徐春梅，鄒婭，劉自剛，米文博，徐明霞，董小云，曹小東，鄭國強，方新玲

（甘肅農業(yè)大學農學院/甘肅省油菜工程與技術研究中心/甘肅省干旱生境作物學重點實驗室/甘肅省作物遺傳改良與種質創(chuàng)新重點實驗室，蘭州 730070）

0 引言

【研究意義】中國北方冬季嚴寒漫長，屬于傳統(tǒng)一年一熟制區(qū)，白菜型冬油菜是該區(qū)主要越冬作物。白菜型冬油菜具有優(yōu)異抗寒性和較強的感溫性，強冬性冬油菜幼苗完成春化所需時間長，南繁或室內加代存在較大困難，使冬油菜育種進程極為緩慢，不適應高效育種的需求[1-2]。本研究探討白菜型冬油菜萌動種子低溫春化的可能性，萌動種子如能感受低溫完成春化，即可簡便地對大規(guī)模育種材料等進行春化處理，對縮短冬油菜育種周期、提高育種效率具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】春化作用是冬性植物感受環(huán)境低溫機體由營養(yǎng)生長轉向生殖生長，最終誘導植株成花的過程[3]。植物春化分為綠體春化和種芽春化2種方式，綠體春化需要植株生長至一定大小，此時幼苗才可感受低溫通過春化，缺點是占用空間大，費時費力；種芽春化是在種子萌動狀態(tài)下進行春化處理，可同時對大量種子進行處理，要求設備簡單，省時省力[4]，能滿足對育種材料繁育加代的需求。研究表明冷藏柜和生長室4℃低溫對油菜萌動種子進行春化處理，可實現(xiàn)冬性和半冬性品種的加代；感溫性不同的大白菜品種通過春化所需低溫處理時間不同，冬性越強低溫處理時間越長；隨低溫春化時間的延長，冬性材料現(xiàn)蕾的時間逐漸提早，開花株率增加；半冬性甘藍型油菜試管苗置于6—8℃光照培養(yǎng)箱處理32 d，所有植株均可通過春化[5-10]。青花菜[11]和小麥[12]萌動種子低溫處理后，青花菜促進其花芽分化；小麥抽穗提前，粒重增加。通過在高緯度高海拔地區(qū)早春播種不同感溫性白菜型冬油菜育種材料，發(fā)現(xiàn)顯蕾不抽薹、抽薹不開花、結實不正常等明顯不完全春化現(xiàn)象，其生育期進程、植高、結籽率等經(jīng)濟性狀與春化率密切相關。另外，激素、硝酸還原酶、胞內生理狀態(tài)等均與植物低溫春化狀態(tài)和程度有關[13-15]?！颈狙芯壳腥朦c】白菜型冬油菜[16]的春化研究中，采用5—6葉齡的幼苗進行自然越冬和低溫培養(yǎng)，易受空間限制，繁育加代困難。而萌動種子低溫春化能夠加快繁育速度，但目前對不同感溫性冬油菜品種萌動種子低溫春化的研究較少，且具體春化時間不明確?！緮M解決的關鍵問題】本研究以不同感溫性白菜型冬油菜品種為材料，萌動后低溫（4℃）春化處理不同時間（20—60 d），研究萌動種子能否感受低溫完成春化，對其生理生化響應、激素水平、萌動種子播種后株高、結實性差異進行研究，明確不同感溫性白菜型冬油菜春化所需低溫時長，探討北方白菜型冬油菜利用人工低溫春化加代的方法，為加快育種進程提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料為白菜型冬油菜隴油7號、隴油9號和天油4號的萌動種子，均由甘肅農業(yè)大學提供；隴油7號、隴油9號和天油4號在蘭州新區(qū)氣候條件下的越冬率分別為97.6%、89.3%和80.2%，冬性強弱順序為隴油7號＞隴油9號＞天油4號。

