)揮作用的是HY5.甘藍(lán)型油菜幼苗時(shí)期BnHY5四個(gè)基因均有表達(dá)，但表達(dá)量存在差異.根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，無(wú)論是在黑暗還是光照下，HY5-2與HY5-3的表達(dá)量相當(dāng)且高于其他基因的表達(dá)量，HYH-1和HYH-2的表達(dá)量高于其他基因的表達(dá)量.HYH與HY5多個(gè)基因在無(wú)光條件下的表達(dá)量低于光照條件下的表達(dá)量.表明BnHY5與BnHYH對(duì)光因子的響應(yīng)存在相似的表達(dá)調(diào)控機(jī)制和一定的協(xié)同性.

3.5 外源激素和非生物脅迫處理下BnHY5-1的表達(dá)分析

外源激素處理下甘藍(lán)型油菜BnHY5-1基因的相對(duì)表達(dá)量如圖7所示，以0 hBnHY5-1在油菜中的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)，得到該基因在不同時(shí)間段甘藍(lán)型油菜中的相對(duì)表達(dá)量.分析發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜在GA3處理后，BnHY5-1的表達(dá)下調(diào)，其3 h的表達(dá)量是0 h的1/10；暗示GA3是HY5的負(fù)調(diào)控因子.在 ABA處理后BnHY5-1表達(dá)上調(diào)，其3 h的表達(dá)量是0 h的9倍，在處理 3 h后其表達(dá)量迅速增加，處理9 h后其表達(dá)量恢復(fù)至與0 h的相當(dāng)非生物脅迫處理下甘藍(lán)型油菜BnHY5-1的表達(dá)情況如下：鹽脅迫與鎘脅迫處理后BnHY5-1表達(dá)量如圖8(a)，(b)所示，分析發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜在鹽脅迫下，BnHY5-1的表達(dá)下調(diào)，暗示HY5是鹽脅迫應(yīng)答調(diào)控中的負(fù)調(diào)控因子.鎘脅迫處理后，BnHY5-1表達(dá)上調(diào)，處理后 3 h的表達(dá)量是未處理 時(shí)的 3.2倍；低溫脅迫處理后BnHY5-1表達(dá)上調(diào)，并且其表達(dá)量在很短的時(shí)間內(nèi)都呈大幅度變化的趨勢(shì)，處理2 h后其表達(dá)量是未處理時(shí)的 12倍，見(jiàn)圖8(d).高溫脅迫處理后，BnHY5-1表達(dá)上調(diào)，處理4 h后其表達(dá)量是未處理時(shí)的13倍，見(jiàn)圖8(c)，說(shuō)明BnHY5-1響應(yīng)非生物脅迫.

a,b,c,d表示該處理下表達(dá)量數(shù)據(jù)間存在顯著差異(P<0.05)

