張清安，陳博宇

（陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，西安 710119）

葡萄酒是一種成分復(fù)雜的發(fā)酵飲料，葡萄酒所含的化合物很大程度上決定了其外觀、香氣、味道和口感[1]。其中含硫化合物是葡萄酒中對(duì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、風(fēng)味有重要影響的化合物，如還原型谷胱甘肽（GSH）具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力和解毒的作用，在生物還原、保護(hù)紅細(xì)胞、抗氧化應(yīng)激、抗異生素和內(nèi)源性毒性代謝物解毒、酶活性及硫和氮代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用，對(duì)代謝和炎癥疾病如多發(fā)性硬化、代謝綜合征和糖尿病也有重要的功效[2-4]；揮發(fā)性含硫化合物如4-巰基-4-甲基戊-2-酮（4MMP）、3-巰基-1-己醇（3MH）和3-巰基己基乙酸酯（3MHA）是葡萄酒百香果香氣和葡萄柚香氣的重要來(lái)源[5-8]，而二氧化硫（SO2）、硫化氫（H2S）和低級(jí)硫醇如甲硫醇（MeSH）、乙硫醇（EtSH）則使葡萄酒產(chǎn)生不愉快的氣味。葡萄酒中谷胱甘肽、硫醇、硫化氫和二氧化硫的含量、來(lái)源及貯藏期間的變化情況各不相同且極其復(fù)雜，目前仍沒(méi)有統(tǒng)一的結(jié)論。因此，本文就近年來(lái)國(guó)內(nèi)外針對(duì)葡萄酒中這4類(lèi)含硫化合物存在形態(tài)、來(lái)源、檢測(cè)技術(shù)、貯藏期間的變化及控制方法5個(gè)方面的研究進(jìn)展進(jìn)行梳理，以期為優(yōu)化葡萄酒生產(chǎn)工藝、提升葡萄酒品質(zhì)提供參考。

1 葡萄酒中4類(lèi)含硫化合物的概況

在4類(lèi)含硫化合物中，谷胱甘肽是非揮發(fā)性含硫化合物，其結(jié)構(gòu)中含有游離巰基，具有氧化還原和親核性質(zhì)；揮發(fā)性含硫化合物根據(jù)結(jié)構(gòu)可分為硫醇、硫化氫和二氧化硫，三者具有各自的特征氣味且感官閾值極低，其含量對(duì)葡萄酒的風(fēng)味影響顯著。

1.1 谷胱甘肽

谷胱甘肽（glutathione）是一種由L-谷氨酸（LGlu）、L-半胱氨酸（L-Cys）和甘氨酸（Gly）經(jīng)肽鍵縮合而成的三肽物質(zhì)，廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)[9]。谷胱甘肽主要以還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）形式存在（圖1），也有少部分會(huì)與輔酶A或半胱氨酸等形成混合二硫化物，一般情況下超過(guò)90%的谷胱甘肽以還原型存在[10]。1989年，CHEYNIER等[11]首次檢測(cè)出葡萄果實(shí)中GSH的含量，由于品種、產(chǎn)區(qū)、收獲期等因素，GSH的含量有所差異，在17—114 mg·kg-1，而未發(fā)酵葡萄汁中GSH的含量在1—20 mg·L-1。根據(jù)FRACASSETTI等[12]和KRITZINGER等[13]對(duì)白葡萄酒的測(cè)定結(jié)果，其中GSH的含量不高于70 mg·L-1。JANES等[14]檢測(cè)了新釀長(zhǎng)相思白葡萄酒中的GSH含量，其結(jié)果在1.3—34.7 mg·L-1，平均值為12.5 mg·L-1。

1.2 硫醇

圖1 還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of the GSH and GSSG

硫醇是一類(lèi)含有巰基官能團(tuán)的化合物，揮發(fā)性硫醇感官閾值極低，對(duì)葡萄酒風(fēng)味有重要影響[8]。葡萄酒中的硫醇主要是低級(jí)硫醇，如甲硫醇（MeSH）、乙硫醇（EtSH）和多官能團(tuán)硫醇如4-巰基-4-甲基戊-2-酮（4MMP）、3-巰基-1-己醇（3MH）和3-巰基己基乙酸酯（3MHA）等。根據(jù)SIEBERT等[15]對(duì)澳大利亞產(chǎn)區(qū)的紅、白葡萄酒中低級(jí)硫醇含量測(cè)定的結(jié)果，MeSH和EtSH的含量分別低于8 μg·L-1和1 μg·L-1。TOMINAGA等[7]于1998年首次檢測(cè)出長(zhǎng)相思葡萄酒中3種多官能團(tuán)硫醇的含量，其結(jié)果分別為19.4—26.8 ng·L-1（4MMP），943—1 038 ng·L-1（3MH），30.9—36.8 ng·L-1（3MHA）。在此研究基礎(chǔ)上，F(xiàn)ERREIRA等[16]、SCHNEIDER等[17]和RODRíGUEZ-BENCOMO等[18]改進(jìn)了對(duì)4MMP、3MH和3MHA的檢測(cè)方法，并提高了檢測(cè)精度，最終測(cè)得4MMP、3MH和3MHA的含量分別為≤19 ng·L-1、500—3 200 ng·L-1、9—18 ng·L-1。但是葡萄酒中的一些硫醇如MeSH除了以游離態(tài)存在外，還會(huì)與金屬離子如Cu2+、Zn2+可逆結(jié)合形成無(wú)氣味化合物。根據(jù)FRANCO-LUESMA等[19]報(bào)道，紅葡萄酒中平均60%以上的MeSH以結(jié)合態(tài)形式存在，白葡萄酒中結(jié)合態(tài)形式平均占30%以上。