1.2 種子的處理方法

試驗于2018年5月在甘肅農業(yè)大學干旱生境作物學重點實驗室進行，選取飽滿均勻、大小一致的隴油7號、隴油9號和天油4號白菜型冬油菜種子，用70%酒精消毒1 min，無菌水沖洗3遍，再用0.01%氯化汞消毒5 min，無菌水沖洗3遍，播于鋪有兩層濾紙的玻璃培養(yǎng)皿中，在光照培養(yǎng)箱（25℃）中萌動，待種子露白后，4℃低溫處理。5月10日開始，處理20 d后取出一批萌動種子；之后，每隔10 d取出一批萌動種子，直至低溫春化處理60 d，共5個處理時間（20、30、40、50和60 d），0 d為對照。每處理的萌動種子均分成2份，一份播種于裝滿營養(yǎng)土的盆缽中，用于觀察統(tǒng)計春化率、測定表型性狀等；另一份萌動種子液氮速凍，用于測定激素等生理指標。試驗均重復3次。

1.3 測定指標和方法

1.3.1 表型統(tǒng)計 播種于營養(yǎng)缽中的萌動種子，待幼苗生長15 d后，需每天觀察生育期進程，現(xiàn)蕾即看作通過春化，計算春化率，公式為：春化率=（現(xiàn)蕾株數(shù)+抽薹株數(shù)+開花株數(shù)）/總株數(shù)×100%[17]；初花期、成熟期各測量一次株高，成熟期測定結實率等經(jīng)濟性狀。

1.3.2 生理指標的測定 按照鄒琦[18]的方法測定葉片生理生化指標，采用離體法測定硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）活性，NBT光還原法檢測超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，愈創(chuàng)木酚法檢測過氧化物酶（peroxidase，POD）活性，紫外吸收法檢測過氧化氫酶（catalase，CAT）活性，考馬斯亮藍G-250法檢測可溶性蛋白（soluble protein，SP）含量，蒽酮法檢測可溶性糖（soluble sugar，SS）含量，2-硫代巴比妥酸法測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。

1.3.3 內源激素的測定 采用液相色譜質譜聯(lián)用儀Agilent LC-MS（美國安捷倫公司）測定赤霉素（gibberellin，GA3）、生長素（auxin，IAA）和脫落酸（abscisic acid，ABA）[19-20]。

色譜參數(shù)：色譜柱：Agilent SB-C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：A泵溶液：0.1%甲酸水溶液，B泵溶液：甲醇；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：40℃；進樣量：2 μL。質譜參數(shù)：在MRM模式下，用負離子模式，毛細管電壓為4 kV，干燥器流量為11 L·min-1，干燥器溫度為350℃，MS參數(shù)見表1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用Excel 2013和SPSS19統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)整理和分析。

2 結果

2.1 春化時間對白菜型冬油菜現(xiàn)蕾開花的影響

隨低溫春化處理天數(shù)的增加，白菜型冬油菜的春化率基本呈上升趨勢；未進行低溫春化處理的萌動種子形成的植株（CK），未見現(xiàn)蕾開花單株，各品種春化率均為0。隴油7號萌動種子低溫春化處理20 d所形成的植株，其春化率僅為25.81%，當春化時間增加至60 d時，其春化率達到86.96%；隴油9號、天油4號均呈相似趨勢（圖1和表2）。

不同感溫性白菜型冬油菜品種萌動種子通過春化（春化率＞95%）所需低溫處理時間明顯不同。隴油7號所需低溫處理時間最長，為76.9 d，隴油9號為54.0 d，天油4號最短為39.4 d。天油4號萌動種子低溫處理30 d形成植株春化率達到93.10%；而隴油9號和隴油7號春化率僅為56.52%和19.23%（表2）。此外，白菜型冬油菜感溫性（春化所需低溫天數(shù)）與抗寒性（越冬率）呈顯著正相關（r=0.988），表明白菜型冬油菜冬性越強的品種其抗寒性也越強。

