李 雪 裴 培 劉長云 王 珊

CRISPR/Cas9已被證明是一種簡單有效的基因組編輯工具[1]。CRISPR-Cas系統(tǒng)(CRISPR-Cas system)可以進(jìn)行多靶點基因編輯。CRISPR相關(guān)內(nèi)切酶(CRISPR-associated，Cas)能夠切斷外源性的核酸，并能夠由兩種小分子RNA將其定向到其靶基因序列上[2]。據(jù)報道cas蛋白家族已經(jīng)超過40多種，基于Cas蛋白的序列和結(jié)構(gòu)，CRISPR/Cas系統(tǒng)主要分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3種類型[3，4]。Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)僅需要單個Cas蛋白Cas9，其含有HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域和RUVC樣核酸酶結(jié)構(gòu)域[5]。該系統(tǒng)由兩部分組成——tracrRNA和crRNA，兩部分融合表達(dá)之后，形成一個具有引導(dǎo)功能的小向?qū)NA(small guide RNA, sgRNA)。sgRNA的5′端與目的DNA的20個核苷酸特異性結(jié)合，3′ 端可以結(jié)合核酸內(nèi)切酶Cas9并將其激活，引導(dǎo)Cas9對目的DNA進(jìn)行精確切割[6]。該技術(shù)因能更有效、更便捷地編輯基因而被廣泛應(yīng)用。

酵母沉默信息調(diào)節(jié)蛋白2(silent information regulators2, SIRT2)，是一個高度保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nieotinamide adenie diueleotide, NAD+)依賴的組蛋白去乙?；?histonedeacetylase, HDAC)和ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶[7]。哺乳動物的sirtuins蛋白有7類，分別為SIRT1～SIRT7，它們具有高度保守的NAD+結(jié)合域和催化功能域，不同的N端和C端使具有不同的底物特異性和亞細(xì)胞定位[8～10]。該家族成員參與基因沉默、新陳代謝、組蛋去乙酰化、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和抗衰老等多項生物學(xué)過程[11]。SIRT2最初作為微管蛋白的去乙?；副徽J(rèn)識，進(jìn)一步的研究表明，SIRT2可以去乙酰化很多重要的轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)蛋白，從而調(diào)控多種生物學(xué)過程[7，12]。SIRT2還可以對組蛋白進(jìn)行修飾、使其去乙酰化，在細(xì)胞周期的有絲分裂過程中，SIRT2從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核并與染色質(zhì)發(fā)生共定位。

本研究利用慢病毒結(jié)合CRISPR/Cas9技術(shù)將HEK293細(xì)胞中的SIRT2基因敲除，建立SIRT2穩(wěn)定敲除的細(xì)胞系，為深入研究SIRT2對組蛋白的修飾功能提供基礎(chǔ)。

材料與方法

1.實驗材料：人胚腎細(xì)胞HEK293(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所國家實驗細(xì)胞資源共享平臺)。人源胚胎腎細(xì)胞變種T細(xì)胞、菌種DH5ɑ(本實驗室保存)。0.25% Trypsin-EDTA、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)。PBS(美國Hylcone 公司)。細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板及移液管等細(xì)胞培養(yǎng)耗材(美國Coring公司)。二鹽酸嘌羅霉素(嘌呤霉素，puromycin dihydrochloride, 美國Amresco 公司)。lentiCRISPRv2質(zhì)粒(美國Addgene公司)；sgRNA寡核苷酸序列合成(中國碧云天生物技術(shù)研究所)。限制性內(nèi)切酶BsmBI(日本TaKaRa公司)。DNA提取試劑盒(中國天根生化科技有限公司)。PSMF、SDS-PAGE凝膠試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)。2×Loading Buffer(北京碧云天生物技術(shù)研究所)。BCA蛋白濃度定量試劑盒、蛋白Marker(美國Thermo Fisher Scientific公司)；超敏ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)。GADPH抗體、SIRT2抗體(美國Proteintech公司)。辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)山羊抗兔IgG(北京中杉金橋公司)、Acetyl-Histone H4(Lys5)抗體、Acetyl-Histone H4(Lys16)抗體、H3K79me2抗體(美國Cell Signaling公司)。

