樊秀敏

（遼寧省朝陽市建平縣畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，遼寧 朝陽 122400）

金剛烷胺為禁止用于獸用的抗病毒藥品。金剛烷胺具有神經(jīng)毒性，能使中樞神經(jīng)系統(tǒng)受刺激或中毒，在食品中殘留，對心肺及腎功能不全者，還容易導致蓄積毒性。

1 酶聯(lián)免疫試劑盒準備

金剛烷胺酶聯(lián)免疫試劑盒（Ⅳ型）。北京維德維康生物技術有限公司生產(chǎn)。

2 原理

雞肉中的金剛烷胺與酶標板上固定的金剛烷胺特異性競爭抗體，當雞肉中不含金剛烷胺或金剛烷胺含量很少時，更多的抗體就會與酶標板上的金剛烷胺結(jié)合，結(jié)合物被固定在酶標板上，加入酶標記物以后，底物被催化顯色，根據(jù)顯色的深淺來判斷雞肉中金剛烷胺的含量。顯色越深，含量越少，顯色越淺，含量越多。

3 工作液準備

3.1 樣品提取液 1份濃縮樣品提取液加19份去離子水。

3.2 樣品稀釋液 1份濃縮樣品稀釋液加9份去離子水。

3.3 洗滌工作液 1份濃縮洗滌液加19份去離子水。

3.4 酶標記物工作液 1份酶標記物濃縮液加10份酶標記物稀釋液。

4 雞肉前處理

4.1 稱取2±0.05g均質(zhì)后的雞肉于50mL離心管中。

4.2 加入4mL樣品提取液充分渦動5min。

4.3 離心機4000g以上，離心5min。

4.4 取0.2mL上清液于干凈離心管中，加入0.2mL樣品稀釋液充分渦動10s。

4.5 取50μL進行檢測。

5 檢測

5.1 根據(jù)樣品數(shù)量的多少取出相應數(shù)量的酶標板條固定在酶標板架上，要求做兩個平行樣，標記清楚標準品和樣品的滴加位置。未使用的酶標板條用自封袋密封后，立即保存期于2～8℃環(huán)境中。

5.2 將 50μL 各標準品工作液（0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1ppb）和50μL各樣品溶液分別加入對應的酶標板孔中。

5.3 各孔均加入50μL酶標記物工作液，槍頭不能接觸到酶標板孔中的液體。

5.4 把酶標板用蓋板膜蓋好，輕輕振蕩酶標板10s，使溶液充分混勻，在室溫（25±2℃）下避光反應30min。

5.5 揭開蓋板膜，把酶標板孔中的液體倒凈，在每個孔中分別加入260μL洗滌工作液，充分洗滌4次，每次浸泡10～20s。

5.6 洗滌完畢后，倒掉酶標板孔中洗滌工作液，將酶標板倒倒置于吸水紙上，輕輕拍打到拍干。（用干凈的槍頭戳破孔底的氣泡，為防止交叉污染戳氣泡時要更換槍頭）

5.7 立即在每個孔中分別加入100μL底物A、B的混合液（底物A、B按1：1比例混合，混合液使用不能超過5min）。

5.8 把酶標板用蓋板膜蓋好，輕輕振蕩酶標板10s，使溶液充分混勻，在室溫（25±2℃）下避光反應10min。

5.9 揭開蓋板膜，各孔中分別加入50μL終止液，輕輕振蕩酶標板10s，使溶液充分混勻。

5.1 0 加入終止液5min內(nèi)，用酶標儀在雙波長450nm、630 nm下讀取酶標板吸光度值。

6 注意事項

6.1 試劑盒貯存于2～8℃環(huán)境中，切勿冷凍。

6.2 使用試劑盒前，應仔細閱讀說明書。

6.3 請勿使用過期試劑盒，不同批號試劑盒中的試劑不能混用。

6.4 使用試劑盒前，將盒內(nèi)各組份放在實驗臺上恢復至室溫25±2℃。

6.5 樣品處理前先恢復至室溫，處理完畢后應立即檢測。

6.6 避免使用金屬類物質(zhì)盛裝和攪拌試劑。

6.7 各試劑在使用前應搖勻，混合時避免出現(xiàn)氣泡。

6.8 酶標板孔中加入樣品溶液、酶標記物工作液、AB混合液、終止液各步驟時間不得超過3min。

6.9 終止液中含有強酸物質(zhì)，若不小心濺到皮膚或衣物上請立即用水沖洗。

6.1 0 檢測過程中所用槍頭不得重復使用。

做酶聯(lián)免疫檢測實驗是一項認真謹慎的工作，把握好每一個環(huán)節(jié)都顯得尤為重要，只有嚴格按照操作要求去做，才能保證檢測結(jié)果的準確性，同時對監(jiān)控違禁藥品的使用也具有重要意義。