表1 不同內源植物激素在MRM模式下的MS參數(shù)Table 1 MS/MS conditions for different endogenous plant hormones

圖1 不同春化時間對白菜型冬油菜表型的影響Fig.1 Effect of vernalization time on phenotype of B.rapa

表2 不同春化時間對白菜型冬油菜春化率的影響Table 2 Effect of vernalization time on the number of flowering plants of B.rapa (%)

2.2 春化時間對白菜型冬油菜株高的影響

隨春化處理時間的增加，白菜型冬油菜初花期和成熟期株高均呈升高趨勢（表3）。隴油7號萌動種子低溫春化處理20 d時初花期、成熟期平均株高僅為5.68和15.16 cm；60 d時初花期、成熟期平均株高可達29.80和68.26 cm。低溫春化處理相同時間時，不同品種初花期和成熟期株高總體表現(xiàn)為冬性越弱，株高越高；低溫春化處理20—60 d，天油4號株高均明顯高于隴油9號和隴油7號。

表3 春化時間對白菜型冬油菜株高的影響Table 3 Effect of vernalization time on plant height of B.rapa

2.3 春化時間對白菜型冬油菜結實性能的影響

隨著低溫春化處理時間增加，白菜型冬油菜植株的一次分枝數(shù)、單株角果數(shù)、角果長度、角果粒數(shù)、單株產量等性狀均呈升高趨勢（表4），表明隨著低溫春化時間增加，可明顯提高植株結實能力。如隴油7號萌動種子低溫春化20 d，角果數(shù)37個，角粒數(shù)12.33粒，平均單株產量0.74 g；當?shù)蜏卮夯瘯r間增至60 d時，植株角果數(shù)增加54.9%，角粒數(shù)、單株產量均增加73.0%；萌動種子低溫春化時間增加后，隴油7號植株結實能力大量提高。

各品種在低溫春化處理前期，通過春化植株的結實能力在品種間差異表現(xiàn)明顯；隨春化處理時間延長，品種間結實能力的差異逐漸減小。低溫春化20—30 d，隴油9號植株分枝數(shù)顯著高于隴油7號和天油4號，延長至40 d以上，隴油9號分枝數(shù)仍略高于其他2個品種，但品種間差異均未達到顯著水平。表明春化不完全的植株結實能力受其春化程度的影響較大，完全春化植株結實能力主要取決于品種特性。

2.4 白菜型冬油菜不同感溫性品種表型特征與春化率的相關性分析

不同感溫性白菜型冬油菜低溫春化處理后，其春化率與平均初花株高、平均成熟株高、相對株高、一次分枝數(shù)、單株角果數(shù)、角果長度、角果粒數(shù)、單株產量呈極顯著正相關（P＜0.01）；表明低溫春化處理的白菜型冬油菜萌動種子春化程度，與之后其所形成植株的生長發(fā)育、結實能力等密切相關；且各表型性狀之間也呈極顯著正相關（P＜0.01），表明春化率能夠顯著的影響表型特征（表5）。其中，春化率與初花期和成熟期株高的相關系數(shù)最大，分別為0.947和0.985，說明春化率與株高關聯(lián)密切；單株產量與單株角果數(shù)、角果長度、角果粒數(shù)相關系數(shù)達0.980，說明單株產量受單株角果數(shù)、角果長度、角果粒數(shù)影響。

2.5 春化處理對白菜型冬油菜萌發(fā)幼苗硝酸還原酶活性的影響

隨春化處理時間的增加，白菜型冬油菜硝酸還原酶活性總體呈降低趨勢（圖2）。低溫春化處理20 d，隴油7號、隴油9號和天油4號NR活性顯著升高，相比對照分別增加86.48%、51.98%、95.02%；之后隨低溫春化時間延長（30—50 d），各品種NR活性明顯下降，并與對照始終保持在同一水平；春化時間增至60 d時，各品種NR活性相比對照均顯著降低。