2.LentiCRISPR v2-sgRNA SIRT2敲除質(zhì)粒的構(gòu)建:人的SIRT2基因的Gene ID為22933，首先在NCBI中查找22933基因，找到該基因的CDS區(qū)，分析相應(yīng)的基因組結(jié)構(gòu)，明確CDS的外顯子部分。通過蛋白質(zhì)保守序列選擇對應(yīng)外顯子區(qū)域進(jìn)行靶點篩選。利用(http//crispr.mit.edu/)網(wǎng)站分析，獲得SIRT2基因sgRNA的候選序列(表1)。將SIRT2 sgRNA寡核苷酸單鏈退火形成雙鏈，與BsmBⅠ酶切線性化的lentiCRISPR v2質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5ɑ感受態(tài)中，挑取陽性單克隆菌落并提取質(zhì)粒送公司測序驗證。

表1 sgRNA的候選序列

3.慢病毒包裝:HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，細(xì)胞密度生長至60%～80%時開始轉(zhuǎn)染。分別將lentiCRISPR v2質(zhì)粒和lentiCRISPR-sgRNA SIRT2敲除質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒pSPAX2、pMD2.G以4∶3∶1共轉(zhuǎn)HEK293T細(xì)胞產(chǎn)生慢病毒顆粒。轉(zhuǎn)染后24h更換正常培養(yǎng)基，48～72h收集病毒上清液，并使用離心過濾器(Merck Millipore)根據(jù)制造商的方案進(jìn)行濃縮，觀察其顏色和黏稠度的變化。

4.慢病毒轉(zhuǎn)染及構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系:HEK293細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前按每孔40%的密度接種于12孔板。細(xì)胞長到80%時開始進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染。24h后用胰蛋白酶消化細(xì)胞，并以低密度重新鋪板，鋪板后的3h加入選擇劑。用指定濃度的嘌呤霉素處理細(xì)胞。第2天更換培養(yǎng)基，細(xì)胞每隔1天傳代1次。

5.HEK293細(xì)胞嘌呤霉素的最低致死濃度測定:將HEK293細(xì)胞接種于24孔板的12個孔，使每個孔的細(xì)胞量達(dá)到3×105，各設(shè)置兩個重復(fù)。待細(xì)胞生長良好后，加入嘌呤霉素，并按0、2、4、6、8、10μg/ml濃度梯度加入每孔中。細(xì)胞培養(yǎng)7天后，通過觀察，嘌呤霉素對HEK293細(xì)胞的最低致死濃度為2μg/ml，選擇2μg/ml嘌呤霉素來抑制陰性細(xì)胞。

6.組蛋白提?。杭?xì)胞用胰酶消化收集好后，向100mm培養(yǎng)皿中加入PBS洗滌3次，每次10ml；加入800μl含有5%蛋白酶抑制劑的Hypotonic Buffer，收集至離心管后震蕩混勻，冰上放置30min后4℃離心，6000r/min,離心5min；將上清液倒掉，然后向離心管中加入0.2mol/L的硫酸600μl，充分混勻，4℃旋轉(zhuǎn)過夜；離心4℃，13000r，離心min,離心5min；倒掉上清液，向離心管中加入TCA198μl，充分混勻后在冰上放置30min，每隔5min顛倒混勻1次；離心4℃，13000r/min，離心5min；棄掉上清液向離心管中加入1ml的丙酮，充分洗滌沉淀，此過程重復(fù)2～3次。離心4℃，13000r/min，離心5min；倒掉上清液后置冰上晾干，視沉淀量加入超純水進(jìn)行溶解。

7.蛋白質(zhì)免疫印跡：將制備好的組蛋白樣品上樣，10%聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉后加入一定比例稀釋的一抗，室溫3h或4℃孵育過夜。PBST洗膜3次，每次10min，用1∶2000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠或羊抗兔二抗室溫孵育1h，PBST洗膜3次，每次10min后，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑曝光顯影，全自動化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)掃描記錄，以GAPDH作為內(nèi)參，進(jìn)行分析比較，實驗重復(fù)3次。

