蔡鳳嬌，蔣燕明，宋慶迎，汪江波

（湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068）

葛根（Pueraria lobata）是豆科植物野葛和甘葛藤羅的塊根，是中國南方一些省份的常用食材，主要產(chǎn)于湖北、廣西、廣東、江西等地區(qū)。葛根富含淀粉，含有人體必需的8種氨基酸和鐵、鈣、鋅、鍺等礦物質(zhì)元素[1-3]。黃酮類化合物具有清除自由基、擴(kuò)張血管、降低血壓和防止動脈硬化、改善血液循環(huán)、避免細(xì)胞低氧傷害的功能，有解酒功效[4]。酸乳是經(jīng)乳酸菌在一定條件下發(fā)酵而成的有活性微生物的有益飲品，也是一種微生態(tài)調(diào)節(jié)劑，可恢復(fù)腸道微生態(tài)環(huán)境[5-8]。酒精代謝容易導(dǎo)致人體內(nèi)的代謝紊亂，而酸乳中含有的大量的氨基酸可以幫助其進(jìn)行調(diào)節(jié)，酸乳被大量應(yīng)用在食品中[9-12]。葛根酸乳的研發(fā)不僅能得到一種營養(yǎng)價(jià)值豐富的乳飲品，還為葛根的深度開發(fā)利用提供了一種新途徑，同時(shí)在飲品中添加酸乳是目前的發(fā)展趨勢[13-14]。黃誠等[15]對葛根原料護(hù)色處理，復(fù)合穩(wěn)定劑配比，加工過程進(jìn)行單因素分析，并結(jié)合感官評定得到一種優(yōu)化葛根酸乳。馬靜等[16]總結(jié)了發(fā)酵溫度、pH值、發(fā)酵時(shí)間等因素對乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）產(chǎn)量的影響，但是沒有將其應(yīng)用在葛根發(fā)酵乳中。本試驗(yàn)以試驗(yàn)室篩選的一株高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌為發(fā)酵菌株，以總黃酮含量和乳酸菌胞外多糖含量為評價(jià)指標(biāo)來優(yōu)化葛根發(fā)酵乳工藝，以期得到一種營養(yǎng)價(jià)值豐富的葛根發(fā)酵乳。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵菌株：湖北工業(yè)大學(xué)釀酒研究所從酸奶中篩選的產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌。菌種鑒定為德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus，L.b）和唾液鏈球菌嗜熱亞種（Streptococcus salivariussubsp.thermophilus，S.t）。

酸奶：市售；脫脂奶粉：內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)股份有限公司；葛根：產(chǎn)于湖北荊門（超市購買）；蘆?。好绹鳤cros Organic公司；石油醚、NaOH、Al（NO3）3、Al2（SO4）3、Na2NO2、K2HPO4、檸檬酸二銨、乙酸鈉、葡萄糖、吐溫-80、MgSO4·7H2O、MnSO4（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。耐高溫α-淀粉酶（20 000 U/g）、糖化酶（100 000 U/g）：山東蘇柯漢生物工程股份有限公司。

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，K2HPO42 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.5 g，MnSO40.25 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2～6.4。

1.2 儀器與設(shè)備

DRP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海森信試驗(yàn)儀器有限公司；JMR-117型pH計(jì)：北京菁美瑞科技有限公司；XSP-9CA型光學(xué)顯微鏡：上海光學(xué)儀器廠；L8（762）紫外分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；GJB100-120三柱塞均質(zhì)機(jī)：常州地利人和均質(zhì)機(jī)有限公司；BPP-7800 pH計(jì)：貝爾分析儀器（大連）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 葛根發(fā)酵乳工藝流程及操作要點(diǎn)

將葛根洗干凈，去皮切塊，加蒸餾水打漿使葛根質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，過濾，加10 U/g葛根質(zhì)量的淀粉酶85～90 ℃糊化2h，冷卻至60～65℃加200U/g葛根質(zhì)量的糖化酶糖化2h。

