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        麥麩中烷基間苯二酚誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬和凋亡

        2020-03-31 04:30:02郭亞洲楊小明李月英
        食品科學(xué) 2020年5期
        關(guān)鍵詞:麥麩存活率組分

        郭亞洲,楊小明,,李月英

        (1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013;2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

        小麥?zhǔn)俏覈狈骄用裰魇?,隨著生活水平的提高,在食不厭精的傳統(tǒng)下,小麥的加工越來越精細(xì),其剝落的皮層混合少量未剝凈的胚乳和胚芽形成了麥麩。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),食用含有麥麩的全谷物制品可以降低肥胖、糖尿病和一些癌癥的發(fā)病率,特別是降低結(jié)腸癌、乳腺癌和前列腺癌的發(fā)病率[1-3]。麥麩脂溶性成分比水溶性成分能更有效抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞生長[4]。進(jìn)一步的研究表明,小麥麩皮中的烷基間苯二酚(alkylresorcinols,ARs)具有抗腫瘤活性[1]。ARs為1,3-二羥基苯衍生物,在苯環(huán)第5位碳上連接一個(gè)含奇數(shù)碳的烷基側(cè)鏈,主要由C15:0、C17:0、C19:0、C21:0、C23:0和C25:0組成[5-6],小麥麥麩中以C19:0和C21:0含量最高[7-8]。ARs結(jié)構(gòu)見圖1。

        圖 1 ARs結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structures of alkylresorcinols

        由ARs結(jié)構(gòu)式可知,其為兩性分子,易溶于非極性溶劑而難溶于水,其在水中的溶解能力與烷基鏈長相關(guān),烷基鏈越長,非極性程度越強(qiáng),在水中溶解性越差[9]。ARs烷基側(cè)鏈長度的增加還使其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用降低[10]。ARs在體內(nèi)的作用與其吸收、代謝密切相關(guān),小腸能部分吸收或代謝ARs,血漿中也檢測到一定濃度的ARs存在[11-13]。人群樣本調(diào)查發(fā)現(xiàn),人血漿中ARs含量與全麥或黑麥的攝入量呈正相關(guān),與遠(yuǎn)端結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)[11-14]。對(duì)ARs的抗腫瘤機(jī)理研究發(fā)現(xiàn),ARs能夠破壞腫瘤細(xì)胞的DNA并防止其修復(fù)[15],加速遺傳毒性損傷細(xì)胞的死亡率[16],抑制癌細(xì)胞形成。

        天然化合物通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬和凋亡可以達(dá)到控制癌癥細(xì)胞生長增殖的作用[17-19]。近年來有關(guān)ARs的抗腫瘤研究越來越多[1,10],但對(duì)ARs誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬和凋亡的具體研究報(bào)道較少。本研究采用制備色譜法從麥麩中分離純化得到ARs中含量最高的兩個(gè)同系物(C19:0和C21:0),以液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)對(duì)2 個(gè)ARs同系物進(jìn)行結(jié)構(gòu)驗(yàn)證,并探討ARs對(duì)人肝癌(HepG2)細(xì)胞自噬和凋亡的作用,為開發(fā)麥麩作為輔助抗腫瘤功能性食品原料提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        麥麩 鎮(zhèn)江富華面粉有限公司;HepG2細(xì)胞中國科學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)研究所(上海)。

        Fast Blue RR 1/2 ZnCl2上海羅恩試劑公司;甲醇(色譜級(jí)) 美國TEDIA公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA) 美國Gibco公司;噻唑藍(lán)(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO) 美國Sigma公司;山羊抗小鼠多克隆免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)(稀釋比1∶10 000)、山羊抗兔多克隆IgG(稀釋比1∶10 000)、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒上海碧云天生物技術(shù)公司;β-actin抗體(稀釋比1∶1 000) 圣克魯斯生物技術(shù)(上海)有限公司;剪切型Caspase3抗體 沈陽萬類生物科技有限公司;其余抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司;其他試劑(均為分析純)均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑(上海)有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        HSGF254硅膠板(20 cm×20 cm,0.4~0.5 mm)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑(上海)有限公司;制備高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀(配備WK 500LC-500P泵、SPD-500紫外檢測器、Marathon XT手動(dòng)進(jìn)樣器) 杭州旭昱科技股份有限公司;LC-MS儀(配備Xcalibur 2.0.7 SPI軟件、LXQ離子阱) 美國Thermo公司;iMark-17852酶標(biāo)儀美國Bio-Rad公司;FACSCalibur流式細(xì)胞儀 美國BD公司;MiniChemi化學(xué)發(fā)光成像儀 北京賽奇創(chuàng)想科技有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 ARs的制備和鑒定