結(jié) 果

1.LentiCRISPR v2-sgRNA SIRT2敲除質(zhì)粒鑒定，序列測定與設(shè)計的一致:對SIRT2-sgRNA寡核苷酸單鏈退火形成雙鏈，與BsmBⅠ酶切線性化的lentiCRISPR v2質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5ɑ感受態(tài)中，通過測序證實lentiCRISPR v2-sgRNA SIRT2敲除質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖1)。本文構(gòu)建的lentiCRISPR v2-sgRNA SIRT2敲除質(zhì)粒有SIRT2-sgRNA-4序列的插入，并且序列與所設(shè)計的一致。

圖1 構(gòu)建質(zhì)粒測序圖

2.T7E1法驗證SgRNA活性：T7E1法是驗證結(jié)果的金標(biāo)準(zhǔn)。為了檢測設(shè)計的sgRNA的有效性，在敲除位點的上游和下游設(shè)計PCR引物，上游引物：5′-TGTGCCTTTAGATGTGGGGA-3′；下游引物：5′-ACAAAGTGGAAGCACCTGGA-3′。長度約430bp，提取細(xì)胞基因組DNA，然后進(jìn)行PCR擴增。T7E1酶可以特異性地識別由正常鏈和突變鏈所形成的雜合雙鏈，對得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性和退火處理后加入T7E1 (核酸內(nèi)切酶，只切割堿基錯配的DNA)，即可檢測到突變體的存在。實驗結(jié)果證明，敲除(knock out, KO)了SIRT2基因的HEK293細(xì)胞其PCR擴增產(chǎn)物用T7E1酶切后可見明顯的切割條帶，說明預(yù)期的敲除位點附近存在大量sgRNA引導(dǎo)Cas9切割形成的缺失突變(圖2)。

圖2 Cas9介導(dǎo)的基因組中指定靶標(biāo)的T7E1測定

3.SIRT2穩(wěn)定敲除HEK293細(xì)胞株的構(gòu)建:通過慢病毒包裝并感染HEK293細(xì)胞，進(jìn)一步嘌呤霉素篩選，由lentiCRISPR v2質(zhì)粒包裝病毒感染細(xì)胞獲得的陽性克隆作為對照細(xì)胞。通過蛋白質(zhì)免疫印跡驗證SIRT2的敲除效率。結(jié)果顯示，與對照細(xì)胞系比較，敲除細(xì)胞系中SIRT2蛋白未見明顯表達(dá)，說明獲得了SIRT2完全有效敲除的HEK293細(xì)胞系。利用1號和2號SIRT2穩(wěn)定敲除細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)組蛋白修飾位點的檢測(圖3)。

圖3 與正常細(xì)胞系比較，敲除細(xì)胞系中SIRT2蛋白表達(dá)明顯降低1和2為兩個生物重復(fù)

4.SIRT2穩(wěn)定敲除對組蛋白乙?；揎棻磉_(dá)的影響：SIRT2敲除后，組蛋白H4K16乙?；乃脚c對照細(xì)胞比較顯著上升，Ko-con即同等未敲除SIRT2的HEK293細(xì)胞，Ko-SIRT2即敲出了SIRT2的基因(圖4)。其次檢測了在SIRT2穩(wěn)定敲除細(xì)胞中組蛋白H4K5乙?；乃?。SIRT2敲除后，組蛋白H4K5乙?；乃脚c對照細(xì)胞比較下降(圖5)。

5.SIRT2穩(wěn)定敲除對組蛋白甲基化修飾表達(dá)的影響：進(jìn)一步檢測在SIRT2穩(wěn)定敲除細(xì)胞中組蛋白H3K79me2甲基化的水平。SIRT2敲除后，組蛋白H3K79me2甲基化的水平與對照細(xì)胞比較升高(圖6)。

圖4 SIRT2敲除以后H4K16ac的水平升高與KO-Con比較，n=3,*P<0.05;1和2為兩個生物學(xué)重復(fù)

