胡驍飛，李青梅，姚靜靜，胡思宇，孫亞寧，邢云瑞，鄧瑞廣，張改平,

（1河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室，鄭州 450002；2河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，鄭州 450002；3河南農(nóng)業(yè)大學，鄭州 450002）

0 引言

【研究意義】Alpha-玉米赤霉醇（α-zearalanol），又稱玉米赤霉醇（zeranol, ZAL），化學名稱為右環(huán)十四酮酚，霉菌毒素玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）的還原產(chǎn)物[1]，是一種植物性雌激素，能提高植物抗寒抗凍能力及冬小麥的春化[2]。上世紀60年代發(fā)現(xiàn)其有促進反芻動物體內(nèi)蛋白質(zhì)沉積的功能，提高牛羊飼料轉(zhuǎn)化效率，縮短牛羊育肥周期，因此被作為反芻動物促生長劑而廣泛應(yīng)用，尤其是采用埋置形式[3-4]。隨后的研究證明ZAL對單胃動物如大鼠、狗及猴子是有害的，特別是生殖方面危害[5-8]。雖然ZAL在體內(nèi)大部分會被代謝掉，但仍有一部分會殘留在埋置部位。而且通過食物鏈食用含有ZAL殘留的牛羊肉后，導致消費者促性腺激素水平的降低、內(nèi)分泌失調(diào)、生長發(fā)育障礙以及影響人體第二性征發(fā)育等不良影響，而且還具有潛在的致癌、致畸、致突變等毒性[9-12]。1996年，歐盟明確禁止在畜禽養(yǎng)殖中使用ZAL，同時要求向歐盟各國輸入的畜牧產(chǎn)品中不得檢出其殘留物[4]。2002年，我國農(nóng)業(yè)部第193號公告中明確禁止ZAL作為增重劑用于任何食源性動物，并且在食源性動物的任何可食組織中均不得檢測到。但是由于ZAL作為牛羊增重劑增重效果好、經(jīng)濟回報高等特點，仍被非法使用?！厩叭搜芯窟M展】為了減少ZAL危害，人們建立很多種ZAL檢測方法。目前常用的檢測方法包括理化法如（高效）液相色譜及其衍生方法[13-19]，氣液相色譜及其衍生方法[20-23]，薄層色譜及其衍生的方法等[24-25]。免疫學檢測方法如放射免疫分析法（RIA）、ELISA、熒光免疫分析（FIA）、化學發(fā)光免疫分析（CLIA）及免疫傳感器（Immunosensor）[4,26]。理化檢測方法雖然準確、靈敏度高，但耗時長，費用高。而免疫學檢測方法簡單，靈敏度高，特異性強，耗時短，費用低，使用便捷，可進行大批量篩檢，因而近些年免疫學檢測方法得到快速發(fā)展，劉媛等利用玉米赤霉醇單克隆抗體建立ZAL的免疫檢測方法[27]?！颈狙芯壳腥朦c】決定免疫學檢測方法靈敏度的關(guān)鍵是抗體的質(zhì)量，目前有關(guān)報道ZAL免疫學檢測抗體靈敏度均是ng級，有的甚至是更高[27-28]，可能是因為ZAL人工抗原的質(zhì)量不確定，在制備人工抗原過程中完全或部分改變了ZAL的抗原決定簇，因此導致制備的抗體靈敏度不高，甚至可能并不是ZAL的抗體?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究針對現(xiàn)有的ZAL抗體制備存在的不足，從抗原制備源頭開始，擬通過利用抗體的非特異性反應(yīng)（交叉反應(yīng)性），利用ZAL結(jié)構(gòu)類似物玉米赤霉酮（ZAN）制備抗原，然后免疫動物，在抗血清及細胞培養(yǎng)上清抗體靈敏度檢測時，以ZAL為阻斷劑，從而篩選能分泌抗ZAL單抗的雜交瘤細胞株，建立一種ZAL抗體制備新方法，為高靈敏的ZAL免疫學檢測方法研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