脫脂乳過濾、均質(zhì)，殺菌、冷卻到35 ℃以下后與葛根糖化液按一定比例混合。

添加葡萄糖，調(diào)整脫脂乳、葛根糖化液混合物初始pH值為5.7～6.9，121 ℃滅菌15 min。

將菌種接種到MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下培養(yǎng)48 h。按脫脂乳∶葛根糖化液=2∶1（V/V）的比例配成種子培養(yǎng)液，將在MRS液體培養(yǎng)基中活化好的菌液接種0.2%到種子培養(yǎng)液中，在40 ℃條件下厭氧培養(yǎng)16 h，得到種子液。

再將種子液按一定比例接種到葛根脫脂乳混合液中在40 ℃厭氧發(fā)酵20 h。

1.3.2 發(fā)酵菌株的確定及其生長曲線的測定

按10%脫脂乳∶10%葛根糖化液=1∶1（V/V）配制培養(yǎng)基，自然pH，分別以3%接種量接種，在40 ℃厭氧的條件下培養(yǎng)20 h，發(fā)酵結(jié)束后檢測葛根總黃酮和乳酸菌EPS，選擇葛根總黃酮和乳酸菌EPS含量最高的菌株為本試驗(yàn)的發(fā)酵菌株。

脫脂乳：葛根液分別按照1∶1、1∶2、2∶1（V/V）配制培養(yǎng)基，自然pH。將上述確定的菌株以3%的接種量分別接種于各培養(yǎng)基，在40 ℃厭氧條件下培養(yǎng)30 h，間隔5 h取樣涂布于平皿上計(jì)數(shù)，同時(shí)測定發(fā)酵液pH值，繪制各培養(yǎng)基中乳酸菌的生長曲線，確定培養(yǎng)基的組分。

1.3.3 葛根發(fā)酵乳發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

確定其他因素不變，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每一個(gè)單因素所得出的結(jié)果用于后續(xù)試驗(yàn)。分別調(diào)整發(fā)酵溫度為25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃；發(fā)酵液初始pH值為5.7、6.1、6.3、6.6、6.9；接種量為1%、2%、3%、4%、5%；葡萄糖添加量為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%；發(fā)酵時(shí)間為14 h、17 h、20 h、23 h、26 h。測定發(fā)酵結(jié)束后的葛根總黃酮和EPS含量。

1.3.4 葛根發(fā)酵乳發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以葛根總黃酮（Y1）和EPS含量（Y2）為響應(yīng)值，選取影響較大的因素即發(fā)酵溫度（X1）、發(fā)酵時(shí)間（X2）和葡萄糖添加量（X3）設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，因素與水平如表1。

表1 葛根發(fā)酵乳發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation conditions optimization of fermented pueraria-milk

1.3.5 測定方法

總黃酮測定方法：分光光度法[17]；胞外多糖（EPS）測定方法：硫酸-苯酚法[18]。生長曲線測定方法：間隔5 h取樣涂布于MRS固體培養(yǎng)皿上計(jì)數(shù)；pH值測定方法：用pH計(jì)測定發(fā)酵液pH。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS9.2統(tǒng)計(jì)軟件分析其響應(yīng)面回歸數(shù)據(jù)及因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌株的確定及生長曲線測定

2.1.1 發(fā)酵菌株的確定

將篩選的一株德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）和一株唾液鏈球菌嗜熱亞種（Streptococcus salivariussubsp.thermophilus）分別發(fā)酵和1∶1組合發(fā)酵，測得葛根總黃酮和EPS含量如表2所示。由表2可，嗜熱鏈球菌（S.t）的葛根總黃酮和EPS含量相對較高。因此，將其作為發(fā)酵菌株。

表2 各菌株發(fā)酵液中總黃酮和胞外多糖產(chǎn)量Table 2 Yield of total flavonoids and exopolysaccharides in fermentation broth of each strain

2.1.2 培養(yǎng)基確定及乳酸菌生長曲線的測定結(jié)果

由圖1、2、3可知，脫脂乳∶葛根液為1∶2（V/V）時(shí)，乳酸菌活菌數(shù)在15 h左右＞0.4×109個(gè)/mL，而其他兩組培養(yǎng)基，乳酸菌在整個(gè)發(fā)酵期間內(nèi)活菌數(shù)均＜0.4×109個(gè)/mL。發(fā)酵液pH在發(fā)酵中后期幾乎保持穩(wěn)定。所以培養(yǎng)基中脫脂乳與葛根液比例為1∶2（V/V）時(shí)，嗜熱鏈球菌生長最好。

