曹有芳，徐俊南，劉 丹，樊明濤

（西北農(nóng)林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

蘋果酒含有豐富的維生素、氨基酸、礦物質(zhì)及多酚等活性物質(zhì)，是世界上僅次于葡萄酒的第二大發(fā)酵果酒，具有軟化血管、降血脂、降血壓、調(diào)節(jié)新陳代謝、抗衰老和抗癌等作用，深受消費者喜愛[1-2]。就目前蘋果酒發(fā)酵技術(shù)的研究深度和發(fā)展程度而言，因蘋果原料和發(fā)酵工藝等不同，直接導致了蘋果酒品質(zhì)的差異性。而目前單純利用感官評定方法評價蘋果酒的品質(zhì)往往不夠客觀，因此尋找一種快速、靈敏的檢測方法尤為重要。電子鼻和電子舌由化學傳感器和模式識別系統(tǒng)構(gòu)成，能根據(jù)樣品的響應信號得到樣品的綜合評價信息，可以對不同樣品的揮發(fā)性物質(zhì)和滋味信息進行對比分析，還可以通過采集標樣信息建立數(shù)據(jù)庫，利用化學計量學方法對未知樣品進行定性和定量分析[3-4]。

目前，電子鼻和電子舌已經(jīng)廣泛應用于白酒、葡萄酒、黃酒及啤酒的品牌區(qū)分[5-6]、風味分析[7-8]、香型分析[9]、產(chǎn)地辨別[10-11]、品種辨別[12-13]、酒齡辨別[14-16]、真?zhèn)舞b別[17]以及發(fā)酵過程中的動態(tài)監(jiān)測[18]等方面，而通過電子鼻和電子舌與多變量數(shù)據(jù)分析區(qū)分不同蘋果酒的研究鮮有報道。電子鼻和電子舌傳感器的響應值與樣品種類、質(zhì)量、狀態(tài)、溫度及環(huán)境等因素都有很大聯(lián)系。因此，在電子鼻和電子舌檢測樣品前，進行實驗參數(shù)的優(yōu)化很有必要[4，19-22]。本試驗采用不同產(chǎn)地相同蘋果品種共3種蘋果進行蘋果酒的釀造，以蘋果酒為研究對象，考察樣品稀釋倍數(shù)、頂空進樣體積、頂空生成時間和載氣流速4個實驗參數(shù)對電子鼻傳感器響應信號的影響，同時考察樣品稀釋倍數(shù)對電子舌傳感器響應信號的影響，利用模式識別和統(tǒng)計學方法優(yōu)化確立較佳實驗參數(shù)。在最佳參數(shù)條件下，用電子鼻和電子舌對蘋果酒進行區(qū)分和風味評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長富二號蘋果（分別采于陜西白水蘋果試驗站，山東煙臺，甘肅慶陽試驗站），共3種實驗樣品；安琪果酒專用酵母SY：安琪酵母股份有限公司；Macerozyme R-10果膠酶（酶活40 U/mg）：北京索萊寶科技有限公司。氯化鈉（純度≥99.5%）：四川西隴科學有限公司；2-辛醇（純度≥98%）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

2000JP榨汁機：南通金橙機械有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；PEN3型便攜式電子鼻：德國Airsense公司；電子鼻10個金屬氧化物傳感器的敏感物質(zhì)類型見表1；Astree 電子舌系統(tǒng)：法國Alphamos公司；電子舌各個傳感器的檢測閾值見表2。

表1 PEN3電子鼻傳感器陣列及其對應的敏感物質(zhì)類型Table 1 Electronic nose sensor PEN3 array and its corresponding sensitive material types

表2 電子舌各個傳感器的檢測閾值Table 2 Detection thresholds of each sensor of electronic tongue

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

操作要點：選擇成熟度好，無腐爛變質(zhì)的蘋果，進行清洗、榨汁，將得到的蘋果清汁倒入經(jīng)SO2熏蒸過的發(fā)酵罐，并加入60 mg/L SO2。按50 mg/L的量添加果膠酶室溫酶解12 h后，加入安琪果酒專用酵母SY于20 ℃條件下發(fā)酵7 d，所有蘋果酒的發(fā)酵工藝相同。取發(fā)酵結(jié)束的新鮮酒樣，離心冷凍置-20 ℃冰箱內(nèi)待用。