本試驗于2014—2017年在河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室完成。

1.1 試劑

α-玉米赤霉醇（ZAL）、β-玉米赤霉醇（β-ZAL）、α-玉米赤霉烯醇（α-ZEL）、β-玉米赤霉烯醇（β-ZEL）、玉米赤霉酮（ZAN）、玉米赤霉烯酮（ZEN）及黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1, AFB1）標準品、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、牛血清白蛋白（Bovine serum albumin, BSA）、卵清蛋白（Ovalbumin, OVA）、非那西丁、過氧化脲購自于Sigma-Aldrich公司。赭曲霉毒素A（Ochratoxin A, OTA）、伏馬菌素B1（FB1）、T-2毒素及嘔吐毒素（Deoxynivalenol, DON）標準品、EDC[1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）-碳二亞胺由Thermo scientific公司生產(chǎn)；弗氏完全佐劑（Freund's complete adjuvant, FCA）及弗氏不完全佐劑（Freund's incomplete adjuvant, FIA）購自于Pierce公司；羧甲基羥胺半鹽酸鹽（CMO）購自日本東京化成工業(yè)株式會社；酶標記二抗（羊抗鼠IgG抗體，GaMIgG-HRP）購自華美生物工程有限公司；ZEN 單克隆抗體，河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室制備；3, 3′, 5, 5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）等其他試劑均購自于市售，均為國產(chǎn)分析純或更高級別試劑。

1.2 溶液

0.01 mol·L-1，pH7.4磷酸鹽緩沖液（PBS），實驗室自配，室溫保存（注：用于動物免疫時必須經(jīng)高壓滅菌處理）。0.05 mol·L-1，pH9.6碳酸鹽緩沖液（CBS），實驗室自配，室溫保存。ELISA實驗洗液PBST，PBS+0.05% Tween-20，實驗室自配，室溫保存。顯色液A，含有非那西丁及過氧化脲的0.1 mol·L-1pH5.0乙酸鈉-檸檬酸緩沖液，冷藏避光保存；顯色液B，含有TMB的等量甲醇與甘油混合溶液，實驗室自配；使用時顯色液A和顯色液B等量混合均勻。終止液：2 mol·L-1硫酸溶液，實驗室自配。

1.3 實驗動物及細胞系

SPF級6周齡雌性BALB/c小鼠，河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室實驗動物中心繁殖飼養(yǎng)。細胞融合所用NS0細胞系，英國動物健康研究院惠贈，河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室傳代培養(yǎng)。

1.4 試驗方法

1.4.1 ZAN人工抗原制備 2 mg ZAN 溶于2 mL無水吡啶，加入4 mg CMO，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上（115℃）控溫回流2 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，2 mL甲醇（每次1 mL，洗滌2次）洗滌干燥物，旋干；1 mL雙蒸水（DDW）溶解制備所得物，2 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值到8.0；等體積甲苯抽提3次，棄甲苯層，留水相層；水相用等體積乙酸乙酯萃取3次，棄水相，留乙酸乙酯相，旋干，得到ZAN-O。ZAN肟化改造路線見圖1。

0.5 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解上述ZAN-O，轉(zhuǎn)移至有轉(zhuǎn)子的平底玻璃瓶，0.5 mL DMF洗滌旋轉(zhuǎn)瓶，溶液轉(zhuǎn)移至上述玻璃瓶中，磁力攪拌器上攪動的同時向玻璃瓶加入2 mg EDC和1.2 mg NHS，室溫攪拌2 h，記為A液。

稱取5 mg BSA于放置有轉(zhuǎn)子的平底玻璃瓶中，加入500 μL 0.3% NaHCO3，記為B液。磁力攪拌器上，邊攪拌邊緩慢加入A液，室溫攪拌反應(yīng)2 h。