圖1 脫脂乳∶葛根體積比1∶2時(shí)pH變化及嗜熱鏈球菌生長曲線Fig.1 pH change and growth curve of Streptococcus thermophilus cultured with skim milk and pueraria volume ratio 1∶2

圖2 脫脂乳∶葛根體積比1∶1時(shí)pH變化及嗜熱鏈球菌生長曲線Fig.2 pH change and growth curve of Streptococcus thermophilus cultured with skim milk and pueraria volume ratio 1∶1

圖3 脫脂乳：葛根體積比2:1時(shí)pH變化及嗜熱鏈球菌生長曲線Fig.3 pH change and growth curve of Streptococcus thermophilus cultured with skim milk and pueraria volume ratio 2:1

2.2 葛根發(fā)酵乳發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵溫度對葛根發(fā)酵乳的影響

由圖4可知，隨發(fā)酵溫度升高，葛根總黃酮和EPS含量均是先增后減，在40 ℃時(shí)達(dá)到最高。葛根總黃酮含量最高達(dá)1.60 mg/mL，EPS含量最高達(dá)0.120 mg/mL。通過單因素差異顯著性分析得到發(fā)酵溫度對葛根總黃酮含量的影響顯著性P1=0.000＜0.01，溫度對EPS含量的影響顯著性P2=0.000＜0.01，說明發(fā)酵溫度對葛根發(fā)酵乳發(fā)酵影響極顯著。

圖4 發(fā)酵溫度對發(fā)酵液中葛根總黃酮和胞外多糖含量的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on total flavonoids and exopolysaccharides content in fermentation broth

2.2.2 初始pH值對葛根發(fā)酵乳的影響

由表3可知，發(fā)酵液初始pH值對葛根總黃酮含量的影響不大，尤其是在6.0～6.9變化時(shí)，葛根總黃酮最終含量差距甚微。不同的初始發(fā)酵液pH值，其胞外多糖最終含量差距較大，且初始pH值為6.3時(shí)，對嗜熱鏈球菌胞外多糖的合成比較有利。通過單因素差異顯著性分析得到初始pH值對葛根總黃酮含量的影響顯著性P1=0.06＞0.05，初始pH值對EPS含量的影響顯著性P2=0.051＜0.05，說明初始pH值對葛根發(fā)酵乳發(fā)酵的影響不顯著。

表3 不同初始pH值對發(fā)酵液中葛根總黃酮和胞外多糖含量的影響Table 3 Effect of different initial pH on total flavonoids and exopolysaccharides content in fermentation broth

2.2.3 接種量對葛根發(fā)酵乳的影響

圖5 不同接種量對葛根總黃酮和胞外多糖含量的影響Fig.5 Effect of different inoculum on total flavonoids and exopolysaccharides contents in fermentation broth

由圖5可知，葛根總黃酮含量隨乳酸菌添加量的增加而逐漸升高。乳酸菌接種量為3%、4%、5%時(shí)，葛根總黃酮含量幾乎保持不變，含量依次為1.50 mg/mL、1.51 mg/mL、1.57 mg/mL。EPS含量隨著乳酸菌接種量的增加先升高后基本保持穩(wěn)定，接種量為3%時(shí)，EPS含量最大，達(dá)到0.120 mg/mL。雖然乳酸菌接種量5%時(shí)的葛根總黃酮含量略高，但從節(jié)約成本角度講，選擇乳酸菌接種量為3%。

通過單因素差異顯著性分析得到接種量對葛根總黃酮含量的影響顯著性P1=0.1＞0.05，接種量對EPS含量的影響顯著性P2=0.052＞0.05，說明接種量對葛根發(fā)酵乳發(fā)酵的影響不顯著。