圖7 植物激素ABA與GA3處理下甘藍(lán)型油菜BnHY5-1基因的相對(duì)表達(dá)量

Fig.7 Relative expression ofBnHY5-1 under ABA and GA3treatment

3.6 甘藍(lán)型油菜BnHY5重復(fù)基因表達(dá)差異分析

與未做處理時(shí)油菜HY5各基因的表達(dá)量相比，甘藍(lán)型油菜在高溫脅迫(HT)，冷脅迫(LT)和ABA噴灑后，BnHY5的表達(dá)均上調(diào).在鹽脅迫(salt)處理下，BnHY5的表達(dá)均下調(diào).各個(gè)基因的表達(dá)量以同種處理中最低的一個(gè)為標(biāo)準(zhǔn)1，甘藍(lán)型油菜BnHY5各基因不同處理下的表達(dá)量見(jiàn)圖9(a).研究結(jié)果表明，在不同的非生物脅迫下，甘藍(lán)型油菜中BnHY5四個(gè)基因表達(dá)量存在差異，BnHY5-2的表達(dá)量是最高的.以四個(gè)基因的表達(dá)量之和為100%，分別計(jì)算單個(gè)基因的表達(dá)量占總量的比例，見(jiàn)圖9(b).以此分析各基因在不同脅迫下表達(dá)量占比的差異.據(jù)結(jié)果可以看出，同類(lèi)型的脅迫下四個(gè)基因的表達(dá)模式相同，不同的脅迫下，四個(gè)基因的表達(dá)模式發(fā)生變化.例如在高溫和低溫脅迫下，四個(gè)基因的表達(dá)量占比有著相同的特點(diǎn)：HY5-2的表達(dá)量占比最高，達(dá)到總量的一半，HY5-4和HY5-3的占比為24%和16%.而HY5-1的占比最少.而在鹽脅迫中(Salt stress)，HY5-1的表達(dá)量占比僅此于HY5-2，達(dá)到31%.由此可知，重復(fù)基因在非生物脅迫下的差異表達(dá)與非生物脅迫的類(lèi)型相關(guān).不同類(lèi)型的非生物脅迫，植物中參與應(yīng)答的調(diào)控通路不一樣，因此在這些通路中與HY5蛋白發(fā)生相互作用的因子就不同.這可能是導(dǎo)致BnHY5重復(fù)基因在不同非生物脅迫下，有不同的表達(dá)量占比的原因.

a,b,c,d代表該處理下BnHY5-1基因表達(dá)量存在顯著差異(P<0.05)

圖8 非生物脅迫和外源激素處理下BnHY5-1基因的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)量

Fig.8 Relative standard expression ofBnHY5-1 gene under abiotic stress treatment

4 討 論

4.1 擬南芥HY5蛋白與甘藍(lán)型油菜HY5蛋白的差異分析

根據(jù)氨基酸序列比對(duì)，找到了擬南芥HY5蛋白與油菜HY5蛋白主要的存在差異的部位.發(fā)現(xiàn)氨基酸序列50～60處4個(gè)親水性較強(qiáng)的氨基酸的缺少以及肽鏈中額外存在4處親疏水性不同氨基酸的替代.這種差異可能使得該結(jié)構(gòu)域局部構(gòu)型發(fā)生變化.但是運(yùn)用蛋白結(jié)構(gòu)建模得出的HY5 的LZ整體結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生特別明顯的改變.這種差異對(duì)這個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能有什么影響需要進(jìn)一步的研究.

4.2 甘藍(lán)型油菜BnHY5與其同源基因BnHYH的異同

甘藍(lán)型油菜HY5與其同源基因HYH在蛋白結(jié)構(gòu)上均有bZIP功能結(jié)構(gòu)域和COP1 interaction區(qū)，說(shuō)明兩者在光信號(hào)相關(guān)的信號(hào)通路中有著相似的功能.甘藍(lán)型油菜HYH蛋白亮氨酸拉鏈(LZ)部分關(guān)鍵的50個(gè)(90～140)氨基酸結(jié)構(gòu)建模結(jié)果表明，該部分不是僅僅可以形成LZ Homodimer部分，還可以形成與異源二聚化和異源三聚化相關(guān)的Nucleoporin Nup58/Nup45 Curated Alternative類(lèi)似的結(jié)構(gòu)域；和與核孔蛋白形成以及核定位相關(guān)的Nuclear Distribution Protein Nude-like 1結(jié)構(gòu).而對(duì)油菜HY5 LZ這50個(gè)氨基酸序列建模，發(fā)現(xiàn)只存在亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域；說(shuō)明油菜中HYH可能有著更多未知的功能.甘藍(lán)型油菜BnHY5與其同源基因BnHYH在黑暗下的表達(dá)量都低于光照下的表達(dá)量，這與擬南芥中相關(guān)研究的結(jié)論一致[8-9].光照條件下HY5 不能與移動(dòng)到細(xì)胞核外的COP1相互作用，使其大量積累，促進(jìn)了 HY5 轉(zhuǎn)錄因子下游信號(hào)的傳遞[19].黑暗條件下，HY5與在細(xì)胞核內(nèi)積累的COP1 的N末端結(jié)合使HY5蛋白泛素化降解，負(fù)調(diào)控 HY5 下游光形態(tài)建成下游基因的表達(dá)[20]，因此HY5在光照下比黑暗下的表達(dá)高.油菜在黑暗下，HYH的表達(dá)量趨近于0，說(shuō)明黑暗條件下油菜中主要發(fā)揮作用的是HY5. 油菜BnHY5與其同源基因BnHYH在黑暗下的表達(dá)量都低于光照下的表達(dá)量，這與擬南芥中相關(guān)研究結(jié)論一致[9,18,21].二者的表達(dá)模式與擬南芥HY5表達(dá)模式有著相同的特點(diǎn).對(duì)HY5同源基因HYH功能差異方面的研究需要更加精細(xì)的結(jié)構(gòu)研究和功能分析.

