張愛靜，李琳瓊，王鵬杰，高瑀瓏

（南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實驗室，南京 210023）

0 引言

【研究意義】大腸桿菌是一類在自然界廣泛存在且極易引起食品污染的革蘭氏陰性菌[1]。在自然環(huán)境中，大腸桿菌經(jīng)常遭受高溫、低溫、酸、堿及滲透壓等不適環(huán)境的脅迫，由于被不適環(huán)境條件脅迫，誘發(fā)其啟動自我保護(hù)機(jī)制，通過對外界不利環(huán)境的適應(yīng)而進(jìn)行生長。在食品生產(chǎn)加工過程中，食品原料中的微生物經(jīng)常處于脅迫環(huán)境中，面對不適宜的生長環(huán)境條件，其生理代謝會發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，通過這種對不良環(huán)境的適應(yīng)能力使其生存下來[2-3]。高溫殺菌是食品工業(yè)中通常采用的一種滅菌手段[4]。微生物的耐熱性不僅受遺傳因素的影響，還受環(huán)境因素的影響[5]。微生物會對不利的生存環(huán)境產(chǎn)生抗性或適應(yīng)性反應(yīng)的機(jī)制，近年來引起了研究者的廣泛關(guān)注[6-7]。然而，微生物對不利環(huán)境因素產(chǎn)生抗性或適應(yīng)性反應(yīng)的機(jī)制尚未研究清楚，深入系統(tǒng)研究大腸桿菌在食品加工過程中熱脅迫響應(yīng)機(jī)制，為高溫殺菌技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)，對于保障食品加工安全，建立食品質(zhì)量安全控制體系具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】GIULIODORI等[8]研究發(fā)現(xiàn)，將大腸桿菌從最適培養(yǎng)溫度37℃轉(zhuǎn)移至10℃培養(yǎng)時，其會迅速做出冷應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)相關(guān)基因的合成與冷休克蛋白的表達(dá)等。CEBRIáN等[9]通過對金黃色葡萄球菌進(jìn)行亞致死性的酸、堿和過氧化氫脅迫處理，發(fā)現(xiàn)與原始對照菌株相比，適應(yīng)性菌株對這些致死條件的抗性增加，表明金黃色葡萄球菌經(jīng)過酸、堿和過氧化氫脅迫處理產(chǎn)生了抗性。有研究認(rèn)為[10-11]，細(xì)胞膜流動性發(fā)生變化是菌體對不利生存環(huán)境產(chǎn)生適應(yīng)性的原因之一。細(xì)胞膜是緊貼在細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)包裹細(xì)胞質(zhì)的一層柔軟而富有彈性的半透性薄膜，是由磷脂和蛋白質(zhì)分子組成的生物膜。流動的脂質(zhì)雙分子層是生物膜結(jié)構(gòu)的基本特征，適宜的流動性是保證細(xì)胞處于正常生理狀態(tài)的重要條件。BENEY等[12]研究表明，脅迫蛋白參與信號傳導(dǎo)，在防止蛋白變性和穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)方面起到一定作用。微生物對環(huán)境變化的感受和迅速做出反應(yīng)的能力對其生存尤為重要，大多數(shù)微生物都有這樣的能力[13-15]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】根據(jù)張愛靜等[16]的研究，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌ATCC43889分別經(jīng)50℃、60℃和70℃10次熱脅迫均可誘導(dǎo)其抗熱性增加，經(jīng)10次熱脅迫并轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后，D值顯著增大（P＜0.05），且脅迫溫度越高，D值越大。然而，微生物對熱脅迫環(huán)境因素產(chǎn)生抗性或適應(yīng)性反應(yīng)的機(jī)制尚不清楚。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以食品生產(chǎn)加工中常見的污染菌大腸桿菌為試材，研究熱脅迫作用下大腸桿菌抗熱性增加與個體形態(tài)變化、生物被膜生成能力、細(xì)胞膜脂肪酸組成、細(xì)胞膜流動性變化以及外膜蛋白表達(dá)的關(guān)系，旨在綜合分析熱脅迫誘導(dǎo)大腸桿菌耐熱性增加的機(jī)制，為研究食品加工條件，加強(qiáng)食品安全預(yù)測及控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2018年在南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院進(jìn)行。