2.2.4 葡萄糖添加量對葛根發(fā)酵乳的影響

很多研究表明，當(dāng)乳酸菌以葡萄糖為碳源時(shí)可以得到最高的胞外多糖產(chǎn)量[19-20]。因此探究葡萄糖添加量對其EPS和葛根黃酮含量也很重要。葡萄糖添加量為添加的葡萄糖質(zhì)量占葛根脫脂乳質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)。

圖6 葡萄糖添加量對葛根總黃酮和胞外多糖含量的影響Fig.6 Effect of glucose addition on total flavonoids and exopolysaccharides contents in fermentation broth

由圖6可知，隨著葡萄糖添加量的增加，EPS和葛根總黃酮含量均是先上升后下降，且葡萄糖添加量為1.5%時(shí)，兩者含量都達(dá)到最大值，分別為2.00 mg/mL和0.160 mg/mL。通過單因素差異顯著性分析得到葡萄糖添加量對葛根總黃酮含量的影響顯著性P1=0.004＜0.01，葡萄糖添加量對EPS含量的影響顯著性P2=0.000＜0.01，說明葡萄糖添加量對葛根發(fā)酵乳發(fā)酵的影響極顯著。

2.2.5 發(fā)酵時(shí)間對葛根發(fā)酵乳的影響

圖7 發(fā)酵時(shí)間對葛根總黃酮和胞外多糖含量的影響Fig.7 Effect of the fermentation time on total flavonoids and exopolysaccharides contents in fermentation broth

由圖7可知，葛根總黃酮含量和EPS含量在發(fā)酵時(shí)間為14～26 h之間都先上升后降低，在發(fā)酵20 h后保持平緩的趨勢。發(fā)酵時(shí)間為20 h時(shí)，葛根總黃酮含量為1.78 mg/mL，EPS含量達(dá)到最大為0.160 mg/mL。葛根總黃酮在23 h達(dá)到最大為1.85 mg/mL，此時(shí)EPS含量為0.160 mg/mL。通過單因素差異顯著性分析得到發(fā)酵時(shí)間對葛根總黃酮含量的影響顯著性P1=0.012＜0.05，發(fā)酵時(shí)間對EPS含量的影響顯著性P2=0.000＜0.01，說明發(fā)酵時(shí)間對葛根發(fā)酵乳發(fā)酵的影響顯著。

2.2.5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及回歸分析

由單因素試驗(yàn)可知，發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、葡萄糖添加量對EPS和葛根總黃酮含量影響較大，因此選此3因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，再根據(jù)各因素的試驗(yàn)結(jié)果選取3個(gè)水平。

Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果與分析見表4，方差分析見表5和表6。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results Box-Behnken experiments

表5 以葛根總黃酮為評價(jià)指標(biāo)的響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 5 Variance analysis of response surface using total flavonoids of pueraria as evaluation index

表6 以胞外多糖為評價(jià)指標(biāo)的響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 6 Variance analysis of response surface using exopolysaccharides of pueraria as evaluation index

2.2.6 葛根總黃酮含量的響應(yīng)面分析

圖8 發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、葡萄糖添加量交互作用對葛根總黃酮含量影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.8 Response surface and contour line of effects of interaction between fermentation temperature,time and glucose addition on total flavonoids contents of pueraria

由圖8可知，當(dāng)葡萄糖添加量為1.5%時(shí)，隨著溫度的升高，葛根總黃酮含量先升后降，當(dāng)溫度為40.29 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為22.68 h時(shí)，葛根總黃酮含量最大。X2=22 h時(shí)，X1在37～40.29 ℃范圍內(nèi)，X3=1.41%時(shí)，葛根總黃酮含量最大。X1=40 ℃時(shí)，葡萄糖添加量＜1.41%時(shí)，葛根總黃酮含量隨時(shí)間的延長先增大后減少，在培養(yǎng)時(shí)間為22.68 h時(shí)最大。

采用SAS9.2統(tǒng)計(jì)軟件分析，得X1=0.0932 5，X2=0.223 67，X3=-0.179 83為最優(yōu)水平代碼，即最佳發(fā)酵條件為：葡萄糖添加量為1.4%，發(fā)酵時(shí)間22.68 h，發(fā)酵溫度40.29 ℃，理論上葛根總黃酮的產(chǎn)量為1.959 478 mg/mL。進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，采用響應(yīng)面分析得出的最優(yōu)條件進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，設(shè)三個(gè)平行試驗(yàn)，葛根總黃酮的平均值為1.95 mg/mL，與理論預(yù)測值誤差較小。