將上述溶液裝入制備好的透析袋內(nèi)，對PBS透析3 d，第一天換透析液8次，第二天換透析液6次，第三天換透析液4次，得到ZAN-O-BSA。

分別稱取和上述一樣質(zhì)量的ZAN，EDC，NHS，和BSA一樣質(zhì)量的OVA（提前1天把OVA溶解于0.3%NaHCO3），采用與上述相同的方法，制備出ZAN-O-OVA。

圖1 ZAN 肟化改造路線圖Fig.1 Roadmap of ZAN structural renovation by oximation

1.4.2 人工抗原的質(zhì)量鑒定 采用河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室制備的ZEN單克隆抗體對所制備的人工抗原進行鑒定。制備的ZAN-O-BSA及ZAN-O-OVA分別用CBS稀釋到4 μg·mL-1，分別包被酶標板，并采用5%（v/v）豬血清封閉酶標板，制備出ZAN-O-BSA及ZAN-O-OVA酶標板。間接ELISA測定ZEN單抗效價[ZEN單抗先用PBS稀釋到1∶5 000（v/v）]，酶標板上的孔先分別加入50 μL PBS，然后第一孔加入50 μL上述制備的單抗溶液，移液槍吹打混勻后，取出50 μL加入到第二孔，吹打混勻，取出50 μL加入到第三孔，同樣的方法，一直倍比稀釋到第七孔，混勻后，取出50 μL棄掉，第八孔作為空白（BC）對照孔；37℃恒溫箱孵育15 min，PBST洗板4—6次，并拍干；加入PBS 1∶1000倍（v/v）稀釋的HRP標記的抗IgG抗體50 μL/孔，37℃恒溫箱孵育30 min，PBST洗板4—6次，并拍干；加入顯色液50 μL/孔，室溫孵育10 min，每孔加入50 μL終止液，酶標儀450 nm濾光片讀值（OD450）。根據(jù)ZEN效價的有無確定抗原制備是否成功。

1.4.3 動物免疫及免疫效果測定

1.4.3.1 動物免疫 選取健康的SPF級6周齡雌性BALB/c小鼠6只，用ZAN-O-BSA進行免疫。免疫劑量50 μg蛋白/（200 μL·只老鼠）；采用背部皮下的免疫方式，4—6個點注射；共免疫4次；間隔3—4周。第一次免疫時，用PBS稀釋ZAN-O-BSA到100 μg蛋白/200 μL，加入等量的FCA，充分乳化后（取乳化好的乳液一滴，置于水面上，乳滴浮在水面上且不發(fā)生擴散，證明乳化完全）注射入BALB/c小鼠皮下。后3次強化免疫時，把FCA改換為FIA即可，其他試劑及程序不變。

1.4.3.2 免疫效果測定 四免10 d后，斷尾采血10 μL，加入到990 μL PBS中，5 000 r/min離心10 min，棄沉淀留上清用于血清效價和靈敏度（即半數(shù)抑制濃度，IC50）測定。ZAN-O-OVA 2 μg·mL-1包被酶標板，5%（v/v）豬血清封閉酶標板。間接ELISA測定血清效價，步驟同1.4.2中ZEN單抗效價測定；結(jié)果判定時，P/N≥2.1（待測孔OD450/BC孔OD450≥2.1）且待測孔 OD450≥0.2，則判定為陽性孔。間接競爭（阻斷）ELISA測定血清靈敏度時，ZAL作為競爭物與酶標板上包被的ZAN-O -OVA競爭結(jié)合血清抗體，把濃度分別為500、250、125、62.5、31.25、15.62、0 ng·mL-1的ZAL標準液，按50 μL/孔分別加入到酶標板孔中，然后每孔再加入50 μL血清（血清最終稀釋倍數(shù)是效價測定時，OD450值最為接近于1.0時對應(yīng)的稀釋值），后面的試驗步驟與效價測定完全一致。