1.3.2 電子鼻檢測

受樣品稀釋倍數(shù)、頂空進樣體積、頂空生成時間和載氣流速4個因素的影響，頂空氣體的濃度直接影響傳感器響應值。采用表3設計的因素水平，研究樣品稀釋倍數(shù)、頂空進樣體積、頂空生成時間和載氣流速對電子鼻各傳感器響應值的影響，每組9個平行。

電子鼻測試條件：電子鼻開機后先預熱0.5 h左右，將稀釋的蘋果酒樣品置于30 mL的頂空瓶中，封蓋富集進行測試。測試步驟：將補氣針和進樣針同時插入頂空瓶中，采樣60 s 后，同時拔出進樣針和補氣針，讓系統(tǒng)進行清洗（清洗時間為300 s）和標準化過程，其后可繼續(xù)測試樣品。

表3 單因素試驗因素與水平Table 3 Factors and levels of single factor experiments

1.3.3 電子舌檢測

電子舌傳感器的響應值受樣品稀釋倍數(shù)的影響，本研究將樣品分別稀釋10、15、20、25、30倍，研究樣品稀釋倍數(shù)對電子舌傳感器響應值的影響，每組3個平行。

電子舌開機后依次進行Conditioning-Calibration-Diagnose 步驟，系統(tǒng)通過校正后，進行測試。將蘋果酒樣離心、過濾除去雜質(zhì)，再經(jīng)10倍稀釋后，取85 mL于電子舌專用燒杯中進行檢測。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）及顯著性分析，顯著水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗方差分析

提取各傳感器15 s和50 s的響應值，對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，結(jié)果如表4和表5所示。

表4 傳感器15 s的數(shù)據(jù)單因素試驗方差分析Table 4 Variance analysis of sensors 15 s data by single factor experiments

表5 傳感器50 s的數(shù)據(jù)單因素試驗方差分析Table 5 Variance analysis of sensors 50 s data by single factor experiments

2.2 電子鼻最佳檢測條件的確定

2.2.1 稀釋倍數(shù)對電子鼻傳感器響應值的影響

取頂空進樣體積5 mL、頂空生成時間5 min和載氣流速300 mL/min，研究不同樣品稀釋倍數(shù)（20、30、40、50、60）對電子鼻傳感器響應信號的影響。對各傳感器達到響應信號峰值時刻（15 s）的數(shù)據(jù)進行分析，由表4可看出，樣品稀釋倍數(shù)對10個傳感器均有顯著影響（P＜0.05）；由表5中電子鼻傳感器50 s響應值的方差分析結(jié)果可看出，當頂空氣體達到平衡穩(wěn)定后，樣品稀釋倍數(shù)對10個傳感器也均有顯著影響（P＜0.05）。

由圖1可看出，PCA分析結(jié)果中第一主成分占比99.23%，第二主成分占比0.60%，前兩個主成分總貢獻率占比99.83%，能充分代表原始數(shù)據(jù)信息。樣品稀釋倍數(shù)隨第一主成分減小方向逐漸減小，隨第二主成分增加的方向先減小后增加。不同稀釋倍數(shù)的樣品完全可以區(qū)分開，其中稀釋30倍的樣品聚集效果較好，類內(nèi)離差較小，因此選取30倍為樣品最佳稀釋倍數(shù)。

圖1 不同樣品稀釋倍數(shù)條件下電子鼻數(shù)據(jù)主成分分析圖Fig.1 PCA results of electronic-nose responding data with different sample diluted multiples

2.2.2 頂空進樣體積對電子鼻傳感器響應值的影響

取頂空生成時間5 min、載氣流速300 mL/min，將樣品稀釋30倍，研究頂空進樣體積（2.5 mL、5.0 mL、7.5 mL、10.0 mL、12.5 mL）對電子鼻傳感器響應信號的影響。對各傳感器達到響應信號峰值時刻15 s的數(shù)據(jù)進行分析，由表4可看出，除S4和S7傳感器外，頂空進樣體積對其他8個傳感器的響應值均有顯著影響（P＜0.05）；由表5中電子鼻傳感器50 s時的響應值方差分析結(jié)果可看出，當頂空氣體達到平衡穩(wěn)定后，頂空進樣體積對10個傳感器均有顯著影響（P＜0.05）。