        ARs的制備:干燥的麥麩經(jīng)16 目篩過濾除去粉末,取1 kg麥麩于2 L乙酸乙酯中浸泡48 h,真空抽濾,濾渣重復(fù)浸提2 次,合并提取液,旋蒸得到浸膏。浸膏以少量乙酸乙酯溶解,點(diǎn)樣于HSGF254制備薄層硅膠板,用石油醚-乙酸乙酯(7∶3,V/V)展開。根據(jù)間苯二酚與重氮鹽特異性顯色反應(yīng)確定Rf[20],采集斑點(diǎn),洗脫,濃縮。將初次分離物采用柱層析(2 cm×35 cm,200~300 目硅膠)二次純化,用氯仿-乙醚(9∶1,V/V)以2 mL/min流速洗脫,10 mL/管,用紫外光譜掃描和重氮鹽反應(yīng)檢測各管中的ARs。依據(jù)ARs紫外特征吸收峰[20-21]結(jié)合ARs與重氮鹽顯色反應(yīng)呈紫紅色,選取餾分,合并濃縮。濃縮的餾分繼續(xù)采用制備HPLC儀分離,收集AR C19:0和C21:0餾分。HPLC條件:Welch Ultimate AQ-C18色譜柱(250 mm×21.2 mm,10 μm);流動(dòng)相甲醇;流速12 mL/min;紫外檢測波長280 nm。

        ARs的鑒定:用LC-MS對(duì)純化后組分進(jìn)行成分鑒定。檢測條件:流動(dòng)相為甲醇;流速1.0 mL/min;紫外檢測波長280 nm;進(jìn)樣量20 μL;電噴霧電離源;負(fù)離子模式;掃描范圍m/z 50~1 000;噴霧電壓4.5 kV;鞘氣流量35 arb;輔助氣體流量5 arb;離子傳輸管溫度180 ?C;噴霧壓力1.4 MPa;毛細(xì)管溫度275 ?C;毛細(xì)管電壓30 V;透射電子顯微鏡電壓100 V。

        1.3.2 細(xì)胞存活率測定

        采用MTT法測定ARs的細(xì)胞毒性。HepG2細(xì)胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液在37 ?C、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞,以5×103個(gè)/孔接種于96 孔板,待細(xì)胞貼壁后用不同終質(zhì)量濃度(10、20、40、80、160、320 μg/mL)的ARs(用DMSO溶解,且細(xì)胞培養(yǎng)液中DMSO體積分?jǐn)?shù)不超過0.1%)處理細(xì)胞,對(duì)照組每孔加入100 μL含有體積分?jǐn)?shù)0.1% DMSO的培養(yǎng)液,無細(xì)胞孔加入培養(yǎng)液作為空白組,每組5 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24、48 h后,每孔加入10 μL 5 mg/mL MTT處理4 h,吸去培養(yǎng)液,加入100 μL/孔DMSO溶解生成的甲瓚晶體,用酶標(biāo)儀在490 nm處測定各孔光密度值。細(xì)胞存活率按下式計(jì)算。

        用SPSS 22.0軟件計(jì)算ARs的半抑制質(zhì)量濃度(half inhibitory concentration,IC50)。

        1.3.3 Annexin V-FITC/PI檢測細(xì)胞凋亡

        以5×105個(gè)/孔將HepG2細(xì)胞接種在6 孔板,經(jīng)終質(zhì)量濃度80、160 μg/mL ARs處理24 h后,根據(jù)Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作收取細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀采集2萬 個(gè)細(xì)胞樣本并分析各組細(xì)胞凋亡率。