1.4.4 ZAL單抗制備及免疫學性能鑒定

1.4.4.1 陽性雜交瘤篩選 選取小鼠血清效價高，靈敏度好，即IC50值比較小的小鼠作為細胞融合用小鼠。高壓無菌處理的PBS稀釋ZAN-O-BSA至50 μg蛋白/200 μL，不加佐劑，直接注射到用于細胞融合的小鼠腹腔中進行超強免疫。3 d后，摘取眼球放血，抻頸處死小鼠，小鼠尸體置于75%酒精中浸泡5 min。超凈臺上無菌取小鼠脾臟與NS0細胞進行融合。細胞融合過程按孫亞寧[29]描述進行，小鼠脾臟細胞與NS0細胞融合后，均勻的融合細胞懸液按100 μL/孔分別加入到96孔酶標板上，共鋪10塊酶標板，960個孔，放于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。陽性雜交瘤細胞篩選過程按胡驍飛等[30]描述進行，間接ELISA測定細胞上清效價，阻斷ELISA測定細胞上清靈敏度。最終選效價高、靈敏度好、細胞生長旺盛的孔，轉(zhuǎn)入24孔培養(yǎng)板中擴大培養(yǎng)后進行2次有限稀釋亞克隆化，然后擴大培養(yǎng)、建株、反復凍存與復蘇，最后篩選到能穩(wěn)定分泌抗ZAL單克隆抗體的細胞株。收集的眼球血液37℃恒溫箱靜置2 h，5 000 r/min，離心10 min，收集上層陽性血清，-20℃保存，作為陽性對照血清，在細胞融合篩選時使用。

1.4.4.2 腹水制備 體內(nèi)誘生腹水法批量制備抗體。向小鼠體內(nèi)注入石蠟400 μL/只以誘發(fā)炎癥，7—10 d后注入制備好的雜交瘤細胞，觀察小鼠腹部變化，一般小鼠在注射10 d左右，小鼠腹腔變大，小鼠腹腔皮膚緊繃時，用消毒的大號針頭刺破腹腔，收集腹腔液體即為腹水。

1.4.4.3 單抗免疫學性能鑒定 采用one dropTM光譜儀測定單抗蛋白濃度。

間接ELISA測定單抗效價，步驟同1.4.3.2中血清效價測定。

間接競爭ELISA測定單抗靈敏度，步驟同1.4.3.2中血清靈敏度測定。

間接競爭ELISA測定單抗特異性，把競爭物替換為ZAL的結(jié)構(gòu)類似物、其他霉菌毒素以及人工抗原制備時所用的載體蛋白BSA和OVA，不同的競爭為物質(zhì)的濃度不同。

親和力曲線測定按照姚靜靜等[31]描述方法稍作改動。PBS稀釋ZAN-O-OVA成0.5 μg·mL-1和1 μg·mL-1兩個濃度進行包板。PBS稀釋單抗蛋白至128 μg·mL-1。在兩個ZAN-O-OVA濃度包被的酶標板上，分別加入倍比稀釋上述已知質(zhì)量濃度的單抗，測定OD450值，以O(shè)D450為橫坐標，單抗?jié)舛葹闄M坐標，建立親和力曲線。根據(jù)親和力常數(shù)計算公式，計算親和力常數(shù)Ka值[32]。

2 結(jié)果

2.1 人工抗原質(zhì)量分析

紫外掃描測定ZAN-O-BSA及ZAN-O-OVA的濃度分別為5.78和8.9 mg·mL-1。CBS分別把二者稀釋到4 μg·mL-1包板，測定ZEN單克隆抗體的效價，結(jié)果見表1。從表1可以看出，ZAN-O-BSA及ZAN-OOVA包被的酶標板均能測定出ZEN單抗的效價，且隨著抗體濃度的降低，OD450值呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，說明制備的人工抗原時與ZEN抗體可以結(jié)合，人工抗原制備是成功的。