1.3 硫化氫

硫化氫（H2S）是揮發(fā)性極強(qiáng)的含硫化合物，在5—10 μg·L-1低濃度時(shí)就能在葡萄酒中呈現(xiàn)出臭雞蛋或腐敗物的“還原性”臭味，如果不及時(shí)去除，H2S可進(jìn)一步與醇類(lèi)物質(zhì)結(jié)合形成硫醇，其中低級(jí)硫醇會(huì)產(chǎn)生不愉快風(fēng)味且不易去除，所以釀酒時(shí)要及時(shí)發(fā)現(xiàn)、控制并盡可能降低H2S含量，以保證葡萄酒優(yōu)良的感官質(zhì)量[20]。葡萄酒中H2S的含量與含硫化合物、酵母菌株種類(lèi)、發(fā)酵條件和葡萄汁的營(yíng)養(yǎng)成分有關(guān)[21]。LóPEZ等[22]測(cè)定了西班牙產(chǎn)區(qū)21種白葡萄酒和13種紅葡萄酒中H2S的總含量，其中紅葡萄酒中H2S的總含量在13 μg·L-1以下，平均含量為2.8 μg·L-1；白葡萄酒中H2S的總含量不高于30 μg·L-1，平均含量為7.6 μg·L-1。H2S在葡萄酒中易與金屬離子結(jié)合形成無(wú)氣味化合物，根據(jù)FRANCO-LUESMA等[19]的研究結(jié)果，西班牙產(chǎn)區(qū)葡萄酒中大部分H2S以結(jié)合態(tài)形式存在，平均只有7%的H2S以游離態(tài)存在；其中紅葡萄酒中游離態(tài)H2S的含量低于3.44 μg·L-1，占總含量的6%左右；白葡萄酒中游離態(tài)的H2S含量低于3.94 μg·L-1，約占總含量的7%。

1.4 二氧化硫

二氧化硫（SO2）是一種常見(jiàn)的食品添加劑，帶有燃燒火柴的味道，感官閾值在20—25 μg·L-1，主要有抑菌、抗氧化、改善果酒風(fēng)味和增酸等作用[23]。在葡萄酒釀造過(guò)程中，添加SO2的目的在于抑制細(xì)菌繁殖、防止氧化和變質(zhì)。在葡萄汁剛榨出時(shí)，需添加SO2防止腐敗；在發(fā)酵時(shí)，為了防止釀酒酵母把糖分發(fā)酵完，也需要添加SO2適時(shí)終止釀酒酵母的代謝發(fā)酵，保留一定的含糖量[24]。SO2在葡萄酒中常以SO2氣體或亞硫酸氫根的游離態(tài)存在，或與含羰基化合物成鍵以結(jié)合態(tài)形式存在[25]。OLIVEIRA等[25]對(duì)葡萄酒中游離態(tài)和結(jié)合態(tài)SO2含量進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果分別為2.1—30.9 mg·L-1和64.8—166.5 mg·L-1。適當(dāng)添加SO2可以保護(hù)葡萄酒中的芳香物質(zhì)，并促進(jìn)陳釀香氣的形成，減弱霉味等不良風(fēng)味；但如果用量過(guò)大，或發(fā)酵結(jié)束溫度仍較高時(shí)使用SO2，會(huì)形成一些不良風(fēng)味，如硫味、臭雞蛋味和蒜味等[26]。我國(guó)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)（GB 2760—2014）規(guī)定，葡萄酒中SO2的使用量不得高于250 mg·L-1，甜型葡萄酒系列產(chǎn)品中SO2使用量不得高于400 mg·L-1。國(guó)際葡萄與葡萄酒組織（OIV）規(guī)定，還原物質(zhì)少于4 g·L-1的紅葡萄酒中SO2總含量不得高于150 mg·L-1，還原物質(zhì)少于4 g·L-1的白葡萄酒和桃紅葡萄酒中SO2總含量不得高于200 mg·L-1，還原物質(zhì)高于4 g·L-1的紅葡萄酒、白葡萄酒和桃紅葡萄酒中SO2總含量不得高于300 mg·L-1，在一些甜白葡萄酒中SO2總含量不得高于400 mg·L-1。

由上可知，葡萄酒中4類(lèi)含硫化合物的含量及存在形態(tài)對(duì)葡萄酒的風(fēng)味有重要影響，其中3類(lèi)揮發(fā)性含硫化合物的感官閾值極低，且其含量高于感官閾值，對(duì)葡萄酒風(fēng)味影響顯著，4類(lèi)含硫化合物的具體特性及比較見(jiàn)表1。

表1 葡萄酒中4類(lèi)含硫化合物特性比較Table 1 Comparison of characteristics of four sulfur compounds in wine

2 葡萄酒中4類(lèi)含硫化合物的來(lái)源

這4類(lèi)含硫化合物的來(lái)源可分為內(nèi)源性途徑和外源性途徑，內(nèi)源性途徑主要是發(fā)酵期間微生物對(duì)原料的代謝降解過(guò)程，外源性途徑包括原料自身含有的含硫化合物及葡萄酒生產(chǎn)過(guò)程中添加的含硫化合物等。其中，微生物的代謝過(guò)程是近年的研究熱點(diǎn)。