        1.3.4 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測蛋白表達(dá)

        以5×105個(gè)/孔將HepG2細(xì)胞接種在6 孔板。經(jīng)不同終質(zhì)量濃度ARs處理24 h后,根據(jù)王海等[18]的方法提取細(xì)胞總蛋白并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行曝光。使用ImageJ軟件分析各蛋白條帶灰度。

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

        結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3 次。使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和Student t檢驗(yàn),P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 ARs制備結(jié)果

        麥麩乙酸乙酯提取物首先采用HSGF254硅膠板粗分離,分別收集各斑點(diǎn),采用重氮鹽特異性顯色,顯色反應(yīng)呈紅色的斑點(diǎn)(Rf=0.52)含有間苯二酚結(jié)構(gòu),收集Rf=0.52的斑點(diǎn)組分,進(jìn)行硅膠柱色譜分離。根據(jù)硅膠柱色譜各餾分的紫外掃描圖,組分5和組分6在275 nm和280 nm波長處具有ARs特征吸收峰(圖2),且與重氮鹽顯色反應(yīng)陽性。

        圖 2 柱層析收集組分4~7的紫外掃描光譜Fig. 2 UV absorption spectra of fractions 4 through 7 eluted from column chromatography

        將符合上述條件的組分(組分5、6)進(jìn)行合并濃縮,用制備HPLC進(jìn)一步純化。根據(jù)制備HPLC圖,收集2 種含量較高的組分。將保留時(shí)間為10.715 min的組分記為A1;保留時(shí)間13.607 min的組分記為A2(圖3)。

        圖 3 組分5、6的制備HPLC圖Fig. 3 Preparative high performance liquid chromatography of fractions 5 and 6

        2.2 LC-MS鑒定ARs結(jié)構(gòu)的結(jié)果

        圖 4 組分A1、A2的LC-MS分析圖譜Fig. 4 LC-MS chromatograms of fractions A1 and A2

        LC-MS分析的總離子流圖和質(zhì)譜圖如圖4所示。組分A1、A2的一級(jí)質(zhì)譜分別顯示了m/z 376和m/z 404分子離子。根據(jù)一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖,2 個(gè)主峰的碎片損失均為m/z 42,考慮到分析物的結(jié)構(gòu),這種損失對(duì)應(yīng)于乙烯酮(C2H2O),這與Ross等[22]對(duì)ARs的研究結(jié)果一致。上述結(jié)果證實(shí)分離物成分是ARs C19:0和C21:0。根據(jù)總離子流圖,用面積歸一化法得到兩種組分的總相對(duì)含量為81%。這些ARs C19:0和C21:0同系物在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中簡稱為ARs。

        2.3 ARs處理對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響

        圖 5 ARs處理對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig. 5 Effects of AR treatments on the survival rate of HepG2 cells

        由圖5可知,40、80、160 μg/mL和320 μg/mL ARs處理HepG2細(xì)胞24 h和48 h后,細(xì)胞存活率高度顯著降低(P<0.001),呈劑量和時(shí)間依賴效應(yīng)關(guān)系,處理48 h時(shí)對(duì)細(xì)胞毒性更加明顯。結(jié)果顯示ARs對(duì)體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞活力具有較好的抑制效果,計(jì)算得到其IC50為112.6 μg/mL。

        2.4 ARs處理對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

        圖 6 ARs處理對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響Fig. 6 HepG2 cell apoptosis detected by flow cytometry

        采用80、160 μg/mL的ARs處理HepG2細(xì)胞24 h,經(jīng)Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率,結(jié)果如圖6A~C所示。由圖6D可知,160 μg/mL ARs誘導(dǎo)后細(xì)胞凋亡率相比對(duì)照組極顯著升高(P<0.01)。

        2.5 ARs處理對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

        圖 7 蛋白免疫印跡法檢測HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Fig. 7 Expression of apoptosis-associated proteins detected by Western blot