2.2 融合小鼠的篩選

小鼠血清效價測定結(jié)果見表2，表明ZAN-O -BSA免疫小鼠后能夠刺激機體產(chǎn)生抗體。血清靈敏度測定結(jié)果見表3，從表3可以看出，6只免疫ZAN-O-BSA的小鼠均能產(chǎn)生抗ZAL抗體，500 ng·mL-1以下濃度的ZAL可以或強或弱地抑制ZAN與血清抗體的結(jié)合。其中6號小鼠血清靈敏度最好，通過擬合標準曲線（圖2），可以計算得出IC50為40.04 ng·mL-1，因此選擇6號小鼠作為融合小鼠。

2.3 陽性雜交瘤細胞的篩選

細胞融合3 d后觀察酶標板，發(fā)現(xiàn)其中898孔有細胞生長，其余62個孔沒有看見細胞生長，即93.54%細胞孔有細胞生長，說明細胞融合率比較高。待融合細胞生長至覆蓋培養(yǎng)孔1/3孔底面積時，將培養(yǎng)細胞板各孔的細胞上清取出25 μL，加入到每孔含有25 μL PBS的ZAN-O-OVA包被的酶標板孔中，間接ELISA測定細胞上清OD450值，OD450值在1.0以上的認為是陽性孔，共有44孔，陽性孔率為4.58%，以5、2 ng·mL-1兩個濃度ZAL測定44個陽性孔細胞上清液的靈敏度，其中2孔細胞上清IC50在2 ng·mL-1以下。將這2孔細胞轉(zhuǎn)至24孔酶標板擴大培養(yǎng)亞克隆，用1 ng·mL-1ZAL測定細胞上清液的靈敏度，選擇IC50在1 ng·mL-1以下陽性孔，最終得到一株能分泌抗ZAL單克隆抗體的雜交瘤細胞株12B10A7。

圖2 6號免疫小鼠血清抑制曲線圖Fig.2 The serum inhibition curve of NO.6 immunized mouse

表1 制備的ZAN-O-BSA及ZAN-O-OVA 包板測定ZEN單克隆抗體效價Table 1 The ZEN McAb’s titer detected by microplates coated with the prepared ZAN-O-BSA or ZAN-O-OVA

表2 ZAN-O-BSA免疫小鼠后血清抗體效價Table 2 The serum titer of mice immunized with ZAN-O-BSA

表3 ZAN-O-BSA免疫小鼠后血清靈敏度Table 3 The serum sensitivity of mice immunized with ZAN-O-BSA

2.4 單抗性能鑒定

光譜儀測定單抗蛋白濃度約為20.29 mg·mL-1。間接ELISA測定單抗效價為2.56×105，結(jié)果見表4。

間接競爭ELISA測定了單抗腹水的靈敏度，其抑制曲線見圖3，線性方程為y=-0.5483x+0.3691，相關(guān)系數(shù)R2=0.9666，通過公式計算IC50為0.577 ng·mL-1。

單抗特異性鑒定結(jié)果見表5，從結(jié)果可以看出，所制備的單克隆抗體除了與α-ZAL反應(yīng)外，與ZAN有77.65%的交叉反應(yīng)率，與β-ZAL有43.06%的交叉反應(yīng)率，與α-ZEL和β-ZEL分別有15%左右的交叉反應(yīng)率，與ZEN有近10%的交叉反應(yīng)率，與其他霉菌毒素如AFB1、OTA、FB1、T-2毒素、DON以及載體蛋白BSA、OVA交叉反應(yīng)率均小于0.1%。

表4 ZAL單抗效價Table 4 The titer of ZAL McAb

表5 ZAL單抗特異性Table 5 The specificity of ZAL McAb

圖3 ZAL單抗的抑制曲線圖Fig.3 The serum inhibition curve of ZAL McAb

親和力曲線測定如圖4。ZAL mAb與抗原結(jié)合達半飽和時對應(yīng)ZAL mAb的濃度分別是9.04×10-9和8.54×10-9mol·L-1，將所得的值換算成摩爾濃度值帶進公式得Ka為6.21×107L·mol-1。GODING認為，親和常數(shù)為107—1012L·mol-1時表明抗體具有高親和力[33]，因此本試驗獲得了高親和力的ZAL mAb。