1.1 材料與試劑

大腸桿菌ATCC43889購于江蘇省疾病預(yù)防控制中心，采用胰蛋白胨大豆肉湯（Trypticase Soy Broth，TSB）培養(yǎng)基培養(yǎng)。供試菌經(jīng)活化后，接入TSB培養(yǎng)基，36℃、140 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h，備用。

正己烷、甲醇、乙醚和甲基叔丁基醚為色譜純；氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鎂、氯仿、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、戊二醛、乙醇、冰乙酸為分析純；37種脂肪酸甲酯混標(biāo)；TSB培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂（Trypticase Soy Agar，TSA）培養(yǎng)基，購于南京丁貝生物科技有限公司。

皂化溶液I：由15 g氫氧化鈉、50 mL甲醇與50 mL蒸餾水混合配制；甲基化溶液Ⅱ：由65 mL 6 mol·L-1鹽酸與55 mL甲醇混合配制；萃取溶液Ⅲ：由50 mL正己烷與50 mL乙醚混合配制；洗滌溶液Ⅳ：由0.36 g氫氧化鈉與30 mL蒸餾水混合配制。

無菌緩沖液A（10 mmol·L-1PBS，pH 7.2—7.4）；無菌緩沖液B（包含10 mmol·L-1MgCl2與250 mmol·L-1Tris，pH 7.5）；無菌緩沖液C（50 mmol·L-1Tris/HCl，pH7.4）。

彩虹180廣譜蛋白Marker、5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液、TritionX-100、30%丙烯酰胺制膠液、四甲基乙二胺、過硫酸銨、考馬斯亮藍(lán)R250、BCA蛋白濃度測定試劑盒、96孔微量酶標(biāo)板和色譜柱HP-5（30 m×0.32 mm×0.25 μm），購于南京丁貝生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S塞多斯精密電子天平，北京塞多斯天平有限公司；601超級恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠；GL-21M高速冷凍離心機(jī)，上海市離心機(jī)械研究所有限公司；M200多功能酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；S-3400N II掃描電子顯微鏡，日本Hitachi公司；Agilent 6820型氣相色譜儀，GCMS-QP2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用設(shè)備，安捷倫科技儀器公司；DSC-8000差示掃描量熱儀，珀金埃爾默股份有限公司；JY-SCZ2+電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；ZF-258凝膠成像系統(tǒng)，上海金鵬分析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 3種抗熱性大腸桿菌ATCC43889菌株的獲得將1.1中活化的原始對照菌株ATCC43889按體積比為1%轉(zhuǎn)接至裝有200 mL TSB培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，36℃、140 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h至穩(wěn)定期，分別將10 mL培養(yǎng)液加入無菌的中號試管（20 mm×200 mm），置于50℃、60℃和70℃的熱水浴中進(jìn)行加熱脅迫處理，處理時間各為15 min，按照體積比為1.5%—2%的各溫度加熱脅迫處理后的ATCC43889菌種分別接種于裝有100 mL TSB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，36℃、140 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h至穩(wěn)定期，再分別取10 mL培養(yǎng)液加入無菌的中號試管（20 mm×200 mm），置于50℃、60℃和70℃的熱水浴中進(jìn)行加熱脅迫處理，處理時間各為15 min；以此類推，重復(fù)以上恒溫振蕩培養(yǎng)與加熱脅迫處理10次，得到分別經(jīng)50℃、60℃和70℃反復(fù)熱脅迫處理10次并轉(zhuǎn)接培養(yǎng)10次的3種抗熱性的ATCC43889菌株。ATCC43889的穩(wěn)定期通過平板菌落計數(shù)方法結(jié)合比濁法測得的生長曲線來測定[17]。