2.1 谷胱甘肽的來(lái)源

一般來(lái)說(shuō)，未發(fā)酵葡萄汁中的GSH是葡萄酒中GSH的主要來(lái)源[29]。在葡萄葉的細(xì)胞溶質(zhì)和葉綠體中，L-谷氨酸和L-半胱氨酸在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的作用下形成γ-谷氨酰半胱氨酸，后者進(jìn)一步與甘氨酸在GSH合成酶作用下形成GSH，隨后GSH從葉子中導(dǎo)出，通過(guò)韌皮部分配到果實(shí)、種子和根中[30-31]。此外，釀酒酵母中也含有少量的GSH，占釀酒酵母干重的1%左右（10 g·kg-1）[32]。除外源性途徑外，發(fā)酵期間酵母利用葡萄糖等作為碳源，以谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸為前體物質(zhì)代謝產(chǎn)生GSH[33]。此外，葡萄的采收方法、果汁壓榨條件、發(fā)酵條件如溫度、pH等也會(huì)影響葡萄酒中GSH的含量，其中氧氣和其他活潑氧化物（如醌類(lèi)物質(zhì)）影響最顯著[34]。

2.2 硫醇的來(lái)源

葡萄酒中的硫醇化合物大多來(lái)源于含硫氨基酸的發(fā)酵、GSH降解以及以H2S為底物的化學(xué)反應(yīng)和對(duì)應(yīng)前體物質(zhì)的發(fā)酵等[35-36]，如MeSH是蛋氨酸、半胱氨酸發(fā)酵的產(chǎn)物，EtSH是H2S與乙醛反應(yīng)的產(chǎn)物等。WEIMER等[37]認(rèn)為酵母可通過(guò)兩種代謝途徑產(chǎn)生MeSH，一種是蛋氨酸直接分解產(chǎn)生MeSH、氨氣和α-酮丁酸；另一種是蛋氨酸先形成中間產(chǎn)物α-酮-γ-甲硫基丁酸，再生成MeSH等代謝產(chǎn)物。

4MMP、3MH常來(lái)源于葡萄和葡萄汁中無(wú)氣味前體物質(zhì)的發(fā)酵；而3MHA的生物轉(zhuǎn)化途徑較為特殊，它來(lái)源于3MH的進(jìn)一步酯化[38]。根據(jù)DES GACHONS等[39]和TOMINAGA等[40]報(bào)道，其中4MMP和3MH分別來(lái)源于半胱氨酸化前體物質(zhì)如S-3-（4-巰基-4-甲基戊-2-酮）-半胱氨酸（Cys4MMP）、S-3-（己烷-1-醇）-半胱氨酸（Cys3MH）和S-3-（4-巰基-4-甲基戊-2-酮）-谷胱甘肽（G4MMP）、谷胱甘肽化前體如S-3-（己烷-1-醇）-谷胱甘肽（G3MH）的發(fā)酵，其中Cys3MH作為前體物質(zhì)形成3MH的產(chǎn)率明顯高于G3MH，而當(dāng)G3MH作為前體物質(zhì)形成3MH時(shí)，3MHA產(chǎn)率更高[41]。此外，HARSCH等[42]發(fā)現(xiàn)（E）-2-己烯-1-醇是一種新的3MH前體物質(zhì)。根據(jù)HOWELL等[43]報(bào)道，4MMP的產(chǎn)生可受到負(fù)責(zé)編碼裂解Cys4MMP碳硫裂合酶的BNA3、CYS3、GLO1和IRC7影響。關(guān)于影響3MH產(chǎn)生的基因仍無(wú)定論，但涉及的基因不止IRC7[44]。3MHA由3MH與乙酸酯化形成，根據(jù)SWIEGERS等[38]報(bào)道，這種反應(yīng)受成酯醇乙酰轉(zhuǎn)移酶（ester forming alcohol acetyltransferase）的控制，后者由ATF1編碼，其中VIN13酵母菌株中ATF1的過(guò)表達(dá)會(huì)引起3MHA含量顯著增加，而編碼酯降解酶的IAH1過(guò)表達(dá)會(huì)引起3MHA含量降低。根據(jù)MURAT等[45]報(bào)道，葡萄酒中揮發(fā)性硫醇含量與半胱氨酸結(jié)合物等前體物質(zhì)的含量呈正相關(guān)性，而后者的含量與葡萄品種及其種植海拔、土壤等情況有關(guān)[46]。

2.3 硫化氫的來(lái)源

H2S是釀酒酵母代謝過(guò)程中硫酸鹽還原序列（SRS）途徑的產(chǎn)物，也是含硫氨基酸生物合成的中間產(chǎn)物，主要由含硫氨基酸、硫酸鹽和亞硫酸鹽等經(jīng)酵母代謝分解產(chǎn)生，但是具體的前體物質(zhì)可能與發(fā)酵條件有關(guān)[47]。根據(jù)報(bào)道，葡萄汁合成培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)生的H2S主要來(lái)源于亞硫酸鹽[48-51]。而根據(jù)KUNKEE等[52]報(bào)道，合成果汁培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)生的H2S主要來(lái)源于硫酸鹽。也有學(xué)者認(rèn)為，葡萄酒中GSH是潛在的H2S前體物質(zhì)。HALLINAN等[53]報(bào)道，在用硫酸鹽培養(yǎng)的氮饑餓酵母發(fā)酵產(chǎn)生的H2S中，40%來(lái)源于GSH。在缺乏氮源或硫源的條件下，GSH被迅速水解成氨基酸，其中半胱氨酸在半胱氨酸脫硫酶作用下進(jìn)一步形成H2S，這一步主要受TUM1的影響[54]。

H2S發(fā)酵過(guò)程分兩個(gè)階段，發(fā)酵早期到中期產(chǎn)生的H2S與酵母的生長(zhǎng)情況和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如磷酸二銨（DAP）和泛酸的添加有關(guān)，發(fā)酵后期的影響因素較復(fù)雜，目前仍無(wú)定論[55]。H2S的產(chǎn)量主要與酵母菌株種類(lèi)和基因有關(guān)，不同種類(lèi)釀酒酵母菌株的H2S產(chǎn)率不同[56]。根據(jù)SPIROPOULOS等[57]報(bào)道，負(fù)責(zé)編碼O-乙酰絲氨酸/ O-乙酰高絲氨酸硫氫化酶的MET17過(guò)表達(dá)會(huì)抑制H2S產(chǎn)生。DONALIES等[58]報(bào)道，負(fù)責(zé)編碼腺苷磷酸激酶的MET14和負(fù)責(zé)編碼亞硫酸鹽泵的SSU1過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)H2S產(chǎn)生。