圖4 ZAL單抗親和曲線Fig.4 The affinity curve of ZAL McAb

3 討論

ZAN分子量為320.38，屬小分子半抗原物質(zhì)，由于其自身結(jié)構(gòu)簡單，只具有免疫反應(yīng)性，可以與相應(yīng)的抗體結(jié)合；但不具有免疫原性，因此不能直接刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，必須與大分子的載體物質(zhì)如BSA，OVA，匙孔血藍蛋白（KLH，Keyhole limpet hemocyanin）或非抗原性的多聚賴氨酸等偶聯(lián)后，才能具有免疫原性，通過刺激動物機體產(chǎn)生針對ZAN的抗體。小分子與載體蛋白偶聯(lián)是否成功需要進行質(zhì)量鑒定，鑒定方法一般包括紫外掃描鑒定、凝膠電泳鑒定、紅外光譜法（IR）鑒定、質(zhì)譜鑒定及動物免疫鑒定[34-35]。紫外掃描、凝膠電泳、紅外光譜及質(zhì)譜鑒定只是根據(jù)物質(zhì)特征吸收峰有無變化、載體蛋白分子質(zhì)量變化情況來初步判定半抗原與載體蛋白是否偶聯(lián)在一起，但不能確定偶聯(lián)方式是否正確，也即偶聯(lián)過程中是否對半抗原的特征結(jié)構(gòu)（半抗原的抗原決定簇）產(chǎn)生影響，如果偶聯(lián)過程中半抗原的抗原決定簇被破壞，則即使半抗原與載體蛋白偶聯(lián)在一起，即使能刺激動物機體產(chǎn)生抗體，但所產(chǎn)生的抗體并不是針對半抗原的抗體。因此，半抗原與載體蛋白偶聯(lián)是否成功，是否能刺激機體產(chǎn)生針對半抗原的抗體，最好的方法是通過免疫動物來確定，或者用已知的半抗原的抗體來確定。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，制備的玉米赤霉烯酮單克隆抗體與玉米赤霉酮有交叉反應(yīng)性，但和BSA及OVA沒有交叉反應(yīng)性[36]，因此，本研究中用制備的ZAN-O-BAS及ZAN-O-OVA包板測定ZEN抗體效價，以確定ZAN是否與BSA及OVA正確偶聯(lián)，而結(jié)果兩個人工抗原均能測定到ZEN抗體效價，說明本研究中的偶聯(lián)方法正確，且制備的人工抗原是成功的，制備過程并沒有改變ZAN的抗原決定簇，為后面抗體的制備奠定了良好的基礎(chǔ)。

半抗原、抗原和抗體之間的特異性結(jié)合，其分子機制是抗原分子表面存在著能與抗體相互作用的部位即抗原決定簇，是抗原表位的空間結(jié)構(gòu)與抗體分子超變區(qū)互補以及氫鍵、疏水性、靜電作用等形成的低能勢共同作用的結(jié)果[37]，也即抗體是從抗原決定簇的立體結(jié)構(gòu)而不是從抗原的全面分子排列來“認識”抗原的，因此，半抗原分子的空間構(gòu)像對抗體免疫學特性有決定性影響，半抗原分子改造或偶聯(lián)過程中如果空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，則很可能制備不出所需要的抗體。