        分別用10、20、40、80 μg/mL和160 μg/mL ARs處理HepG2細(xì)胞24 h,細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白免疫印跡圖如圖7A所示。由圖7可知,較高質(zhì)量濃度(80、160 μg/mL)ARs處理24 h,促凋亡蛋白Bax相對(duì)表達(dá)水平高度顯著增加,且抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減少,凋亡啟動(dòng)蛋白剪切型Caspase3相對(duì)表達(dá)水平高度顯著增加(P<0.001)。

        2.6 ARs處理對(duì)HepG2細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

        圖 8 蛋白免疫印跡法檢測HepG2細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量Fig. 8 Expression of autophagy-associated proteins detected by Western blot

        用0、40、80、160 μg/mL ARs處理HepG2細(xì)胞24 h,其自噬相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果如圖8A所示。由圖8B~D可知,160 μg/mL ARs處理細(xì)胞24 h后,自噬上游蛋白Beclin-1相對(duì)表達(dá)量極顯著升高(P<0.01),LC3II蛋白表達(dá)水平極顯著增加(P<0.01),自噬下游蛋白p62表達(dá)極顯著下降(P<0.01),細(xì)胞自噬水平增加。以上結(jié)果表明,ARs可能通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)誘導(dǎo)自噬體形成和自噬溶酶體溶解,從而誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬。

        3 討 論

        全谷物食品對(duì)心血管疾病和某些癌癥的預(yù)防作用已經(jīng)被流行病學(xué)研究所證實(shí)[13]。麥麩中ARs的抗腫瘤作用越來越引起廣泛的關(guān)注[1,23]。對(duì)麥麩中活性化合物的研究,及全麥?zhǔn)称返臓I養(yǎng)及麥麩的開發(fā)利用都有一定的價(jià)值。

        前期已有研究報(bào)道ARs具有體外抑制前列腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞生長的效果,但大多數(shù)研究限于細(xì)胞存活率的測定[1-3],未有更進(jìn)一步的研究。本研究也發(fā)現(xiàn)經(jīng)ARs處理后HepG2細(xì)胞存活率顯著降低,說明ARs對(duì)體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞具有較好的生長抑制效果,經(jīng)ARs處理后細(xì)胞凋亡率顯著增加,證明ARs可以通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤效果。Bcl-2是典型的凋亡抑制因子,Bax是典型的凋亡促進(jìn)因子,Bcl-2和Bax的表達(dá)情況常被用作評(píng)價(jià)癌變程度[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ARs通過顯著下調(diào)Bcl-2表達(dá)和上調(diào)Bax表達(dá)來促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。Caspases家族作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞中程序性死亡的介導(dǎo)者和執(zhí)行者參與癌細(xì)胞的凋亡,大多細(xì)胞凋亡需要通過Caspase3介導(dǎo)的信號(hào)傳遞途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[17]。ARs通過增加肝癌細(xì)胞中的Caspase3表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡,起到體外抗癌效果。自噬的失調(diào)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移之間存在密切關(guān)系,過度的自噬也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。自噬體中LC3I的存在和LC3II的轉(zhuǎn)化被用作自噬的指標(biāo)[24-25]。自噬細(xì)胞內(nèi)p62含量與Beclin-1和LC3II表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)[25-26]。ARs能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)Beclin-1和LC3II蛋白表達(dá)水平升高,p62蛋白表達(dá)水平下降,從而促進(jìn)HepG2細(xì)胞發(fā)生自噬。

        綜上所述,ARs能夠有效地抑制人肝癌HepG2細(xì)胞生長,起到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。ARs可能通過上調(diào)Bax/Bcl-2的表達(dá)來激活Caspase通路進(jìn)而誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡。ARs也能通過促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生過度自噬從而引起細(xì)胞死亡,但其誘導(dǎo)自噬與凋亡之間的聯(lián)系仍需深入研究。小麥麩皮ARs良好的抗腫瘤活性使其具有良好的開發(fā)利用價(jià)值。

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