圖5 SIRT2敲除以后H4K5ac的水平降低與KO-Con比較，n=3，*P<0.05；1和2為兩個生物學(xué)重復(fù)

圖6 SIRT2敲除以后H3K79me2的水平升高與KO-Con比較，*P<0.05；1和2為兩個生物學(xué)重復(fù)

討 論

CRISPR/Cas9系統(tǒng)利用慢病毒屬(lentivirus) 載體將外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞，該載體具有安全性高，可在體內(nèi)長期表達(dá)的能力[13～16]。該系統(tǒng)主要是利用sgRNA引導(dǎo)Cas9核酸酶在靶位點處進(jìn)行DNA特異性剪切，達(dá)到敲除基因的目的[1]。與其他基因編輯技術(shù)比較，該系統(tǒng)的構(gòu)建更為簡單,更能滿足大多數(shù)區(qū)域的基因編輯需求。本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在HEK293細(xì)胞基因組水平上成功構(gòu)建了SIRT2基因敲除的細(xì)胞系。

組蛋白乙?；腿ヒ阴；揎椫饕袃深惷竻⑴c，即組蛋白乙?；?histone acetylase，HAT)和組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)。目前有3類組蛋白的去乙?；福琒IRT2作為第1個被發(fā)現(xiàn)的Ⅲ類組蛋白的去乙?；?，在組蛋白的修飾中發(fā)揮重要的作用。有文獻(xiàn)報道SIRT2可以使H4K16去乙?；?，從而在細(xì)胞分裂應(yīng)激時阻止染色質(zhì)凝聚。本研究首先檢測了在SIRT2穩(wěn)定敲除細(xì)胞中組蛋白H4K16乙?；乃健?/p>

SIRT2主要定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，同時也可以穿梭到細(xì)胞核內(nèi)充當(dāng)組蛋的去乙?；?，通過對H4K16去乙?；饔媒档虶2/M期染色質(zhì)的凝聚[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，SIRT2穩(wěn)定敲除HEK293細(xì)胞系，組蛋白H4K16乙?；乃脚c對照細(xì)胞比較顯著上升，與前期文獻(xiàn)報道一致。組蛋白H4K5乙?；乃脚c對照細(xì)胞比較下降，組蛋白H3K79me2的水平與對照細(xì)胞比較升高，說明SIRT2敲除后可能特異的調(diào)節(jié)甲基化和乙?；乃剑渚唧w調(diào)控機制尚不清楚，筆者后期還會繼續(xù)探究其具體作用機制，并做進(jìn)一步的研究。

SIRT2廣泛分布于全身的各個組織，在代謝組織中高表達(dá)，如大腦、肝臟、脂肪等組織[18]。SIRT2通過催化不同底物的去乙?；絽⑴c許多生物學(xué)過程。有研究表明，SIRT2沉默表達(dá)后，能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[19]。也有研究表明，在3T3-L1前脂肪細(xì)胞模型內(nèi)，SIRT2與FoxO1相互作用并使其乙?；瘻p少，從而影響脂肪生成與脂肪細(xì)胞的分化，表明SIRT2在脂肪生成中發(fā)揮重要作用，然而SIRT2在肥胖和代謝綜合征發(fā)病過程中的作用及機制尚不清楚。SIRT2是人類的Ⅲ類組蛋白去乙?；?，介導(dǎo)組蛋白及非組蛋白的去乙酰化修飾，本研究再一次驗證了SIRT2穩(wěn)定敲除HEK293細(xì)胞系特異的調(diào)節(jié)H4K16乙酰化的水平，該細(xì)胞系的構(gòu)建為與SIRT2相關(guān)疾病的發(fā)病機制的研究提供了可能性。

本研究通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功構(gòu)建了SIRT2的穩(wěn)定敲除細(xì)胞系，為進(jìn)一步深入研究SIRT2對組蛋白乙?；图谆恼{(diào)節(jié)及其對下游靶基因的調(diào)節(jié)作用提供了依據(jù)。