交叉反應(yīng)性是指抗體可以與分子結(jié)構(gòu)并不完全相同但具有類似抗原決定簇的不同抗原起反應(yīng)，交叉反應(yīng)實質(zhì)上也是抗原與抗體的特異性結(jié)合。交叉反應(yīng)通常發(fā)生在含有相同結(jié)構(gòu)，特別是相同空間結(jié)構(gòu)的半抗原之間，也可發(fā)生于具有相似抗原決定簇或相似結(jié)構(gòu)部位的半抗原之間[38]。ZAL及ZAN均屬于小分子化合物，根據(jù)分子抗原決定簇數(shù)目計算公式，分子量小于1萬，抗原決定簇只有1個[39]。ZAN和ZAL二者只是在七位碳原子上的結(jié)構(gòu)（結(jié)構(gòu)式見表4）有所不同，ZAL的C7位碳原子為羥基，而ZAN為酮基，二者的抗原決定簇可能有一定的交叉重合，因此產(chǎn)生交叉反應(yīng)性。以前的研究證明ZEN抗體與ZAN及ZAL有一定的交叉反應(yīng)[36]，說明三者的抗原決定簇至少有部分是重疊的。從ZEN結(jié)構(gòu)上分析可以看出ZEN中C11-C12位點雙鍵肯定是抗原決定簇的一部分，同時C7位點的結(jié)構(gòu)也應(yīng)該是抗原決定簇一部分，可能正是由于這兩個部位結(jié)構(gòu)的不同，導致ZEN單抗與ZAN及ZAL交叉反應(yīng)率的不同，也導致本試驗中制備的ZAL單抗與ZEN及ZAL交叉反應(yīng)率的不同。

筆者以往在對ZAL苯環(huán)上的羥基進行改造制備人工抗原時，可能是破壞了或至少是部分破壞了抗原決定簇，因此導致制備的抗體靈敏度不高，甚至制備的抗體可能不是真正的ZAL抗體，因此用ZAL阻斷ZAL-O-OVA與ZAL-O-BSA免疫動物產(chǎn)生的抗體反應(yīng)時，并沒有見到阻斷作用或阻斷效果不好。而用ZAN肟化改造C7位的酮基時，改造后其結(jié)構(gòu)與ZAL結(jié)構(gòu)比較相似，可能抗原決定簇比較吻合，因此ZAN-O-BSA免疫動物產(chǎn)生的抗體，可以與ZAL反應(yīng)，而且反應(yīng)靈敏度比較高。

本研究制備的ZAL抗體與其結(jié)構(gòu)類似物（β-ZAL、α-ZEL、β-ZEL、ZAN、ZEN）有或多或少的交叉反應(yīng)性，用此抗體建立ZAL免疫學檢測方法進行樣品檢測時，即使樣品中不含ZAL，而含有其結(jié)構(gòu)類似物，檢測結(jié)果也可能是陽性。由于玉米赤霉醇結(jié)構(gòu)類似物也基本都是有害的，如果建立的檢測方法能夠檢測到，則更有利于對玉米赤霉醇的監(jiān)控。我國農(nóng)業(yè)部2012年10月1日開始實行的《農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測管理辦法》明確規(guī)定，可以采用快速檢測方法對樣品進行篩查，然后再通過國家標準的理化檢測方法進行確證，可以保證對玉米赤霉醇檢測不會出現(xiàn)假陰性結(jié)果，而避免漏檢。

4 結(jié)論

利用制備的人工抗原ZAN-O-BSA免疫動物產(chǎn)生抗血清，玉米赤霉醇作為檢測靶標物，通過阻斷ELISA篩選，篩選出分泌抗玉米赤霉醇單克隆抗體的雜交瘤細胞，并制備出玉米赤霉醇單克隆抗體，該抗體靈敏度高IC50為577 pg·mL-1，親和力強?；谒狙芯克苽涞膯慰寺】贵w，可以建立玉米赤霉醇酶聯(lián)免疫、化學發(fā)光、時間分辨、熒光偏振等免疫學檢測方法，并可制備玉米赤霉醇膠體金試紙條及拉曼增強膠體金試紙條等快速檢測產(chǎn)品。