劉廣建 鄭惠華 蔣 益 桑 花 薛 璟 季宏更 張 蕾

（1江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇無錫214063；2江蘇安惠生物科技有限公司，江蘇南通226009）

猴頭菇是一種營養(yǎng)價值極高的食用藥用真菌，含有豐富的多糖、多肽、萜類、甾醇類等活性成分，具有抗腫瘤，降血糖，降血脂等諸多功效?，F代研究表明猴頭菇活性蛋白具有免疫調節(jié)作用，活性肽則有抗氧化功效。猴頭菇的多肽組合物可以改善老年癡呆小鼠的學習能力。Chen Diling等采用化學分離結合藥效學評估方法，從猴頭菇中分離單帶蛋白（HEP3）。該蛋白通過調節(jié)腸道微生物群落的組成和代謝來改善免疫系統(tǒng)，激活T細胞的增殖和分化。輔助試驗還表明，HEP3可作為腫瘤負荷小鼠的抗腫瘤免疫抑制劑。近些年來隨著人們養(yǎng)生意識的提高，猴頭菇也因此成了國內外極力追捧的明星級食藥用菌。試驗以猴頭菇菌絲體為原料，對菌絲體蛋白的多種提取工藝進行優(yōu)化，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法測定其分子量分布，為猴頭菇菌絲體蛋白和多肽的進一步研究和開發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

猴頭菇菌絲體由液體發(fā)酵所得，經測定蛋白質含量35.2%；考馬斯亮藍G250、R250（分析純）、牛血清蛋白（分析純）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、N，N，N，N-四甲基乙二胺（TEMED）、木瓜蛋白酶（為國藥集團化學試劑有限公司生產）；蛋白質marker（8～180 kD）、SephadexG-100（為常州天地人和生物科技有限公司生產）；其余試劑均為市售分析純。

儀器設備：Alpha-1500型紫外可見分光光度計（上海譜元儀器有限公司生產）；JY98-111DN型超聲波細胞粉碎機（寧波新藝超聲設備有限公司生產）。

1.2 試驗設計

1.2.1 堿提酸沉法提取猴頭菇菌絲蛋白最佳工藝條件的確定

在單因素試驗基礎上，堿提酸沉法以pH、料液比、溫度、時間為試驗因素。采用4因素3水平L9（34）正交試驗，確定最佳菌絲體蛋白提取工藝條件。因素水平見表1。

表1 堿提酸沉法提取菌絲蛋白質正交試驗因素水平

1.2.2 酶法提取猴頭菇菌絲體蛋白最佳工藝條件的確定

在單因素試驗基礎上，酶法提取以加酶量、料液比、溫度、時間為試驗因素。采用4因素3水平L9（34）正交試驗，確定最佳提取工藝條件。因素水平見表2。

1.2.3 超聲波提取猴頭菇菌絲體蛋白最佳工藝條件的確定

采用超聲波輔助浸提的方法，在超聲功率、超聲時間和超聲溫度單因素試驗的基礎上，采用Box-Benhnken方法設計三因素三水平試驗，以蛋白提取率為響應值，進行響應面分析得到優(yōu)化組合條件。試驗數據采用Excel進行整理和繪圖，Design-Expert 8.0統(tǒng)計分析軟件進行多元二次回歸模型方程的建立及方差分析，運用該軟件中響應面值優(yōu)化程序求得當響應面值最大時各因素的最佳組合。響應面試驗因素水平見表3。

表2 酶法提取猴頭菇菌絲體蛋白正交試驗因素水平

表3 超聲波提取菌絲體蛋白響應面分析試驗因素水平

1.3 試驗方法

1.3.1 牛血清蛋白標準曲線的繪制

考馬斯亮藍比色法。精確稱取10 mg牛血清蛋白標準品，加入100 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解后定容，得到0.1 mg/mL的牛血清蛋白標準液。分別取標準液0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL于10 mL具塞試管中，加蒸餾水至1 mL，再分別向試管中加入配制好的考馬斯亮藍G250溶液5 mL，搖勻，避光反應5～10 min后，在波長595 nm處測定其吸光度值，繪制牛血清蛋白標準曲線。