2.2.7 胞外多糖含量的響應(yīng)面分析

圖9 發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、葡萄糖添加量對胞外多糖含量影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.9 Response surface and contour line of effects of interaction between fermentation temperature,time and glucose addition on exopolysaccharides contents of pueraria

由圖9可知，X3=1.5%時(shí)，溫度在37～38.7 ℃范圍內(nèi)，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為19.8 h時(shí)，胞外多糖產(chǎn)量最大。當(dāng)溫度超過38.7 ℃時(shí)，其響應(yīng)面曲線呈現(xiàn)陡峭趨勢，隨著溫度的升高，胞外多糖含量降低。當(dāng)溫度超過38.7 ℃時(shí)，乳酸菌細(xì)胞增殖快。而合成細(xì)胞壁和EPS都需要消耗磷酸類異戊二烯[21-22]，因此EPS的含量就會隨之降低。X2=22 h時(shí)，X3在1%～1.38%范圍內(nèi)，溫度高為38.7 ℃時(shí)，EPS的含量最大。當(dāng)X3＞1.38%時(shí)，EPS的含量急劇降低，這是因?yàn)閄3＞1.38%時(shí)，嗜熱鏈球菌的生長和代謝由于葡萄糖效應(yīng)的產(chǎn)生而受到了抑制[21]。當(dāng)X1=40 ℃時(shí)，X3在1%～1.38%范圍內(nèi)，隨著X2增大，EPS含量逐漸增大，當(dāng)X2=25 h左右達(dá)到最高值。

葡萄糖添加量和溫度對EPS含量的影響要大于培養(yǎng)時(shí)間的影響。經(jīng)分析，得到最優(yōu)化水平代碼X1=-0.456 37，X2=-0.735 87，X3=-0.233 59，即葡萄糖添加量為1.38%，培養(yǎng)溫度38.7 ℃，發(fā)酵時(shí)間19.8 h，理論上EPS產(chǎn)值可達(dá)0.159 69 mg/mL。進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，采用響應(yīng)面分析得出的最優(yōu)條件進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，設(shè)三個(gè)平行試驗(yàn)，EPS含量為0.155 mg/mL，與理論預(yù)測值誤差較小。

2.2.8 嗜熱鏈球菌發(fā)酵條件的綜合分析

從表5、表6中可知，發(fā)酵溫度F1（20）＜發(fā)酵溫度F2（98），葡萄糖添加量F1（174）＜葡萄糖添加量F2（288），由此可知，這兩個(gè)因素對EPS產(chǎn)率的影響大于對葛根總黃酮的影響。綜合考慮，確定葡萄糖添加量為1.4%，發(fā)酵溫度為39 ℃。由表5可知，發(fā)酵時(shí)間的P＞0.05，即發(fā)酵時(shí)間對葛根總黃酮影響不顯著，因此選擇較短的時(shí)間20 h。

添加1.4%的葡萄糖，在39 ℃發(fā)酵唾液鏈球菌嗜熱亞種20 h，發(fā)酵結(jié)束后測定葛根總黃酮和EPS含量，分別為（1.91±0.1）mg/mL、（0.155±0.02）mg/mL。

3 結(jié)論

試驗(yàn)從酸乳中篩選獲得一株產(chǎn)胞外多糖的嗜熱鏈球菌，且脫脂乳和葛根糖化液體積比例為1∶2時(shí)，此菌生長情況最好，這可能是葛根中含有對嗜熱鏈球菌生長具有促進(jìn)作用的某種生長因子。嗜熱鏈球菌的最佳發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度為39 ℃，發(fā)酵時(shí)間為20 h，葡萄糖添加量為1.4%。在此優(yōu)化條件下，葛根發(fā)酵乳總黃酮含量為1.91 mg/mL，EPS含量為0.155 mg/mL。