圖2 不同頂空進樣體積條件下電子鼻數(shù)據(jù)主成分分析圖Fig.2 PCA results of electronic nose responding data with different headspace sampling volume

由圖2可看出，PCA分析結(jié)果中第一主成分占比91.82%，第二主成分占比5.56%，前兩個主成分總貢獻率占比97.38%，能充分的代表原始數(shù)據(jù)信息。頂空進樣體積隨第一主成分增加的方向先增加后減小，隨第二主成分增加的方向先減小后增加。此外，不同頂空進樣體積的樣品完全可以區(qū)分開，其中5.0 mL的樣品數(shù)據(jù)點聚集性較好，類內(nèi)離差較小，因此選取5.0 mL為最佳頂空進樣體積。

2.2.3 頂空生成時間對電子鼻傳感器響應值的影響

將樣品稀釋30倍，取進樣體積5.0 mL、載氣流速300 mL/min，研究頂空生成時間（5 min、10 min、15 min、20 min、25 min）對電子鼻傳感器響應信號的影響。對各傳感器達到響應信號峰值的時刻15 s進行分析，由表4可看出，頂空生成時間對10個傳感器均有顯著影響（P＜0.05）；當頂空氣體達到平衡穩(wěn)定后，由表5中電子鼻傳感器50 s響應值的方差分析結(jié)果可看出，頂空生成時間對10個傳感器均有顯著影響（P＜0.05）。

圖3 不同頂空生成時間條件下電子鼻數(shù)據(jù)主成分分析圖Fig.3 PCA results of electronic nose responding data with different headspace-generated time

由圖3可看出，PCA分析結(jié)果中第一主成分占比78.89%，第二主成分占比18.63%，前兩個主成分總貢獻率占比97.52%，能充分的代表原始數(shù)據(jù)信息；且不同頂空生成時間的樣品基本可以區(qū)分開，其中20 min的樣品分布較為離散，聚集性差，20 min的樣品和15 min及10 min的樣品均有重疊，難以區(qū)分。頂空生成時間隨第一主成分減小的方向逐漸減小，隨第二主成分增加的方向先減小后增加。頂空生成時間為5 min和25 min時的樣品能與其他樣品區(qū)分開，但5 min時的數(shù)據(jù)點聚集效果較好，類內(nèi)離差較小，因此選取5 min為最佳頂空生成時間。

2.2.4 載氣流速對電子鼻傳感器響應值的影響

將樣品稀釋30倍，取進樣體積5.0 mL、頂空生成時間5 min，研究載氣流速（200 mL/min、250 mL/min、300 mL/min、350 mL/min、400 mL/min）對電子鼻傳感器響應信號的影響。對各傳感器達到響應信號峰值的時刻15 s進行分析，由表4可以看出，載氣流速對10個傳感器均有顯著影響（P＜0.05）；當頂空氣體達到平衡穩(wěn)定后，由表5中電子鼻傳感器50 s響應值的方差分析結(jié)果可看出，載氣流速對S4、S7、S10影響不顯著（P＞0.05），對其他所有傳感器均有顯著影響（P＜0.05）。

由圖4可看出，PCA分析結(jié)果中第一主成分占比89.70%，第二主成分占比7.39%，前兩個主成分總貢獻率占比97.09%，能充分的代表原始數(shù)據(jù)信息。載氣流速隨第一主成分增加的方向先增加后減小。不同載氣流速的樣品基本可以區(qū)分開，其中200 mL/min、250 mL/min、400 mL/min有重疊，難以區(qū)分，300 mL/min既可以與其他數(shù)據(jù)區(qū)分，且聚集性較好，類內(nèi)離差較小，因此選取300 mL/min為最佳載氣流速。

圖4 不同載氣流速條件下電子鼻數(shù)據(jù)主成分分析圖Fig.4 PCA results of electronic nose responding data with different flow rate of carrier gas

2.3 電子鼻定性識別不同蘋果酒

采用優(yōu)化后的試驗參數(shù)對陜長富、魯長富、甘長富3種蘋果酒進行檢測分析，由圖5可知，PCA分析結(jié)果中第一主成分占比99.52%，第二主成分占比0.31%，前兩個主成分總貢獻率占比99.83%，能充分的代表原始數(shù)據(jù)信息。在此參數(shù)下，不同產(chǎn)地相同品種的蘋果酒可得到有效的區(qū)分。