1.3.2 大腸桿菌ATCC43889個體形態(tài)的觀察 參照梁靜南等[18]與胡春輝等[19]的方法，并做適當(dāng)修改。具體方法如下，將1.1中活化的大腸桿菌ATCC43889原始對照菌株與1.3.1中獲得的3種抗熱性菌株按照體積比為1%分別接種于裝有100 mL TSB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，36℃、140 r/min搖床振蕩培養(yǎng)至穩(wěn)定期，離心（4℃，5 000×g，15 min），棄上清液，再以0.85%無菌氯化鈉生理鹽水洗滌1次；加入2.5%戊二醛，用微型漩渦混合儀振蕩3—5 min，使其與固定液充分接觸，于室溫下固定3 h后，離心（4℃，5 000×g，15 min），棄上清液，加入緩沖液A，振蕩3—5 min，離心（4℃，5 000×g，15 min），棄上清液，重復(fù)2次；將離心管中的樣品依次分別用30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%的乙醇脫水離心（25℃，5 000×g，15 min），棄上清液；將上述樣品放置于干燥箱（40℃，3 h）里干燥，之后將其固定在載物臺上，置于鍍金儀中真空噴金90 s，最后用掃描電鏡拍照。掃描電鏡使用的電壓為20 kV，在放大倍數(shù)分別為10 000倍、20 000倍和40 000倍的視野下進(jìn)行觀察。

1.3.3 大腸桿菌ATCC43889生物被膜生成能力的測定 參照LAJHAR等[20]的方法，并做適當(dāng)修改。具體方法如下，將1.1中活化的大腸桿菌ATCC43889原始對照菌株與1.3.1中獲得的3種抗熱性菌株按照體積比為1%分別接種于裝有100 mL TSB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，36℃、140 r/min搖床振蕩培養(yǎng)至穩(wěn)定期，備用。于無菌96孔微量酶標(biāo)板中每孔加入TSB 100 μL，每個菌株3個平行，分別接種10 μL上述4種備用菌株，36℃靜置培養(yǎng)36 h后，吸出培養(yǎng)液，各孔加入200 μL緩沖液A清洗板孔2次，各孔加入100 μL甲醇固定15 min，吸出孔中的甲醇，自然風(fēng)干；每孔加入100 μL的1%結(jié)晶紫溶液，染色5 min，吸出孔中的結(jié)晶紫染色液，用清水沖洗掉多余的染料；將酶標(biāo)板倒置于濾紙上吸去殘余的水分，室溫下晾干；每孔加入100 μL 33%冰乙酸溶液，36℃保溫30 min，充分溶解結(jié)晶紫；在590 nm的波長處，以M200酶標(biāo)儀分別測定各培養(yǎng)孔中溶液的OD值；以未接種菌的TSB培養(yǎng)液作為空白對照。本試驗將每種菌株測定的OD590值減去空白對照的OD590值來表示這種菌株的生物被膜生成能力，OD590值每增加0.001作為該種菌株的一個生物被膜生成活力單位（U），生物被膜生成活力越大表示該菌株的生物被膜生成能力越強(qiáng)。

1.3.4 大腸桿菌ATCC43889細(xì)胞膜脂肪酸組成的測定 參照王秋紅等[21]的方法，并作適當(dāng)修改。具體方法如下，將1.1中活化的大腸桿菌ATCC43889原始對照菌株及1.3.1中獲得的3種抗熱性菌株按照體積比為1%分別接種于裝有100 mL TSB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，36℃、140 r/min搖床振蕩培養(yǎng)至穩(wěn)定期，分別用0.85%的氯化鈉生理鹽水適當(dāng)稀釋培養(yǎng)液，采用平板涂布的方法將上述4菌株稀釋培養(yǎng)液在TSA平板上培養(yǎng)24 h，分別用一次性接種環(huán)刮取大約40 mg濕重的菌體置于10 mL離心管中，加入1 mL皂化溶液I，100℃水浴30 min，快速冷卻后加入2 mL甲基化溶液Ⅱ，80℃水浴10 min，快速冷卻，加入1.25 mL萃取溶液Ⅲ，搖震10 min；吸棄下層溶液，在上層溶液中加入3 mL洗滌溶液Ⅳ，搖震10 min。靜置分層，移取上層液體于GC樣品管中待測定。

ATCC43889細(xì)胞膜脂肪酸組成進(jìn)行氣相色譜分析條件為：進(jìn)樣口溫度為270℃；檢測器溫度為280℃；載氣為氮?dú)?，流?.0 mL·min-1，不分流；尾吹氣為氫氣，流速25 mL·min-1；進(jìn)樣量為1 μL；升溫程序：初溫100℃，保持13 min，10℃·min-1升到180℃，保持6 min，再以1℃·min-1升到200℃，保持20 min。ATCC43889細(xì)胞膜脂肪酸組成由37種混合脂肪酸標(biāo)樣和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用同時定性。氣質(zhì)聯(lián)用測定條件為：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用設(shè)備為GCMSQP2010 Ultra，色譜柱為HP-5，其他條件與氣相色譜分析一致。ATCC43889細(xì)胞膜脂肪酸組成利用面積百分比進(jìn)行分析。