(a)

(b)

圖9 甘藍(lán)型油菜BnHY5重復(fù)基因在不同脅迫下的差異表達(dá)

(a) 不同處理下的各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量；

(b)不同處理下各個(gè)重復(fù)基因的表達(dá)占比a,b,c表示同個(gè)處理下基因相對(duì)表達(dá)量存在顯著差異(P<0.05)

Fig.9 Analysis of expression ofBnHY5 duplication with different treatments

4.3 甘藍(lán)型油菜BnHY5與非生物脅迫的關(guān)系

甘藍(lán)型油菜BnHY5在非生物脅迫下表達(dá)量的變化是確實(shí)存在的，說(shuō)明甘藍(lán)型油菜BnHY5與非生物脅迫相關(guān).鹽脅迫下BnHY5的表達(dá)量下降，說(shuō)明該基因在油菜鹽拮抗的調(diào)控中是一個(gè)負(fù)調(diào)控因子.甘藍(lán)型油菜在外源GA3處理后，BnHY5的表達(dá)量下調(diào)了；這與其他研究中GA3能夠抑制 HY5 的積累[21]的結(jié)論相證.其他脅迫處理后BnHY5的表達(dá)變化證明了甘藍(lán)型油菜HY5基因響應(yīng)非生物脅迫.從BnHY5表達(dá)分析看來(lái)，在油菜中具體的調(diào)控過(guò)程中，BnHY5表達(dá)量的差異可能更強(qiáng)調(diào)量的變化帶來(lái)的作用.此外，同類(lèi)型的脅迫處理下BnHY5重復(fù)基因有著相近的表達(dá)占比，而不同的非生物脅迫下，BnHY5多個(gè)基因表達(dá)量占比存在差異；說(shuō)明BnHY5重復(fù)基因很有可能與非生物脅迫相關(guān).推測(cè)在不同非生物脅迫下，它們的應(yīng)答機(jī)制及反應(yīng)時(shí)間和速度都是不同的.但是重復(fù)基因表達(dá)的具體調(diào)控過(guò)程還需要更進(jìn)一步的研究.

研究表明，在擬南芥光信號(hào)傳遞過(guò)程中有超過(guò)60%的基因是 HY5的靶基因[22-23].HY5轉(zhuǎn)錄因子ACGT序列是植物中的各種刺激響應(yīng)基因啟動(dòng)子的一個(gè)核心區(qū)[23].HY5轉(zhuǎn)錄因子參與植物脅迫下生命活動(dòng)相關(guān)基因的調(diào)控，所以分析多種脅迫條件下HY5表達(dá)變化趨勢(shì)是必要的.HY5基因在非生物脅迫上的研究很少.而甘藍(lán)型油菜中該基因還存在多個(gè)重復(fù)基因.本研究克隆所得四個(gè)甘藍(lán)型油菜HY5重復(fù)基因存在功能，并且與非生物脅迫相關(guān).通過(guò)對(duì)甘藍(lán)型油菜非生物脅迫下BnHY5的表達(dá)分析，了解到甘藍(lán)型油菜在不同的非生物脅迫下的表達(dá)特點(diǎn)，以及重復(fù)基因?qū)Ψ巧锩{迫的響應(yīng).為未來(lái)培育抗逆性強(qiáng)的油菜品種提供了分子育種的理論基礎(chǔ).