2.4 二氧化硫的來(lái)源

葡萄酒中的SO2大多來(lái)自生產(chǎn)時(shí)的外源添加劑，其應(yīng)用形式主要有偏重亞硫酸鉀、亞硫酸、液體SO2和硫磺片等[24]。SO2應(yīng)用的關(guān)鍵在于各個(gè)工藝環(huán)節(jié)中的用量，其涉及因素有很多，如葡萄酒的成熟度、葡萄酒的類(lèi)型、釀造工藝、設(shè)備狀況以及葡萄酒的內(nèi)在質(zhì)量（氧化程度、微生物感染程度、破敗程度、pH）等[26]。也有少部分SO2來(lái)源于微生物發(fā)酵過(guò)程，在硫酸鹽的代謝途徑中，SO42-被還原成SO32-，部分SO32-會(huì)分解產(chǎn)生SO2，是酵母代謝的中間產(chǎn)物[21]。

由上可知，除原料和添加劑外，這4類(lèi)含硫化合物的來(lái)源主要與發(fā)酵期間釀酒酵母的代謝活動(dòng)有關(guān)。因此，優(yōu)化原料品質(zhì)、改進(jìn)生產(chǎn)工藝、了解其具體代謝途徑[1]（圖2）有助于減少異味產(chǎn)生、提升葡萄酒品質(zhì)。

圖2 4類(lèi)含硫化合物的主要代謝途徑及相關(guān)酶和基因Fig.2 Main metabolic pathway of four sulfur compounds and relevant enzymes and genes

3 葡萄酒中4類(lèi)含硫化合物的檢測(cè)方法

由上述內(nèi)容可知，葡萄酒的風(fēng)味與4類(lèi)含硫化合物的含量及存在形態(tài)有關(guān)，這兩者可能受原料品質(zhì)和生產(chǎn)工藝影響。此外，4類(lèi)含硫化合物檢測(cè)方法的精確度和檢測(cè)限不同也可能引起含量及存在形態(tài)的結(jié)果差異。

3.1 谷胱甘肽的檢測(cè)方法

在谷胱甘肽含量測(cè)定方面，ELLMAN[59]最早提出基于5,5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）與巰基反應(yīng)，利用分光光度法測(cè)定黃色反應(yīng)產(chǎn)物4-硝基苯硫酚化合物（TNB）吸光值（412 nm），通過(guò)換算得到GSH的含量?；诖嗽恚?989年，CHEYNIER等[11]用DTNB標(biāo)記葡萄汁中的GSH，結(jié)合高效液相色譜（HPLC）首次檢測(cè)出葡萄汁中GSH的含量。根據(jù)JANES等[14]報(bào)道，利用鄰苯二甲醛（OPA）作為柱前衍生化試劑，以冰的脫氧甲醇為氧化酶抑制劑，配合高效液相色譜-熒光檢測(cè)（HPLC-FD）測(cè)定葡萄汁和葡萄酒中GSH的含量，排除氧化酶的影響，使GSH保持穩(wěn)定，提高了檢測(cè)靈敏度，檢測(cè)限達(dá)0.06 mg·L-1。根據(jù)MARCHAND等[60]報(bào)道，以2,3-萘二醛（NDA）作為柱前衍生化試劑，配合HPLC-FD測(cè)定葡萄酒中GSH的含量，檢測(cè)限可達(dá)0.03 mg·L-1。這些測(cè)定方法主要原理是基于HPLC分離能力優(yōu)良、靈敏性高、專一性強(qiáng)、線性范圍較寬、穩(wěn)定性較高等特點(diǎn)，能夠同時(shí)測(cè)定GSH和GSSG。NDA是一種GSH原位標(biāo)記探針，NDA-氨基硫醇加合物能夠被納入環(huán)糊精腔，提高熒光比率（fluorescence ratio）。LAVIGNE等[29]報(bào)道，選擇一溴聯(lián)苯（MBB）作為柱前衍生化試劑，配合毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光法（CE-LIF）檢測(cè)葡萄酒中GSH含量時(shí)，檢測(cè)限可達(dá)到0.02 mg·L-1。KRITZINGER等[61]以對(duì)苯醌（pBQ）作為柱前衍生化試劑，配合超高效液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-ESIMS/MS）檢測(cè)葡萄酒中GSH含量時(shí)，檢測(cè)限可達(dá)到0.0002 mg·L-1。

3.2 3類(lèi)揮發(fā)性含硫化合物的檢測(cè)方法

葡萄酒中揮發(fā)性含硫化合物如硫醇和H2S的含量通常很低，需要特殊的樣品處理方法將其分離提取出來(lái)。ARTHUR[62]在1990年首次提出固相微萃取法（SPME），并將此技術(shù)應(yīng)用到揮發(fā)性風(fēng)味化合物的分析研究上。SPME是依據(jù)有機(jī)化合物能吸附在涂于石英細(xì)絲表面的色譜固定相上，且被吸附的分析物在氣相色譜儀（GC）的進(jìn)樣口預(yù)熱可定量解析的原理設(shè)計(jì)的。它摒棄了傳統(tǒng)的溶劑，并將萃取、濃縮、解吸、進(jìn)樣集于一體，具有靈敏度較高、操作簡(jiǎn)單且成本較低等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于各種食品風(fēng)味分析中[63-64]。在此技術(shù)基礎(chǔ)上，LóPEZ等[22]對(duì)葡萄酒中主要揮發(fā)性含硫化合物進(jìn)行了研究，利用頂空固相微萃?。℉P-SPME）配合羧基聚二甲基硅氧烷（CAR-PDMS）纖維頭對(duì)葡萄酒樣品進(jìn)行預(yù)處理，配合氣相色譜-脈沖火焰光度計(jì)檢測(cè)器（GC-PFPD）對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，最終定性并定量分析了6種含硫化合物。但是由于氧氣氧化及基底效應(yīng)等問(wèn)題，此方法精度不高。GüRBüZ等[65]采用固相微萃取靜態(tài)頂空采樣（static-HS-SPME）技術(shù)對(duì)葡萄酒樣品進(jìn)行預(yù)處理，并與GC-pFPD、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）等檢測(cè)方法相結(jié)合，定性測(cè)出24種含硫化合物。