1.3.5 大腸桿菌ATCC43889細(xì)胞膜磷脂相變溫度的測定 參照CASADEI等[22]的方法，并作適當(dāng)修改。具體方法如下，將1.1中活化的大腸桿菌ATCC43889原始對照菌株與1.3.1中獲得的3種抗熱性菌株按照體積比為1%分別接種于裝有200 mL TSB培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，36℃、140 r/min搖床振蕩培養(yǎng)至穩(wěn)定期，分別取800 mL的4種菌株培養(yǎng)液，離心（3 000×g，4℃，15 min）、收集菌體，用緩沖液B洗滌兩遍。將菌體沉淀重懸于7 mL緩沖液B中，加入20 mL甲醇和10 mL氯仿；搖床振蕩30 min；再加入10 mL氯仿和10 mL緩沖溶液B，搖床振蕩2 h。靜置分層，收集下層的氯仿層，自然揮發(fā)（10 h），取10 mg樣品置于DSC-8000差示掃描量熱儀中，-20℃預(yù)冷30 min，采用10℃·min-1的溫度梯度升溫，在-10—60℃范圍內(nèi)測定ATCC43889細(xì)胞膜磷脂的相變溫度，以空白作為對照。

1.3.6 大腸桿菌ATCC43889菌體外膜蛋白的測定ATCC43889菌體外膜蛋白的提取：ATCC43889菌體外膜蛋白的提取參照J(rèn)UNEJA等[23]的方法，并作適當(dāng)修改。具體方法如下，將1.1中活化的大腸桿菌ATCC43889原始對照菌株與3種抗熱性菌株按照體積比為1%分別接種于裝有200 mL TSB培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，36℃、140 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h，離心（4℃，5 000×g，10 min）、收集菌體，用緩沖液C洗滌2次，重懸于緩沖液C中；用超聲波破碎菌體，處理15 min（15 s 1次，間隔10 s，300 W），離心（4℃，5 000×g，10 min），取上清液，離心（4℃，15 000×g，20 min）；用適量的2%TritionX-100溶解沉淀20—30 min，離心（4℃，15 000×g，20 min），用100 μL蒸餾水溶解沉淀，-20℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

ATCC43889菌體外膜蛋白的測定：采用BCA蛋白濃度測定試劑盒分別測定上述ATCC43889原始對照菌株與3種抗熱性菌株外膜蛋白濃度，以緩沖液A將此4種ATCC43889菌株外膜蛋白溶液稀釋至5 μg·μL-1，每種菌株取50 μL外膜蛋白溶液與50 μL的蛋白上樣緩沖液混合，沸水浴8 min后，對其進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R250染色2 h，待脫色完全電泳條帶清晰后，用全自動凝膠成像系統(tǒng)掃描，并采用Image Lab 4.0.1軟件進(jìn)行圖像分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)處理通過SPSS（version 22.0，SPSS Inc.）軟件，數(shù)據(jù)間的多重比較采用Duncan新復(fù)極差法（SSR），數(shù)據(jù)結(jié)果以±SD來表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 熱脅迫對大腸桿菌ATCC43889個體形態(tài)的影響

由圖1可知，與原始對照菌株ATCC43889相比，經(jīng)過加熱脅迫并轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的菌株在掃描電子顯微鏡下形態(tài)變化明顯，原始對照菌株ATCC43889的個體形態(tài)呈典型的短桿狀或球狀，外形飽滿，表面光滑，大小均勻，比較一致（A1、B1、C1）；經(jīng)50℃熱脅迫后，部分菌株由球狀體變?yōu)殚L桿狀（A2、B2、C2）；經(jīng)60℃熱脅迫后的菌株個體形態(tài)較50℃熱脅迫處理的菌株細(xì)長（A3），其表面粗糙（B3）、凹凸、不平整（C3）；經(jīng)70℃熱脅迫處理后大部分菌株變成了更細(xì)長的桿狀（A4），大量的菌株聚集在一起（B4），在較大的放大倍數(shù)下，菌體表面呈凸凹不平的無規(guī)則形態(tài)（C4）。上述研究結(jié)果表明，ATCC43889加熱脅迫株的個體形態(tài)與原始對照菌株相比差異顯著，這可能是ATCC43889在熱脅迫環(huán)境下生存的一種自我保護(hù)方式。