圖5 不同蘋果酒的電子鼻數(shù)據(jù)主成分分析圖Fig.5 PCA results of electronic nose responding data with different varieties of apple wine

圖6為不同蘋果酒的香氣雷達圖，由圖6可知，W5S、W1S、W1W和W2S傳感器的響應最明顯，而其余6根傳感器無明顯變化。同時可根據(jù)傳感器響應信號強度的不同，直觀地判斷出3種蘋果酒樣品之間的風味物質(zhì)基本相同，只是濃度大小有差異。結(jié)合表1和相關(guān)文獻[23]可知，W1W傳感器對硫化合物（如H2S）比較靈敏，對萜烯類以及有機硫化物也很敏感；W1S傳感器對甲基類香氣比較靈敏；W2S是對醇類香氣比較敏感的傳感器。因此可初步判斷，不同蘋果酒風味不同可能是因為酒中的氮氧化物、萜烯類物質(zhì)、醇類物質(zhì)及部分芳香族化合物含量有所差異。

圖6 電子鼻傳感器響應值的雷達圖Fig.6 Radar graph for response values of electronic nose sensors

2.4 電子舌最佳檢測條件的確定

采用電子舌技術(shù)，考察5種樣品稀釋倍數(shù)（10、15、20、25、30）對電子舌傳感器響應信號數(shù)據(jù)的影響，結(jié)果見圖7。由圖7可以看出，基于主成分分析法，分析結(jié)果第一主成分占比89.34%，第二主成分占比9.69%，這兩個主成分的總貢獻率為99.03%，電子舌能夠準確區(qū)分識別出不同稀釋倍數(shù)的蘋果酒，其中稀釋30倍的樣品聚集效果較好，類內(nèi)離差較小，因此選取30倍為樣品最佳稀釋倍數(shù)。

圖7 不同樣品稀釋倍數(shù)條件下電子舌數(shù)據(jù)主成分分析圖Fig.7 PCA results of electronic tongue responding data with different sample diluted multiples

2.5 電子舌定性識別不同蘋果酒

采用優(yōu)化后的試驗參數(shù)對陜長富、魯長富、甘長富3種蘋果酒進行檢測分析，由圖8可知，PCA結(jié)果中第一主成分占比98.24%，第二主成分占比1.07%，前兩個主成分總貢獻率占比99.31%，不同蘋果酒可以得到有效區(qū)分，表明3種蘋果酒的風味特征存在明顯差異。

對于不同蘋果酒樣間電子舌傳感器響應值的差異，圖9的雷達圖可以看得更清晰明了。其中不同酒樣間JB、GA、BB 傳感器響應值差別不大，而陜長富和魯長富的HA和JE傳感器響應值明顯小于甘長富，JE和HA傳感器是對酸味相當敏感的傳感器，說明陜長富和魯長富的酸味弱于甘長富；同時，陜長富和甘長富的CA和ZZ傳感器響應值明顯大于甘長富，CA和ZZ傳感器是對酸味和甜味相當敏感的傳感器，說明陜長富和甘長富的甜味強于甘長富。

圖8 不同蘋果酒的電子舌數(shù)據(jù)主成分分析圖Fig.8 PCA results of electronic tongue responding data with different varieties of apple wine

圖9 電子舌傳感器響應值的雷達圖Fig.9 Radar graph for response values of electronic tongue sensors

3 結(jié)論

本研究采用金屬氧化物傳感器陣列的電子鼻技術(shù)區(qū)分識別了不同的蘋果酒，采用單因素試驗研究了樣品稀釋倍數(shù)、頂空進樣體積、頂空生成時間和載氣流速4個因素對電子鼻響應值的影響，通過方差分析和主成分分析獲得了最佳檢測參數(shù)：樣品稀釋倍數(shù)30倍、頂空進樣體積5.0 mL、頂空生成時間5 min、載氣流速300 mL/min。研究了樣品稀釋倍數(shù)對電子舌傳感器的影響，結(jié)合主成分分析獲得了電子舌檢測蘋果酒樣品的最佳稀釋倍數(shù)為30倍。利用優(yōu)化后的參數(shù)，電子鼻和電子舌均能很好的區(qū)分陜長富、甘長富、魯長富三種蘋果酒，二者結(jié)合能夠用于果酒風味的快速評價。