表4 不同春化時間對白菜型冬油菜結實性的影響Table 4 Effect of vernalization time on seed set of B.rapa

表5 不同冬性白菜型油菜春化率、表型特征之間的相關性Table 5 Correlation between vernalization rate and phenotypic traits of B.rapa

2.6 春化處理對白菜型冬油菜萌動種子抗氧化酶活性的影響

SOD可以清除植物體內積累的O2-，與POD、CAT共同作用生成H2O，減輕逆境對植物的傷害。隨低溫春化時間的延長，隴油7號、隴油9號、天油4號SOD活性呈先逐漸升高后降低的趨勢（圖3-a）；春化處理0 d（CK）時，供試品種SOD均處于較低水平，春化處理40 d時，各品種SOD活性達到最大值，與對照相比，分別增加53.6%、52.1%和41.8%，強冬性品種增加幅度高于冬性品種，說明強冬性品種對低溫春化處理的耐受性更強；春化處理至60 d時，天油4號SOD活性較隴油7號、隴油9號最低，春化處理時間過長導致天油4號O2-積累，萌動種子受害。

圖2 春化處理對白菜型冬油菜萌動種子硝酸還原酶活性的影響Fig.2 Effects of low temperature vernalization on nitrate reductase activity of B.rapa

隨低溫春化時間的延長，隴油7號、隴油9號、天油4號POD酶活性呈先逐漸增加后降低的趨勢（圖3-b）；春化處理0 d（CK）時，各品種POD均處于較低水平，春化處理40 d時POD活性達到最大值，相比對照分別增加110.02%、78.29%和100.2%，達顯著水平（P＜0.05），春化處理50—60 d，各品種POD酶活性下降趨勢明顯。POD活性與SOD活性變化一致。

隨春化時間的增加，各白菜型油菜CAT活性隨春化時間增加而逐漸下降（圖3-c）；在春化處理40 d時稍有波動，但整體呈下降趨勢，與對照相比，達顯著水平（P＜0.05）。MDA含量高低可反映細胞膜脂過氧化的水平和膜受傷害的程度[21]。隨低溫春化時間的增加，各白菜型冬油菜MDA 含量逐漸升高，春化處理后期稍有下降，但相比對照均增加顯著（圖3-d）；隴油7號MDA含量在春化處理50 d達到最大，相比對照增加52.12%，隴油9號和天油4號均在春化處理40 d達到最大值，相比對照分別增加81.98%和173.93%，達顯著水平（P＜0.05），MDA含量增量隴油7號＜隴油9號＜天油4號，說明天油4號對低溫春化處理更敏感。

2.7 低溫春化處理對白菜型冬油菜萌發(fā)幼苗滲透調節(jié)物質及質膜透性的影響

低溫春化過程中，隨春化時間的增加，白菜型冬油菜各品種SP、SS含量呈先增加后降低的趨勢（圖4-a）。隴油7號和隴油9號SP含量在春化處理30 d達到峰值，較對照分別增加24.65%和35.92%，春化處理中期SP含量達到相對平衡的狀態(tài)，60 d SP含量下降；天油4號在春化處理20 d達到峰值，較對照增加13.34%，40—60 d呈下降趨勢。

隴油7號萌動種子SS含量在春化處理30 d時達到峰值，之后呈波動變化（圖4-b），與對照相比，各處理時間SS含量升高，達顯著水平（P＜0.05）；隴油9號SS含量在春化處理20 d達到最大值，天油4號SS含量在春化處理30 d時達到最大，40—60 d時SS含量下降顯著。

圖3 春化處理對白菜型冬油菜萌動種子抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effect of low temperature vernalization on antioxidant enzyme activity of B.rapa

2.8 低溫春化處理對白菜型冬油菜萌發(fā)種子植物激素的影響

隨春化時間的增加，白菜型冬油菜不同感溫品種GA3含量的變化趨勢不同；低溫春化處理后，與對照相比，隴油7號、隴油9號萌動種子中GA3含量明顯下降；而天油4號萌動種子在春化處理20—30 d后GA3含量明顯升高，30 d時相比對照增加14.51%；隨后萌動種子中GA3含量有所下降（圖5-a）。