3.2.1 硫醇和硫化氫的檢測(cè)方法 在H2S和一些硫醇含量的測(cè)定上，考慮到它們會(huì)與葡萄酒中Cu2+及其他金屬離子結(jié)合形成非揮發(fā)性化合物，在定量分析時(shí)需分別測(cè)定游離態(tài)和總物質(zhì)含量。FRANCO-LUESMA等[19,66]提出在測(cè)定游離態(tài)揮發(fā)性含硫化合物時(shí)，在無(wú)氧環(huán)境下將葡萄酒樣品和內(nèi)標(biāo)溶液加入標(biāo)準(zhǔn)頂空玻璃管中，通過(guò)HS-SPME預(yù)濃縮并進(jìn)一步分析，最后利用GC-pFPD進(jìn)行測(cè)定。在測(cè)定總揮發(fā)性含硫化合物含量時(shí)，需在相同條件下將葡萄酒樣品和內(nèi)標(biāo)溶液加入到含有NaCl溶液的標(biāo)準(zhǔn)頂空玻璃管中，后續(xù)操作同上。由于葡萄酒中部分硫醇含量極低，因此需要優(yōu)化樣品制備和采用更靈敏的分析方法。針對(duì)痕量硫醇，TOMINAGA等[7]首次提出利用硫醇中硫基能與對(duì)羥基汞基苯甲酸汞（p-HMB）可逆性結(jié)合的特性，將痕量硫醇從葡萄酒的二氯甲烷萃取液中選擇性提取出來(lái)，后續(xù)采用GC-MS檢測(cè)含量；但在對(duì)4MMP進(jìn)行檢測(cè)和分析時(shí)只基于其中一個(gè)片段，且用于從p-HMB復(fù)合物中提取硫醇的陽(yáng)離子樹(shù)脂會(huì)導(dǎo)致3MHA分解為3MH，從而可能會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不精確。同時(shí)，由于硫醇具有較強(qiáng)的還原性，在提取過(guò)程中樣品很容易被氧化而影響試驗(yàn)結(jié)果?；诖嗽?，F(xiàn)ERREIRA等[16]同樣采用p-HMB提取樣品，通過(guò)填充LichrolutEN樹(shù)脂的載體除去干擾化合物，配合GC-MS檢測(cè)含量，提高了對(duì)硫醇的選擇性和檢測(cè)靈敏度。SCHNEIDER等[17]基于類(lèi)似的方法，在液-液萃取技術(shù)（LLE）的基礎(chǔ)上，利用Affigel 501（一種帶有苯基汞凝膠的交聯(lián)瓊脂糖凝膠）捕獲特定的硫醇，并配合氣相色譜-原子發(fā)射光譜（GC-AED）測(cè)定4MMP的含量；氣相色譜與離子阱串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（GC-ITMS-MS）測(cè)定3MH及3MHA的含量，且其檢測(cè)限都低于感官閾值。這是首次使用被標(biāo)記的3MH、3MHA和4MMP作為內(nèi)標(biāo)物，克服了樣品的氧化問(wèn)題。RODRíGUEZ-BENCOMO等[18]在處理葡萄酒樣品時(shí)，將4MMP肟化，并使用對(duì)苯二酚溴（PFBBr）和SPME進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)行原位SPE衍生化，以氘類(lèi)化合物作為內(nèi)標(biāo)物，以降低基底效應(yīng)，配合GC-MS檢測(cè)3種物質(zhì)的含量，分別將檢測(cè)限降低至1.3 ng·L-1（3MH）、0.25 ng·L-1（3MHA）、0.03 ng·L-1（4MMP）。