圖1牛血清蛋白標準曲線

1.3.2 猴頭菇菌絲體蛋白等電點確定

蛋白質堿提酸沉方法，取等量的堿提離心液調pH至不同值，離心所得上清液采用考馬斯亮藍比色法測定其吸光度值，吸光度值最低點的pH就為等電點pI值。

1.3.3 猴頭菇菌絲體蛋白提取

將猴頭菇菌絲體于65℃烘干粉碎后過100目篩，備用。稱取猴頭菇菌絲體粉，在一定條件下浸提，6000 r/min離心15 min，取上清液，用0.1 moL/L的鹽酸調pH至等電點，靜置1 h，8000 r/min離心15 min，得蛋白質沉淀，加一定量蒸餾水溶解蛋白質，然后用0.01 moL/L的NaOH溶液中和至pH7.0，冷凍干燥，得猴頭菇菌絲體蛋白。

1.3.4 蛋白質的純化及測定

SephadexG-100凝膠柱純化菌絲體蛋白質；參照GB5497—1985，用凱氏定氮法測定蛋白質含量；SDS-PAGE測猴頭菇菌絲體蛋白分子量。

2 結果與分析

2.1 等電點確定

由圖2可知，猴頭菇菌絲體蛋白的等電點pI值為3.05。

圖2 等電點的確定

2.2 猴頭菇菌絲體蛋白提取工藝條件確定

2.2.1 堿提酸沉法提取猴頭菇菌絲體蛋白最佳條件的確定

正交試驗結果見表4。由表4可知，極差分析，RA＞RD＞RC＞RB，可見影響菌絲體蛋白提取效果的因素依次為：A＞D＞C＞B，即料液比＞時間＞溫度＞pH。方差分析結果表明，溫度、pH、料液比、提取時間四因素中pH對提取率影響弱。提取蛋白質的最佳條件為 A3B3C2D1，即料液比 1∶25，pH10.5，提取 時 間1.5 h，溫度25℃。經驗證試驗，該條件提取猴頭菇菌絲體蛋白，提取率為22.75%，確為最優(yōu)組合。

2.2.2 酶法提取猴頭菇菌絲體蛋白最佳條件的確定

正交試驗結果見表5。由極差分析可知，4個因素極差大小順序為：RD＞RA＞RC＞RB，即影響酶法提取工藝的最主要因素是溫度，料液比次之。方差分析結果表明，溫度、料液比對提取率影響極顯著，酶用量影響較小。最佳提取條件為A3B3C2D1，即料液比為1∶25，1%的木瓜蛋白酶酶液0.3 mL，溫度為25℃，提取時間為1.5 h。經驗證試驗，該提取條件提取猴頭菇菌絲體蛋白的提取率為21.04%，確為最優(yōu)組合。

表4 堿提酸沉法提取猴頭菇菌絲體蛋白正交試驗結果

表5 酶法提取猴頭菇菌絲體蛋白正交試驗結果

2.2.3 超聲波提取猴頭菇菌絲體蛋白最佳工藝條件的確定

在單因素試驗結果的基礎上，根據Box-Benhnken設計原理，以超聲功率、超聲時間、超聲溫度3個因素為自變量，以猴頭菇菌絲體蛋白提取率為響應值，采用響應面法進行三因素三水平的試驗設計，共包括17組試驗方案，試驗設計方案及結果見表6。

表6 響應面試驗設計及結果

模型建立與方差分析：利用設計軟件Design-Expert對表6數據進行多元回歸擬合，獲得超聲時間（A）、超聲溫度（B）、超聲功率（C）的二次多項回歸方程為：

Y=23.09-5.46A+2.75B+1.48C+0.15AB-0.14AC+0.24BC-3.31A2-1.52B2-1.14C2，此回歸模型方程的ANOVA分析結果見表7。

表7 響應面試驗回歸模型方差分析

圖3 各兩因素交互作用對猴頭菇蛋白提取影響的響應面圖及等高線圖

由表7結果可見：擬合方程具有較高的F值（F=12.55）和非常低的P值（P=0.0015），說明回歸方程達到比較顯著的水平（P=0.0015，R2=0.9417）；失擬項的P=0.1156＞0.05，試驗數據與模型預測數據差異不顯著，表明該擬合方程與實際擬合較好。試驗結果相關系數模型的決定系數R2為0.9417，表明猴頭菇菌絲體蛋白提取率的試驗值與預測值由較好的一致性，調整決定系數R2Adj為0.8667，說明該模型能解釋86.67%響應值的變化，有約總變異13.33%的不能由回歸模型來解釋。綜上所述，該二次回歸模型擬合程度好，試驗誤差較小，該模型方程可對猴頭菇菌絲體蛋白提取條件進行預測和分析。