低溫春化處理白菜型冬油菜萌動種子后，與對照相比，不同感溫品種的IAA含量均有所增加。隴油7號春化處理后IAA含量相比對照增量基本一致；隴油9號和天油4號IAA含量呈逐漸升高后稍有下降的趨勢，在春化50 d 時IAA增幅最大，分別增加39.9%和197.0%（圖5-b）。

隨低溫春化時間的增加，白菜型冬油菜各品種萌動種子中ABA含量呈先增加后降低的趨勢，與對照相比，隴油7號的ABA含量在春化20 d達到最大，增加94.23%，之后逐漸下降；隴油9號、天油4號在春化40 d時ABA含量達到最大，分別增加34.87%和61.24%，之后迅速下降至對照水平（圖5-c）。

圖4 低溫春化處理對白菜型冬油菜萌動種子滲透調節(jié)物質及質膜透性的影響Fig.4 Effects of low temperature vernalization on osmotic adjustment substances and plasma membrane permeability of B.rapa

圖5 低溫春化處理對白菜型冬油菜萌動種子植物激素的影響Fig.5 Effects of low temperature vernalization on plant hormones of B.rapa

2.9 生理生化指標與春化率的相關性分析

采用相關分析計算各生理指標（NR、SOD、POD、CAT、MDA、SP、SS、GA3、IAA、ABA）與春化率的相關系數(shù)（表6），春化率與CAT呈極顯著負相關（P＜0.01），與MDA呈極顯著正相關（P＜0.01）。NR與SOD顯著正相關（P＜0.05），與SP呈極顯著正相關；SOD與POD、ABA呈顯著正相關，POD與MDA呈極顯著正相關，CAT與MDA呈極顯著負相關，SP與GA3呈顯著正相關。

表6 不同冬性白菜型油菜春化率、生理指標之間的相關性Table 6 Correlation between vernalization rate and physiological indexes of B.rapa

3 討論

3.1 白菜型冬油菜萌動種子低溫春化的表型特征

成花過程是植物發(fā)育的重要環(huán)節(jié)，是繁衍后代群體、維持種群穩(wěn)定的重要生存策略。多數(shù)溫帶植物都需感受一定時間的低溫，才可完成莖尖分生組織花芽的分化轉化，形成花芽原基實現(xiàn)開花結實的過程，稱為春化現(xiàn)象。一般而言，植物低溫春化對溫度的敏感期是種子萌動至幼苗發(fā)育的某一時期。依據(jù)低溫春化作用敏感時期，可將春化作用分為萌動種子春化型和綠體春化型[22]。萌動種子春化型植物在種子萌動期即可感受低溫，完成春化作用，若需要人工春化處理時，即可很方便的處理大量種子材料，這對具有感溫特性，特別是強冬性作物開展繁育加代、縮短育種周期非常有效。中國北方白菜型冬油菜屬于強冬性作物類型，本研究以3個不同感溫品種為材料，探討了萌動種子感受低溫春化的生理過程，及春化后植株表型發(fā)育特性，結果表明，白菜型冬油菜種子萌動期可以感受低溫春化作用，依據(jù)冬性強弱，通過春化作用所需的低溫時間不同，強冬性隴油7號、隴油9號、冬性品種天油4號完全通過（春化率＞95%）春化需要時間分別為76.9、54.0和39.4 d。隨春化處理時間的增加，隴油7號、天油4號、隴油9號初花株高、成熟期株高、一次分枝數(shù)、單株角果數(shù)、角果長度、角果粒數(shù)、單株產量逐漸增加，各指標與春化率極顯著相關，且各表型之間也極顯著相關，表明春化時長對株型、結實等表型有較大影響，這與楊國浪等的研究結果一致[23]。