3.2.2 二氧化硫的檢測(cè)方法 傳統(tǒng)的SO2測(cè)定方法，是基于淀粉作為滴定終點(diǎn)指示劑的碘量滴定法，由于葡萄酒中還存在多酚等還原性物質(zhì)，滴定終點(diǎn)難以觀察，這種檢測(cè)方法精確性不高。為提高精確性，林軍等[67]提出在酸性條件下，用碘標(biāo)準(zhǔn)溶液作為滴定劑，用電位滴定儀控制滴定終點(diǎn)，測(cè)定游離和總SO2的含量。測(cè)定總SO2濃度時(shí)，需先在堿性條件下，將樣品中的結(jié)合態(tài)SO2釋放為游離態(tài)SO2，再進(jìn)行測(cè)定。為進(jìn)一步提高精確度，流量法測(cè)定被提出；其原理主要是采用氣體擴(kuò)散裝置[68]，微蒸餾裝置[69]或滲透蒸發(fā)裝置[70]等分離裝置將釋放的SO2從基質(zhì)中分離出來(lái)，再采用分光光度計(jì)[71]、安培計(jì)[72]、電勢(shì)測(cè)定法[73]或化學(xué)熒光法[74]等檢測(cè)SO2的含量。但是，以上方法大多數(shù)需要樣品預(yù)處理，例如樣品稀釋和水解可能引起誤差?；趤喠蛩猁}與孔雀綠（malachite green）和副品紅（pararosaniline）反應(yīng)能引起顏色變化[75-78]，金曉蕾等[79]建立連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定不同類(lèi)型葡萄酒中總SO2的檢測(cè)方法。將樣品在酸性條件下蒸餾，蒸餾液與甲醛及鹽酸副品紅反應(yīng)生成紅色絡(luò)合物，利用連續(xù)流動(dòng)分析儀（CFA）在 560 nm 波長(zhǎng)處自動(dòng)檢測(cè)得出總SO2含量。OLIVEIRA等[25]采用氣體擴(kuò)散分離和分光光度檢測(cè)技術(shù)，建立了基于多重?fù)Q向概念的流動(dòng)體系測(cè)定酒中游離和總SO2含量的方法。他們將未經(jīng)過(guò)預(yù)處理的酒樣直接注入流動(dòng)系統(tǒng)，直接處理游離SO2或堿性水解釋放結(jié)合態(tài)SO2，讓其先與副品紅反應(yīng)，再與孔雀綠反應(yīng)，期間冰凍樣品，最后用紫外-可見(jiàn)光吸收光譜（UV-vis）檢測(cè)游離和總SO2含量。

由上可知，4類(lèi)含硫化合物的檢測(cè)方法主要包括化學(xué)檢測(cè)方法、光譜法、色譜法等（具體方法見(jiàn)表2）。雖然檢測(cè)限不斷降低、精確度不斷提高，但是檢測(cè)時(shí)常常需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理，且儀器昂貴，不適用于實(shí)際生產(chǎn)操作。這4類(lèi)含硫化合物在葡萄酒中的含量通常較低，開(kāi)發(fā)檢測(cè)限低、精確度高且便于實(shí)際生產(chǎn)操作的檢測(cè)方法有助于了解葡萄酒中含硫化合物的含量，利于高品質(zhì)葡萄酒的生產(chǎn)優(yōu)化。

4 葡萄酒貯藏期間4類(lèi)含硫化合物的變化

貯藏陳釀是葡萄酒生產(chǎn)中的重要環(huán)節(jié)。在貯藏陳釀期間，葡萄酒會(huì)發(fā)生復(fù)雜的化學(xué)變化，從而影響葡萄酒的顏色、風(fēng)味、口感和整體感官質(zhì)量，其中4類(lèi)含硫化合物在貯藏陳釀期間主要發(fā)生氧化還原反應(yīng)。

4.1 4類(lèi)含硫化合物在金屬離子作用下的變化

葡萄酒中的金屬離子主要來(lái)源于原料及葡萄酒生產(chǎn)中的外源添加劑，這些金屬離子能引起含硫化合物含量的變化，這種非酶促氧化過(guò)程是由金屬離子催化還原氧氣引發(fā)的[80]。DANILEWICZ[81-83]研究表明，氧的消耗由Fe3+介導(dǎo)，而Cu2+增強(qiáng)了這一過(guò)程。這些過(guò)渡金屬離子將氧氣氧化為過(guò)氧化氫，然后通過(guò)Fenton反應(yīng)進(jìn)一步還原產(chǎn)生極為活潑的羥基自由基，然后與葡萄酒中化合物反應(yīng)[84]。根據(jù)NEDJMA等[85]報(bào)道，在Cu2+存在的條件下，H2S可以和MeSH、EtSH發(fā)生反應(yīng)生成對(duì)稱和非對(duì)稱三硫化物。UGLIANO等[86]研究了葡萄酒裝瓶貯藏期中Cu2+對(duì)重要揮發(fā)性化合物3-MH、H2S、MeSH含量的影響，將含有不同Cu2+濃度的葡萄酒樣品裝瓶?jī)?chǔ)藏6個(gè)月，發(fā)現(xiàn)Cu2+的添加會(huì)導(dǎo)致3-MH含量在起始階段快速減少，同時(shí)使H2S含量增加；但是對(duì)MeSH的含量沒(méi)有顯著影響。VIVIERS等[87]研究了Cu2+、Fe3+、Mn2+、Zn2+和Al3+離子在儲(chǔ)存期間對(duì)葡萄酒中H2S和MeSH含量變化的影響，結(jié)果顯示這5種過(guò)渡金屬離子都會(huì)影響葡萄酒中H2S和MeSH的含量，其中Cu2+的影響最為顯著。KREITMAN等[27-28]研究表明，當(dāng)葡萄酒中存在過(guò)量的H2S和硫醇時(shí)，會(huì)引起H2S/Cu2+、硫醇/Cu2+絡(luò)合物的快速形成，并導(dǎo)致H2S和硫醇的損失。NIKOLANTONAKI等[88-89]則證實(shí)了Fe3+可以通過(guò)促進(jìn)醌的形成，加快揮發(fā)性硫醇與多酚反應(yīng)，從而影響葡萄酒中揮發(fā)性硫醇的含量。