2.2 熱脅迫對大腸桿菌ATCC43889生物被膜生成能力的影響

細(xì)菌生物被膜是指當(dāng)細(xì)菌粘附于接觸表面時，其分泌的多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)將其自身包裹、圍繞其中形成了大量的細(xì)菌聚集膜樣物[24]。由圖2可知，隨著脅迫溫度的提高，熱脅迫轉(zhuǎn)接菌株的生物被膜生成活力增大，說明其生物被膜生成能力增強(qiáng)，與原始對照菌株相比，差異顯著（P＜0.05）；而60℃和70℃熱脅迫轉(zhuǎn)接株的生物被膜生成能力差異不顯著（P＞0.05），說明ATCC43889在不利的熱脅迫環(huán)境中可能是通過生成大量的生物被膜來增強(qiáng)其生存能力。有研究者認(rèn)為[25]，幾乎所有的細(xì)菌都可形成生物被膜，其生成是細(xì)菌為適應(yīng)環(huán)境變化及維持生命所發(fā)生的變化，生物被膜中的菌體被厚厚的多糖等包裹，在一定程度上增強(qiáng)了細(xì)菌對外界環(huán)境的抵抗力，是其進(jìn)行自我保護(hù)的一種生存方式。

2.3 熱脅迫對大腸桿菌ATCC43889細(xì)胞膜脂肪酸組成的影響

為了探明50℃、60℃、70℃的溫度脅迫處理對ATCC43889細(xì)胞膜脂肪酸組成的影響，本研究以細(xì)胞膜脂肪酸中飽和脂肪酸（SFA）、不飽和脂肪酸（USFA）以及飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比值（S/U）來作為評價指標(biāo)。ATCC43889原始對照菌株及其分別經(jīng)50℃、60℃、70℃各10次熱脅迫處理并轉(zhuǎn)接10次培養(yǎng)菌株的細(xì)胞膜中脂肪酸組成的相對含量見表1，由表1可知，ATCC43889原始對照菌株樣品中共檢測出14種脂肪酸，分別為C12:0、C13:0、C14:1、C16:0、C16:1、C17:0、C17:1、C18:1n9t、C18:1n9c、C18:2n6t、C18:3n3、C20:0、C21:0和C24:0。與原始對照菌株相比，分別經(jīng)50℃、60℃、70℃熱脅迫處理并轉(zhuǎn)接10次培養(yǎng)的菌株，缺失了3種脂肪酸，分別為C18:1n9c、C18:3n3和C21:0，表明ATCC43889在遭遇到50℃、60℃、70℃熱脅迫條件時，此3種脂肪酸在細(xì)胞膜中不表達(dá)。同時發(fā)現(xiàn)，隨著熱脅迫溫度的升高，C13:0、C16:0和C17:0等飽和脂肪酸的含量在增加，而C14:1、C16:1、C17:1、C18:1n9t和C18:2n6t等不飽和脂肪酸的相對含量呈下降趨勢。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著脅迫溫度的提高，ATCC43889細(xì)胞膜中飽和脂肪酸的總含量上升，不飽和脂肪酸的總含量下降，飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比值升高。S/U越高，表明菌體細(xì)胞膜流動性越弱，50℃、60℃、70℃熱脅迫菌株細(xì)胞膜流動性的降低有利于保證其在高溫環(huán)境下正常的流動性。ATCC43889抗熱性菌株細(xì)胞膜的流動性變化是為了更好地適應(yīng)外界脅迫環(huán)境。

圖1 ATCC43889原始對照菌株及其熱脅迫株在掃描電鏡下的個體形態(tài)Fig.1 Individual morphology of ATCC43889 original control strain and heat-stressed strains under scanning electron microscope

