馮衛(wèi)紅 郭 娜 米 陽 曹 麗

西北婦女兒童醫(yī)院(西安,710000)

胎兒生長受限(FGR)在我國發(fā)病率為5%～10%[1],是導(dǎo)致圍產(chǎn)兒死亡的首要原因,且增加遠(yuǎn)期代謝綜合征、神經(jīng)行為發(fā)育異常等發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[2]。FGR可單獨(dú)出現(xiàn),也可與妊娠期疾病如妊娠期高血壓疾病(HDCP)、妊娠期糖尿病(GDM)等伴隨存在[3]。既往對GDM所致圍產(chǎn)兒并發(fā)癥的研究多集中于巨大兒,而對FGR的研究相對較少,機(jī)制未闡明增加了GDM管理難度。臨床研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)可介導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡,與GDM及其相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[4]。脂質(zhì)代謝多在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)生,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)可引起脂質(zhì)及營養(yǎng)素累積異常,加重細(xì)胞損傷及凋亡[5]。本研究從血清學(xué)與胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)行為方面探討GDM伴FGR孕婦的可能發(fā)病機(jī)制,觀察脂代謝異常與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及疾病發(fā)生的可能關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2018年1月—2019年6月在本院接受規(guī)律產(chǎn)檢并分娩的GDM孕婦126例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合GDM診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②單胎妊娠；③既往無長期服藥、酗酒、吸煙史；④無飲食限制。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往心、腦、肝、腎等疾病者；②合并慢性高血壓、糖尿病、血脂異常等者；③既往反復(fù)自然流產(chǎn)、死胎或死產(chǎn)史。根據(jù)是否伴FGR分為單純GDM組和GDM+FGR組。另選同期健康分娩孕婦為對照組。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批,研究對象均自愿參并簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1血清學(xué)指標(biāo)取入組孕婦晨空腹靜脈血,采用改良銅試劑比色法測定血清游離脂肪酸(FFA),試劑盒由南京建成科技有限公司生產(chǎn)；日立7600自動(dòng)全生化分析儀酶法測定血清總磷脂(PL)水平,試劑盒由浙江東甌生物工程有限公司生產(chǎn)。

1.2.2組織學(xué)標(biāo)本處理各組孕婦均于剖宮產(chǎn)時(shí)或胎盤娩出后,立刻在無菌狀態(tài)下于臍帶根部采集胎盤組織4～6塊,每塊體積1.0cm×1.0cm×1.0cm,注意避開出血、鈣化及梗死區(qū)。胎盤標(biāo)本以無菌生理鹽水沖洗數(shù)次,用無菌棉紗布吸干水分,其中2～3塊置4℃ 2.5%戊二醛中固定,用于石蠟包埋和連續(xù)切片行電鏡檢查；另2～3塊置經(jīng)高溫高壓處理的EP管內(nèi),立即投入液氮冷卻,置-80℃中統(tǒng)一待測mRNA。上述操作均在5min內(nèi)完成。

1.2.3組織學(xué)檢查①免疫組化檢查：對戊二醛固定的胎盤標(biāo)本進(jìn)行切塊,以4%戊二醛及1%鋨酸雙固定,然后按100%、95%、70%、50%乙醇梯度脫水各5min,以環(huán)氧樹脂包埋后切片。超薄切片采用檸檬酸鉛以及醋酸雙氧鈾雙染色處理,電鏡下觀察并拍攝。②實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測： TRIzol法提取細(xì)胞總RNA(美國Invitrogen公司試劑盒)。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(Maxima First Strand Synthesis Kit Thermo Scientific公司試劑盒),總體積為10μl,逆轉(zhuǎn)錄條件：42℃ 40min→85℃ 5min,短暫離心后迅速冰上冷卻,置-20℃冰箱保存待用。Step One Real-Time PCR系統(tǒng)由Applied Biosystems公司提供,采用qRT-PCR技術(shù)檢測,主要檢測胎盤組織中葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-12(Caspase-12)、C/EBP 同源蛋白(CHOP)、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因(Bcl-2)相關(guān)X蛋白(Bax) mRNA基因表達(dá),以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因,RT-PCR引物由上海生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成,引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性20s→95℃變性3s→60℃退火/延伸30s,共40個(gè)循環(huán)。采用相對定量法2-△△Ct進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì),Ct值即每個(gè)PCR反應(yīng)管中熒光信號(hào)達(dá)到預(yù)設(shè)閾值的循環(huán)數(shù)。