4.2 4類(lèi)含硫化合物在氧氣作用下的變化

葡萄酒中的氧氣可能來(lái)源于加工過(guò)程中發(fā)酵、倒罐、冷凍、灌裝等工序。已有文獻(xiàn)報(bào)道，極少量的氧氣就能在陳釀期間改善葡萄酒的品質(zhì)，如減少收斂感、促進(jìn)酒色穩(wěn)定等[90-92]。DU TOIT等[34]控制葡萄酒中溶解氧的含量，發(fā)現(xiàn)還原性環(huán)境下的GSH含量更高，而氧化處理會(huì)顯著增加GSSG的含量。此外，揮發(fā)性含硫化合物的變化主要來(lái)源于氧化損失[93]。FRANCOLUESMA等[94]測(cè)定了無(wú)氧室溫環(huán)境儲(chǔ)存下葡萄酒中含硫化合物含量的變化情況，發(fā)現(xiàn)樣品酒和模型酒中游離H2S、MeSH和總MeSH含量都有顯著上升，但是H2S的總量變化不大。UGLIANO等[86]將樣品酒分別儲(chǔ)藏在空氣和氮?dú)猸h(huán)境下，結(jié)果顯示低氧條件能促進(jìn)H2S的積累并減少3-MH的降解。根據(jù)FERREIRA等[93]報(bào)道，在氧氣含量非常小的樣品酒中H2S的含量也會(huì)受影響而降低，且H2S和MeSH的含量隨氧化程度增加而降低。

表2 葡萄酒中4類(lèi)含硫化合物檢測(cè)方法比較Table 2 Comparison between detection methods of sulfur compounds in wine

由上可知，在葡萄酒貯藏陳釀期間，由于金屬離子和氧氣的作用，這4類(lèi)含硫化合物會(huì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)、Fenton反應(yīng)或沉淀等而引起含量變化（反應(yīng)方程式見(jiàn)表1）。貯藏陳釀期是影響葡萄酒風(fēng)味的重要生產(chǎn)環(huán)節(jié)，優(yōu)化工藝條件、控制金屬離子和氧氣的濃度，同時(shí)理解含硫化合物的變化機(jī)理有助于提升葡萄酒的品質(zhì)。

5 葡萄酒硫味的控制

由上述文獻(xiàn)可知，葡萄酒中含硫化合物主要來(lái)源于原料和釀酒酵母代謝，也受到原料處理、添加劑使用、貯藏陳釀等生產(chǎn)環(huán)節(jié)影響，因此主要從以下4個(gè)方面控制葡萄酒中的硫味。

5.1 原料控制

根據(jù)DES GACHONS等[95]報(bào)道，相較于低氮土壤，在含氮量合適土壤中生長(zhǎng)的葡萄果實(shí)中含有更高含量的4MMP、3MH前體物質(zhì)。以DAP作為氮補(bǔ)充劑添加到葡萄汁中會(huì)抑制MeSH、EtSH、H2S的產(chǎn)生，而對(duì)于3MH的影響仍無(wú)定論[96-99]。在制取汁時(shí)，皮渣浸漬可增加果汁中Cys3MH、G3MH的含量，相較于無(wú)皮渣浸漬和150 g·L-1皮渣浸漬葡萄汁，600 g·L-1皮渣浸漬葡萄汁發(fā)酵期間GSH產(chǎn)量更高[33,100]。根據(jù)MAGGU等[101]報(bào)道，在長(zhǎng)時(shí)間表皮接觸（skin contact）制汁時(shí)，較高壓力產(chǎn)出的壓榨果汁3MH-S-Cys含量更高，但GSH含量較低。PATEL等[102]報(bào)道，相較于自然出汁（free run juice），壓榨果汁及其成品葡萄酒的3MHA、3MH含量和酸度值較低，GSH含量下降較快。此外，發(fā)酵前補(bǔ)充GSH會(huì)引起成品葡萄酒中硫醇濃度的降低，而壓榨果汁時(shí)的巴氏殺菌過(guò)程會(huì)引起成品葡萄酒中3MHA含量增加，3MH含量降低[102]。

5.2 酵母篩選和優(yōu)化

酵母的種類(lèi)對(duì)葡萄酒風(fēng)味有重要影響，特別是揮發(fā)性含硫化合物產(chǎn)量[103-104]。BELJAK等[105]通過(guò)比較8種釀酒酵母對(duì)葡萄酒中SO2含量的影響，發(fā)現(xiàn)H2S陽(yáng)性釀酒酵母更利于SO2產(chǎn)生，且發(fā)酵初始糖濃度較高時(shí)，SO2產(chǎn)率更高。宮雪等[106]篩選得到的HO2、E22酵母菌株H2S產(chǎn)率低，且酒樣感官品質(zhì)與商業(yè)釀酒酵母VL1、RC212、C2C無(wú)明顯差異。EGLINTON等[107]比較Saccharomyces bayanus酵母和Saccharomyces cerevisiae酵母對(duì)葡萄酒品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)Saccharomyces bayanus酵母發(fā)酵的葡萄酒含有更多的甘油、琥珀酸、乙醛和SO2，較少的乙酸、蘋(píng)果酸和乙酸乙酯，且氣味特征不同。DUBOURDIEU等[108]研究得出，相較于Saccharomyces cerevisiae酵母VL3和EG8菌株，Saccharomyces bayanus酵母能產(chǎn)生更多的4MMP。

根據(jù)HARSCH等[109]報(bào)道，分別敲除釀酒酵母中17個(gè)與硫代謝相關(guān)的基因，可顯著提升或降低3MH和3MHA的產(chǎn)量，如單獨(dú)敲除CYS3、CYS4或MET17的菌株3MH和3MHA的產(chǎn)量有顯著提升，而單獨(dú)敲除SER1或SHM2的菌株3MH和3MHA產(chǎn)量有所降低。SWIEGERS等[110]通過(guò)克隆編碼一種色氨酸酶的大腸桿菌tnaA，使其在酵母菌株中表達(dá)，可使4MMP和3MH的產(chǎn)量提升24倍。DUFOUR等[111]利用一個(gè)天然的URE2突變體，通過(guò)分子標(biāo)記驅(qū)動(dòng)回交技術(shù)（backcrosses driven by molecular markers）在釀酒酵母啟動(dòng)子引入等位基因，發(fā)現(xiàn)URE2性狀遺傳能夠增加4MMP和3MH的產(chǎn)量。