3.2 白菜型冬油菜萌動種子低溫春化的生理生化特征

硝酸還原酶是一個對溫度敏感的誘導酶[24]。研究表明低溫誘導可使植物體內NR酶活性升高，不同感溫性白菜型冬油菜在春化處理過程中NR活性呈先升高后逐漸下降趨勢，這與以玉米為材料的研究結果一致[25]。逆境下植物大量積累活性氧等自由基，加劇膜脂過氧化從而導致膜系統(tǒng)受損。抗氧化酶系可有效清除這類自由基，改善胞內生理狀態(tài)，提升植物對逆境的適應能力。本研究中白菜型冬油菜萌動種子低溫春化處理初期SOD、POD活性均有顯著提高，這很可能是種子對春化低溫做出的應激反應；同時，種子內MDA含量呈升高的趨勢，表明在低溫逆境下種子胞內氧自由基產生量，超過抗氧化酶的清除能力，積累活性氧等自由基氧化攻擊膜脂等還原物質，其產物MDA在胞內積累，導致膜系統(tǒng)受損。低溫春化40 d時，SOD和POD活性出現(xiàn)峰值，之后酶活性均有所降低，可能是由于在春化過程中，低溫明顯抑制了萌動種子代謝活動，其胞內SOD和POD等抗氧化酶系活性隨之下降，這與閆利恒等[26]的研究一致。在低溫春化期間，CAT活性呈逐漸降低的趨勢，這與KAR等[27]、李琦瑤等[28]研究結果吻合。

滲透調節(jié)物質能增加細胞質濃度，降低滲透勢，維持細胞膨壓，有利于保持水分和細胞各種生理過程的正常進行[29]。SP、SS等物質在穩(wěn)定細胞內生物大分子結構等方面具有重要作用。本研究結果表明，在春化過程中SP和SS含量呈先升高后降低的趨勢，處理初期（20—30 d），其萌動種子SP和SS含量比對照明顯升高；春化處理中期（40—60 d），其含量明顯下降；表明長時間的低溫春化使萌動種子滲透調節(jié)能力減弱；與菜用豌豆和花生的研究結果一致[30-31]。

激素是植物通過次生代謝途徑產生的，并能從產生部位轉運至作用部位，在低濃度下就具有明顯生物學效應的內源微量物質。GA3是最早被認為是植物春化激素，在低溫條件下GA3、ABA等激素含量增加[32]。冬油菜萌動種子低溫春化處理后，內源激素水平發(fā)生顯著變化，隨春化時間延長，隴油7號和隴油9號GA3含量呈下降趨勢；春化30 d，天油4號GA3含量顯著增加，其他處理GA3含量與對照在同一水平。IAA含量略微升高，但變化不顯著；ABA含量升高，且強冬性隴油7號ABA含量明顯高于隴油9號和天油4號，這與周碧燕等[33]和王興等[34]研究結果基本一致。ABA被認為是一種逆境激素，在春化處理過程中，萌動種子ABA含量變化幅度較大，這可能與ABA在抵御冷脅迫發(fā)面發(fā)揮的作用有關。GA3被認為在在冬性植物春化過程中發(fā)揮正調控作用，本研究結果顯示，冬油菜萌動種子春化過程中GA3含量明顯下降，表明GA3在萌動種子春化過程中可能并未發(fā)揮調控作用，萌動種子春化途徑是否有別于綠體春化途徑，值得進一步研究。

4 結論

白菜型冬油菜萌動種子可感受環(huán)境低溫完成春化作用，冬性越強，完成春化所需的低溫（4℃）時間越長。隴油7號萌動種子完成春化（春化率＞95%）需低溫處理76.9 d，隴油9號、天油4號分別為54.0和39.4 d。低溫春化過程中，白菜型冬油菜萌動種子生理狀態(tài)變化與其春化程度密切相關，并顯著影響其后植株生長發(fā)育與結實性能。低溫春化處理萌動種子可用于白菜型冬油菜的加代繁育等育種實踐工作。