2.4 熱脅迫對大腸桿菌ATCC43889細(xì)胞膜磷脂相變溫度的影響

差示掃描量熱法可用來研究細(xì)菌細(xì)胞膜磷脂的相變，測定細(xì)菌細(xì)胞膜磷脂物理狀態(tài)發(fā)生變化時吸收或釋放的能量。由圖3可知，在每一個熱能圖中均出現(xiàn)了一個峰，該峰值表示ATCC43889細(xì)胞膜磷脂的相變溫度，也即磷脂的熔點(diǎn)（Tm）；ATCC43889抗熱性菌株的熱脅迫溫度越高，其磷脂的熔點(diǎn)越高。在一定范圍內(nèi)，細(xì)胞膜磷脂的熔點(diǎn)越低，膜的流動性越強(qiáng)；細(xì)胞膜磷脂的熔點(diǎn)越高，膜的流動性越弱。與對照組菌株相比，ATCC43889抗熱性菌株細(xì)胞膜流動性的降低有利于其抵抗不利于生存的高溫環(huán)境。

圖2 ATCC43889原始及其對照菌株分別經(jīng)不同溫度熱脅迫處理并轉(zhuǎn)接培養(yǎng)其生物被膜生成能力Fig.2 Biofilm-forming ability of ATCC43889 original control strain and the strains which were treated with different temperatures,transfers and incubation, respectively

表1 ATCC43889原始對照菌株及其分別經(jīng)不同溫度熱脅迫處理并轉(zhuǎn)接培養(yǎng)菌株的細(xì)胞膜脂肪酸相對含量Table 1 Membrane fatty acid composition of ATCC43889 original control strain and the strains which were treated with different temperatures, transfers and incubation, respectively

圖3 ATCC43889原始對照菌株及其分別經(jīng)不同溫度熱脅迫處理并轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的菌株細(xì)胞膜脂類提取物的差示掃描量熱圖譜Fig.3 DSC graph for lipids extracted from the whole cells of ATCC43889 original control strain and the strains which were treated with different temperatures, transfers and incubation, respectively

2.5 熱脅迫對大腸桿菌ATCC43889外膜蛋白表達(dá)的影響

外膜蛋白是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外壁層的主要結(jié)構(gòu)成分，對維持細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，細(xì)胞物質(zhì)的交換及細(xì)菌的致病性均起到非常重要的作用[26-27]。本研究所提取的ATCC43889原始對照菌株及其經(jīng)50℃、60℃、70℃各10次熱脅迫處理并轉(zhuǎn)接10次培養(yǎng)后獲得的3種抗熱性菌株的外膜蛋白，經(jīng)過SDS-PAGE電泳檢測后所得圖譜見圖4。可知，4種ATCC43889菌株外膜蛋白的分子質(zhì)量主要分布在35—180 kD，但它們在構(gòu)成和分布上存在著較大差異。與原始對照菌株相比，分別經(jīng)50℃、60℃、70℃各10次熱脅迫處理并轉(zhuǎn)接10次培養(yǎng)的3種菌株外膜蛋白表達(dá)有明顯的差異。隨著脅迫溫度的升高，分子質(zhì)量在63 kD和75 kD附近的外膜蛋白條帶顏色逐漸變深，說明這兩種分子量附近的外膜蛋白表達(dá)量明顯提高；分別經(jīng)60℃、70℃各10次熱脅迫處理并轉(zhuǎn)接10次培養(yǎng)的2種抗熱性菌株，在48—75 kD增加了特異條帶，說明ATCC43889在這種高溫脅迫下產(chǎn)生了某些抗熱性蛋白，這些蛋白可能是熱脅迫下與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的熱激蛋白。上述研究結(jié)果表明，經(jīng)50℃、60℃和70℃熱脅迫，可誘導(dǎo)ATCC43889一些外膜蛋白表達(dá)量的增加和產(chǎn)生熱激蛋白。由此推測，由于這些蛋白表達(dá)的變化，可及時修復(fù)高溫對其造成的分子損傷，導(dǎo)致ATCC43889熱脅迫菌株中蛋白質(zhì)合成、能量代謝、DNA復(fù)制能夠正常進(jìn)行。最終使ATCC43889抗熱性菌株能夠在50℃、60℃、70℃高溫環(huán)境下生存下來；ATCC43889在50℃、60℃、70℃熱脅迫作用下，菌體能夠啟動某些相關(guān)基因，以此來表達(dá)相關(guān)蛋白而達(dá)到抗熱的目的。