表1 基因引物序列擴(kuò)增片段

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

GDM組85例,年齡(29.1±4.0)歲(23～40歲),孕周(37.7±0.6)周(37～40周)； GDM+FGR組41例,年齡(29.3±4.1)歲(22～40歲),孕周(37.6±0.5)周(37～39周)。對照組50例,年齡(28.9±3.7)歲(22～40歲),孕周(38.2±0.8)周(37～42周)。3組年齡、分娩孕周無差異(P>0.05)。

2.2 各組血清FFA 、PL 水平比較

血清FFA、PL水平,GDM+FGR組最高、GDM組次之、對照組最低(P<0.05)。見表2。

2.3 各組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超微結(jié)構(gòu)特征

鏡下觀察顯示,對照組胎盤組織中滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富且形態(tài)規(guī)整,未見腫脹、擴(kuò)張等表現(xiàn)(圖1A)(2137頁)。GDM組(圖1B)(2137頁)和GDM+FGR組(圖1C)(2137頁)胎盤組織中滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在脫顆粒表現(xiàn),伴有明顯擴(kuò)張甚至融合,且以GDM+FGR組融合較多見。

表2 各組血清FFA 、PL 水平比較

2.4 各組胎盤組織中蛋白表達(dá)水平

GDM組和GDM+FGR組胎盤組織中GRP78、Caspase-12、CHOP、Bax mRNA表達(dá)水平,GDM+FGR組最高、GDM組次之、對照組最低(P<0.05)。見表3。

表3 各組胎盤組織中各蛋白表達(dá)比較

2.5 血清學(xué)指標(biāo)與胎盤蛋白表達(dá)的相關(guān)性

Pearson線性相關(guān)性分析顯示,對照組血清FFA、PL水平與胎盤GRP78、Caspase-12、CHOP、Bax mRNA表達(dá)無相關(guān)性(P>0.05),而GDM組和GDM+FGR組血清FFA、PL水平均與胎盤GRP78、Caspase-12、CHOP、Bax mRNA表達(dá)呈正相關(guān)性(P<0.05)。見表4。

表4 各組血清學(xué)指標(biāo)與胎盤各蛋白表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

FGR潛在致病因素較多,常與孕婦GDM、HDCP、血液高凝狀態(tài)等有關(guān)。既往研究多集中于HDCP合并FGR的研究,缺乏對GDM合并FGR的研究[7]。GDM往往因孕期血糖控制不良并發(fā)HDCP等,導(dǎo)致胎盤功能下降,合并FGR時(shí)可增加圍產(chǎn)兒死亡風(fēng)險(xiǎn),推測兩種病癥可能存在共同的病理生理基礎(chǔ)[8]。

胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、遷移在胚胎植入以及母-胎免疫耐受中具有關(guān)鍵性作用[9]。有研究表明,滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為可能與子癇前期或子癇、流產(chǎn)、GDM及FGR等有關(guān),可能涉及氧化應(yīng)激因子、血管生成因子等調(diào)節(jié)作用[10]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在蛋白質(zhì)翻譯后的修飾、折疊以及寡聚化過程中具有重要作用,平衡受損可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)激活,誘發(fā)多蛋白基因異常表達(dá),引起細(xì)胞損傷甚至凋亡[11-12]。妊娠期婦女內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)代謝功能的維持中具有重要作用。有研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)與子癇前期、糖尿病、肥胖等密切相關(guān),且在GDM孕婦中具有明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)[13-14]。因此推測,由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所誘發(fā)的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為異常可能影響了胎盤功能及胎兒發(fā)育,而胎盤發(fā)育障礙或功能降低先于FGR的發(fā)生[15]。有研究顯示,GDM孕婦存在胎盤超微結(jié)構(gòu)改變,且直接影響胎兒生長[16]。本研究顯示,GDM孕婦胎盤組織中存在明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、腫脹等病理改變,且在GDM+FGR組表現(xiàn)尤為明顯。提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能與胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞異常有關(guān),而二者可能與GDM及FGR的發(fā)生有關(guān)。