5.3 優(yōu)化SO2的使用

控制外源SO2的添加，可減少酵母可利用的硫元素，從而減少異味產(chǎn)生。LUSTRATO等[112]提出使用低電流技術(shù)（LEC）替代葡萄酒生產(chǎn)中的二氧化硫添加劑，結(jié)果顯示LEC降低了尖型酵母（Apiculate yeasts）的存活時(shí)間并增加其死亡率，而不影響釀酒酵母的生長(zhǎng)和存活。LEC控制酵母菌群的作用與SO2相當(dāng)，同時(shí)減少硫元素的攝入，有利于減少異味產(chǎn)生。柳琪等[26]得出改進(jìn)或規(guī)范生產(chǎn)操作能減少葡萄酒中SO2的含量：1）盡量保證原料完好無(wú)損，受病蟲(chóng)害、破損及霉變的葡萄原料會(huì)引起葡萄醪中可與SO2結(jié)合的物質(zhì)含量增加；2）盡量保證酵母的純度，使用優(yōu)良酵母菌系，能抑制產(chǎn)SO2菌系的活性；3）加快葡萄酒的澄清，減少葡萄酒中的懸浮物與SO2結(jié)合；4）山梨酸對(duì)酵母菌有抑制作用，裝瓶時(shí)結(jié)合SO2使用，可減少SO2用量；5）維生素C具有抗氧化作用，裝瓶時(shí)可將維生素C代替或結(jié)合SO2使用。

5.4 金屬鹽處理

此外，生產(chǎn)中常用硫酸銅法、檸檬酸銅法和銀鹽法降低葡萄酒異味[113-114]。根據(jù)VELA等[115]報(bào)道，銅鹽處理可立即降低葡萄酒中游離H2S和MeSH的含量，并減緩低氧儲(chǔ)存期間游離H2S的增加。這3種方法各自存在著不足之處：1）硫酸銅法 硫酸銅可與H2S和硫醇發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，但不能與二硫化物反應(yīng)，而在儲(chǔ)存期間二硫化物易被水解還原成硫醇，產(chǎn)生不良?xì)馕叮?）檸檬酸銅法 使用時(shí)試劑用量大，釋放的銅離子較少，反應(yīng)效率較低；3）銀鹽法 處理后酒樣必須經(jīng)過(guò)皂土澄清，增加處理難度和成本。此外，用銅離子與H2S、硫醇反應(yīng)產(chǎn)生沉淀時(shí)，反應(yīng)可能不完全，導(dǎo)致少部分產(chǎn)物殘留，后分解重新生成H2S和硫醇，且上述3種處理方法都會(huì)對(duì)葡萄酒口感產(chǎn)生負(fù)面影響。

除上述方法外，控制貯藏陳釀期間葡萄酒中過(guò)渡金屬離子和氧氣的含量（見(jiàn)4.1，4.2），也有利于降低異味。還可以潑灑葡萄酒，通過(guò)揮發(fā)和氧化除去異味[116]。

6 展望

通過(guò)上述分析可知，葡萄酒中4類(lèi)含硫化合物對(duì)葡萄酒的風(fēng)味有顯著影響，但是在實(shí)際生產(chǎn)時(shí)無(wú)法精確控制其含量。這主要是因?yàn)槟壳皩?duì)4類(lèi)含硫化合物的來(lái)源和變化情況仍不清楚，特別是發(fā)酵階段變化機(jī)理及貯藏陳釀期間的變化機(jī)理。在今后的研究中可以從以下幾個(gè)方面開(kāi)展：

一是優(yōu)化含硫化合物的檢測(cè)方法，現(xiàn)有的檢測(cè)方法仍存在樣品易污染、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、精確度低等問(wèn)題。未來(lái)研究可從樣品處理方法和檢測(cè)方法分別開(kāi)展，優(yōu)化現(xiàn)有的樣品分離方法、開(kāi)發(fā)更高效的柱前衍生化試劑、優(yōu)化色譜條件等，縮短檢測(cè)時(shí)間、降低檢測(cè)限、增加精確度。

二是探究葡萄酒發(fā)酵和貯藏陳釀期間4類(lèi)含硫化合物含量變化及機(jī)理。未來(lái)在機(jī)理研究中可采用模型酒形式，控制模型酒中化合物的種類(lèi)和含量，簡(jiǎn)化反應(yīng)的環(huán)境，利于探究各類(lèi)化合物的變化情況。

三是改進(jìn)葡萄酒生產(chǎn)工藝，從原料種植環(huán)節(jié)到產(chǎn)品封裝環(huán)節(jié)層層優(yōu)化。首先，在葡萄原料種植環(huán)節(jié)，選擇合適的土壤、肥料和溫濕度等，提升葡萄果實(shí)品質(zhì)。其次，在葡萄采收環(huán)節(jié)，改進(jìn)采收技術(shù)，避免損壞果實(shí)。第三，在榨汁環(huán)節(jié)，選擇合適的壓力、氧氣含量、皮渣含量，提升葡萄汁品質(zhì)。第四，在二氧化硫使用環(huán)節(jié)，改進(jìn)使用方法，減少用量，或開(kāi)發(fā)合適的替代品，以減少產(chǎn)品中二氧化硫含量。第五，在釀造環(huán)節(jié)，篩選或生物技術(shù)改良酵母菌株，選擇合適的溫濕度、含氧量、添加劑等，減少不愉快風(fēng)味。第六，在貯藏陳釀期間，選擇合適的溫濕度、含氧量、金屬離子濃度等，進(jìn)一步提升葡萄酒品質(zhì)，并減少不愉快風(fēng)味。最后，在葡萄酒封裝環(huán)節(jié)，優(yōu)化洗瓶、灌裝工藝，選擇合適的瓶塞、滅菌條件等。