圖4 ATCC43889原始對照菌株及其分別經(jīng)不同溫度熱脅迫并轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的3種菌株外膜蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE of outer membrane proteins of ATCC43889 original control strain and the strains which were treated with different temperatures, transfers and incubation,respectively

3 討論

3.1 大腸桿菌ATCC43889個體形態(tài)變化與其抗熱性的關(guān)系

劉艷霞等[28]采用不同濃度的維生素B6和維生素E煙酸酯藥敏紙片聯(lián)合影響雙歧桿菌生長，通過革蘭氏染色和原子力顯微鏡掃描觀察其形態(tài)的變化。研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度維生素B6和維生素E煙酸酯藥敏紙片聯(lián)合脅迫可誘導(dǎo)雙歧桿菌個體形態(tài)從短桿狀變?yōu)榻z狀體。舒文婷[29]也發(fā)現(xiàn)，與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比，經(jīng)亞胺培南藥物作用的銅綠假單胞菌菌株個體形態(tài)變長，主要原因是亞胺培南藥物作用使其耐藥基因表達(dá)導(dǎo)致菌體變長。本研究發(fā)現(xiàn)，與原始對照菌株相比，分別經(jīng)50℃、60℃和70℃各10次熱脅迫處理并轉(zhuǎn)接10次培養(yǎng)得到的3種抗熱性ATCC43889菌株的個體形態(tài)變長，表明高溫作用對ATCC43889的個體形態(tài)產(chǎn)生較大影響，形態(tài)的變長可能使其對熱產(chǎn)生抗性。這種菌體形態(tài)的變化常常伴隨著正常細(xì)菌的自溶，它們可能是不利環(huán)境的產(chǎn)物，也可能是對這種不利環(huán)境有抵抗力的個體，這可能是增加菌體存活穩(wěn)定性的途徑之一[30]。

3.2 大腸桿菌ATCC43889生物被膜生成能力與其抗熱性的關(guān)系

生物被膜的形成是細(xì)菌為了適應(yīng)生存環(huán)境而采取的一種策略。微生物易粘附于含有機(jī)物質(zhì)的食品加工設(shè)備表面，形成生物被膜，而生物被膜中的細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理、生化特性對外界不利環(huán)境（pH、溫度和滲透壓等）的敏感性皆比普通細(xì)菌強(qiáng)[31]。高璐等[32]研究了不同脅迫條件對副溶血性弧菌生物學(xué)特性的影響，該菌經(jīng)低滲透壓、低pH和高溫條件下適應(yīng)后傳代的菌株，其生物被膜生成能力與原始對照菌株相比均增強(qiáng)。本研究也發(fā)現(xiàn)，與原始對照菌株相比，3種抗熱性ATCC43889菌株生物被膜生成能力明顯增強(qiáng)。

3.3 大腸桿菌ATCC43889細(xì)胞膜脂肪酸組成與其抗熱性的關(guān)系

細(xì)菌細(xì)胞膜是磷脂雙分子層，流動的脂質(zhì)雙分子層是生物膜結(jié)構(gòu)的基本特征，適宜的流動性是保證細(xì)菌處于正常生理狀態(tài)的重要條件。本研究發(fā)現(xiàn)，3種抗熱性ATCC43889菌株細(xì)胞膜脂肪酸組成發(fā)生了變化，隨著熱脅迫溫度的升高，細(xì)胞膜中飽和脂肪酸含量升高，不飽和脂肪酸含量下降，這與有關(guān)文獻(xiàn)的報道一致[33]。此外，飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比率可以反映細(xì)胞膜的流動性。本研究中，脅迫溫度升高，飽和脂肪酸含量升高，不飽和脂肪酸含量降低，飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比率增加，細(xì)胞膜流動性降低，有利于其在高溫下保持正常的流動性。LI等[34]研究了冷、鹽和堿等應(yīng)激處理對保加利亞乳桿菌細(xì)胞膜組成和凍干存活率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激處理使保加利亞乳桿菌對凍干耐受性增強(qiáng)，細(xì)胞膜中生成新物質(zhì)環(huán)丙烷脂肪酸（CFA）。研究證明，環(huán)丙烷脂肪酸的生成可提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，限制?；湹囊苿樱淖兗?xì)胞膜的流動性[35]。在本研究中，3種抗熱性ATCC43889菌株中是否也合成類似CFA的物質(zhì)來抵抗不利高溫的環(huán)境？相關(guān)工作有待進(jìn)一步研究。