在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下,激酶ASK1/JNK激活、Caspase-12活化以及CHOP/GADD153路徑活化是引起細(xì)胞凋亡的主要途徑[17]。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中的特異性轉(zhuǎn)錄因子,在能量代謝及細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程中具有重要調(diào)節(jié)作用；當(dāng)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)下可大量生成,并可誘導(dǎo)Bax等系列下游凋亡分子激活,并下調(diào)Bal-2等抗凋亡基因表達(dá),啟動(dòng)細(xì)胞凋亡途徑,誘導(dǎo)細(xì)胞周期停止或細(xì)胞凋亡[18]。 Caspase-12是介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)途徑中的關(guān)鍵蛋白。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)下,鈣離子平衡紊亂可導(dǎo)致Caspase-12被大量激活并移位至細(xì)胞質(zhì)內(nèi),進(jìn)而激活Caspase-3、Caspase-9等而觸發(fā)細(xì)胞凋亡[19]。同時(shí),激活的Caspase-12可誘導(dǎo)細(xì)胞色素C等因子釋放,誘導(dǎo)下游促凋亡因子的激活而引起細(xì)胞凋亡[20]。本研究檢測胎盤中GRP78、Caspase-12、CHOP及Bax mRNA表達(dá)顯示,在GDM及GDM+FGR組中均呈明顯高表達(dá),且GDM+FGR組最高,與韓云等[21]報(bào)道基本一致。推測GDM孕婦的胎盤組織中存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),且GDM合并FGR時(shí)細(xì)胞凋亡可能增多。

妊娠期體內(nèi)激素分泌增加可影響脂代謝,以TG升高為主[22]。高TG血癥可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生。TG可分解成為甘油和FFA,FFA是體內(nèi)脂肪的主要供能形式,在妊娠中晚期孕婦體內(nèi)開始明顯升高[23]。FFA過?？僧a(chǎn)生“脂毒性”,主要通過誘導(dǎo)炎性因子分泌、線粒體功能損害、氧化應(yīng)激損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷等而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[24]。因此,FAA水平是機(jī)體膜質(zhì)代謝障礙、脂質(zhì)損害的重要指標(biāo),也是引起細(xì)胞功能障礙的重要因素。PL在維持穩(wěn)定細(xì)胞膜流動(dòng)性及膜依賴性代謝中具有重要作用,同時(shí)也是膽汁的重要組成部分。為維護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,體內(nèi)PL代償性升高,故PL異常升高也提示體內(nèi)脂質(zhì)代謝異常[25]。本研究中,GDM組和GDM+FGR組的血清FFA、PL水平均明顯高于對照組,提示GDM孕婦存在脂肪酸代謝障礙及PL代償性升高。研究顯示,“脂毒性”的主要特征為脂質(zhì)大量蓄積于非脂肪組織中,可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增加及細(xì)胞凋亡。業(yè)已證實(shí),GDM孕婦血清FFA水平較正常妊娠孕婦明顯升高[26]。FFA異?？梢鸺?xì)胞功能紊亂,加速血管內(nèi)皮細(xì)胞合成TG,增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的過氧化反應(yīng)引起細(xì)胞損傷,從而引起子宮胎盤缺氧、缺血最終導(dǎo)致FGR[27]。本研究中,GDM+FGR組的血清FFA及PL水平均高于GDM組,推測血清FFA及PL過表達(dá)可能加重了“脂毒性”及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),誘發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及子宮胎盤缺血,進(jìn)而引起FGR的發(fā)生。相關(guān)性分析顯示,GDM組和GDM+FGR組,血清FFA及PL水平均與胎盤中GRP78、Caspase-12、CHOP、Bax mRNA表達(dá)成正相關(guān)性,且以GDM+FGR組的相關(guān)性更強(qiáng)。提示孕婦機(jī)體脂質(zhì)改變可能產(chǎn)生“脂毒性”而參與GDM的發(fā)生,且FFA及PL過表達(dá)可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增加及隨后發(fā)生的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為異常有關(guān)。

綜上所述,GDM孕婦存在血清FFA、FL異常升高,可能參與了胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,導(dǎo)致胎盤組織中GRP78、Caspase-12、CHOP、Bax mRNA過表達(dá),引起細(xì)胞增殖、侵襲性遷移能力減弱而增加細(xì)胞凋亡；且合并FGR時(shí)“脂毒性”及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)更強(qiáng),加重了胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的異常。早期調(diào)節(jié)FFA、FL水平及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)通道,糾正胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為異常,可能在改善GDM不良妊娠結(jié)局、防治FGR中有一定作用。