由F值可以看出，3個因素對猴頭菇菌絲體蛋白質提取率影響程度依次為超聲時間（A）＞超聲溫度（B）＞超聲功率（C）；由響應面模型分析得出最佳的提取參數為提取時間21.8 min、溫度34.6℃、微波功率758.6 W，提取率為27.3%。

響應面分析：根據回歸模型，由Design-Expert 8.0.6軟件繪制響應面分析圖和等高線圖（圖3）。從響應面分析圖中可以看出各因素交互作用對猴頭菇菌絲體蛋白質提取率的影響：對提取率影響越大的因素，其曲線走勢會相對越陡；在等高線圖中，各因素對猴頭菇菌絲體蛋白提取率的影響體現在其軸向等高線的密集程度上，軸向等高線越密集，說明該因素對猴頭菇菌絲體蛋白提取率的影響越顯著。通過比較圖3中響應面分析圖和等高線圖可以看出：超聲時間（A）與超聲溫度（B）兩因素之間的交互作用對猴頭菇菌絲體蛋白提取率的影響較為顯著，而其他因素兩兩之間的交互作用對提取率的影響較小。

2.3 猴頭菇菌絲體蛋白質含量及其分子量的測定

經凱氏定氮法測得猴頭菇菌絲體中蛋白質含量為35.2%，提取所得猴頭菇菌絲體粗蛋白中蛋白質含量為59.53%，通過SephadexG-100凝膠過柱純化后，蛋白質含量為81.35%（過柱純化后蛋白質得率太低僅為10%，主要為水溶性蛋白）。

樣品蛋白質用10%濃度的分離膠，SDS-PAGE分析蛋白亞基分子質量，結果見圖2。主要蛋白質分子量為：過柱純化后樣品蛋白質57 kD和35 kD（過柱用蒸餾水洗脫，主要為水溶性蛋白，蛋白濃度在0.2 mg/mL，條帶色淺）；堿液復溶后的樣品蛋白質主要有8個條帶在90～24 kD（樣品緩沖液加20%SDS才能跑出，蛋白濃度3 mg/mL，樣品沒純化）。

圖4 猴頭菇菌絲體蛋白質SDS-PAGE分析

3 小結與討論

猴頭菇菌絲體蛋白的等電點為pH 3.05。生產中可以在等電點附近沉淀蛋白質，這樣就不會因為pH過低而造成蛋白質變性，如本試驗以pH4進行猴頭菇菌絲體蛋白沉淀，菌絲體蛋白的得率與等電點沉淀蛋白的得率變化不大，而且猴頭菇菌絲體蛋白保持較強的活性。

猴頭菇菌絲體蛋白提取試驗結果表明，堿提酸沉法提取蛋白質最佳條件為：料液比1∶25，pH 10.5，時間1.5 h，溫度25℃，提取率為22.75%；酶法提取蛋白質最佳條件為：料液比為1∶25，1%木瓜蛋白酶酶液0.3 mL，溫度為25℃，提取時間為1.5 h，提取率為21.04%。堿提酸沉法優(yōu)于酶法提取。在堿提酸沉法和酶法提取的基礎上，確定pH10.5、料液比為1∶25，超聲波提取蛋白質，運用響應面研究分析得出最佳提取條件：提取時間21.8 min，溫度34.6℃，微波功率758.6 W，提取率為27.3%。超聲波提取法比堿提酸沉法，提取率提高了20%以上。

用凝膠柱純化猴頭菇菌絲蛋白，雖提高了蛋白質純度，但也損失了大量的不溶性蛋白質（得率在10%左右），因此還要加強蛋白質溶解性方面以及蛋白質純化方法的研究。

經SDS-PAGE分析猴頭菇菌絲體蛋白亞基分子質量分析，猴頭菇菌絲體蛋白分子量為24～90 kD。

試驗表明，超聲波提取方法提取猴頭菇菌絲體蛋白操作簡便，提取效果好，可用于工業(yè)化生產。