3.4 大腸桿菌ATCC43889細(xì)胞膜磷脂相變溫度與其抗熱性的關(guān)系

磷脂分子的相變是指在某個溫度點(diǎn)時，細(xì)胞膜磷脂分子層中脂肪酰鏈從全反式的高度有序剛性、致密的排列狀態(tài)突然向高度無序的柔軟、疏松排列狀態(tài)的轉(zhuǎn)變過程。這種轉(zhuǎn)變過程不是漸進(jìn)的，而是在某個溫度時發(fā)生突變，該臨界溫度Tm稱之為相變溫度[36]。細(xì)胞膜磷脂分子相變溫度Tm受脂肪酰鏈飽和程度的影響，飽和度越高，Tm越高。有研究表明，微生物為了適應(yīng)環(huán)境溫度的變化，通過改變脂肪酸鏈的不飽和度、鏈的長短以及支鏈與直鏈比來保持正常細(xì)胞膜的流動性，使其與外界進(jìn)行正常的物質(zhì)與能量交換[37]，這與本研究的結(jié)論基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)，3種抗熱性菌株細(xì)胞膜中飽和脂肪酸含量升高，不飽和脂肪酸含量下降，Tm升高，膜流動性降低；脅迫溫度越高，Tm也越高，膜流動性越弱，有利于其在高溫下保持正常的流動性。細(xì)胞膜由磷脂雙分子層組成，除了起到結(jié)構(gòu)和屏障作用外，還與細(xì)胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、交流和能量產(chǎn)生有關(guān)。細(xì)胞膜在細(xì)菌的脅迫抵抗中起重要作用，它能夠隨環(huán)境條件的變化而發(fā)生改變，通過控制流動性來維持菌體的正常生理活動，與其生命活動相協(xié)調(diào)，這種適應(yīng)性變化可以對細(xì)菌的生存起到保護(hù)作用。

3.5 大腸桿菌ATCC43889熱激蛋白與其抗熱性的關(guān)系

熱激蛋白能夠防止蛋白質(zhì)變性或者幫助己變性的蛋白重新折疊恢復(fù)正常的構(gòu)象，避免熱脅迫引起的傷害，對高溫脅迫條件下細(xì)菌的生存起著至關(guān)重要的作用。熱激蛋白一旦形成，迅速應(yīng)對外界脅迫環(huán)境表現(xiàn)出的抗熱性，是生物對熱脅迫適應(yīng)的必需組成成分。LEYER等[38]研究酸適應(yīng)脅迫誘導(dǎo)沙門氏菌對熱、鹽、表面活性劑等的交叉保護(hù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酸適應(yīng)可誘導(dǎo)沙門氏菌合成特殊的外膜蛋白，從而增強(qiáng)了其對外界不利環(huán)境的抵抗力。本研究發(fā)現(xiàn)，3種抗熱性ATCC43889菌株某些外膜蛋白表達(dá)量和組成也發(fā)生變化，這些變化可能是高溫脅迫下ATCC43889合成的與熱激反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)。至于這些外膜蛋白到底是通過改變哪些代謝路徑來幫助菌體抵抗不利的環(huán)境，還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

ATCC43889分別經(jīng)50℃、60℃和70℃各10次熱脅迫處理并轉(zhuǎn)接10次培養(yǎng)后，產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng)，其個體形態(tài)、生物被膜生成能力、膜脂肪酸組成、膜流動性和外膜蛋白表達(dá)均發(fā)生了變化。隨著熱脅迫溫度的升高，其個體形態(tài)變長，生物被膜生成能力增強(qiáng)，飽和脂肪酸含量升高，不飽和脂肪酸含量下降，細(xì)胞膜流動性減弱，一些外膜蛋白表達(dá)量提高、表達(dá)種類增加，菌株耐熱性增強(qiáng)。綜上，ATCC43889在遭遇熱脅迫環(huán)境時，會通過改變自身個體形態(tài)、增強(qiáng)生物被膜生成能力、調(diào)整膜脂肪酸組成和膜流動性及外膜蛋白表達(dá)來適應(yīng)不利環(huán)境，提高其生存能力。