劉結(jié)容，岑建斌，李秀英

（廣州檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)有限公司，廣東 廣州 511447）

保健酒在中國(guó)已有數(shù)千年歷史。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，保健酒的制備工藝從中藥浸酒的傳統(tǒng)工藝發(fā)展到利用萃取、浸提和生物工程等現(xiàn)代化手段，提取中藥中的有效成份制成高含量的功能藥酒。藥酒的品種也越來(lái)越多，生產(chǎn)者將酒與人參、鹿茸、海馬、牛鞭等中藥及動(dòng)植物相結(jié)合，制成聲稱(chēng)具有強(qiáng)身健體、緩解疲勞的保健酒。但近年來(lái)媒體陸續(xù)報(bào)導(dǎo)有不法商家向保健酒中非法添加西地那非等5型磷酸二酯酶（phosphodiesterase-5）抑制劑及其衍生物，以達(dá)到壯陽(yáng)、滋補(bǔ)、強(qiáng)身、保健等功效[1-2]。

國(guó)家已規(guī)定嚴(yán)禁向食品中添加那非類(lèi)物質(zhì)，誤食那非類(lèi)藥物易引起一定的不良反應(yīng)，如頭痛、消化不良、肌肉疼痛、鼻塞、皮疹和視覺(jué)障礙等癥狀，尤其是心血管疾病和糖尿病患者若長(zhǎng)期誤食甚至?xí)斐赏蝗凰劳鯷3]。為更加全面地保護(hù)消費(fèi)者的健康安全，國(guó)家監(jiān)管部門(mén)自2006年至今相繼頒布了8個(gè)關(guān)于那非類(lèi)物質(zhì)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法[4-11]。2006-2017年發(fā)布的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法檢測(cè)的那非類(lèi)物質(zhì)為2～11種，采用的方法多為液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法等[12]。2018年發(fā)布的BJS 201805《食品中那非類(lèi)物質(zhì)的測(cè)定》可同時(shí)檢測(cè)90種那非類(lèi)物質(zhì)，采用的方法是超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法、超高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法。除此，已有文獻(xiàn)報(bào)道使用拉曼光譜法[13-14]、電噴霧-離子遷移譜法[15]、高效液相色譜法[16]、高效液相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用法[17]、酶聯(lián)免疫法[18]、超高效液相色譜靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法[19]來(lái)測(cè)定那非類(lèi)物質(zhì)。

本實(shí)驗(yàn)建立一種適用于快速監(jiān)測(cè)保健藥酒中的那非類(lèi)物質(zhì)的殘留情況的監(jiān)測(cè)方法，為保健藥酒中的那非類(lèi)物質(zhì)的監(jiān)管和產(chǎn)品質(zhì)量的控制提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

28種那非對(duì)照品（純度均＞98%）：加拿大TRC公司（見(jiàn)表1）；甲醇、乙醇、乙腈（均為色譜級(jí)）：德國(guó)Merck公司；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、C18和石墨化碳黑（graphitized carbon blacks，GCB）吸附劑：美國(guó)Agilent公司；超純水（18.2 MΩ）：由Millipore純水儀制備；保健酒樣品：市售。

表1 28種那非類(lèi)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的信息Table 1 Information of 28 nafils substances standard

1.2 儀器與設(shè)備

U 3000高效液相色譜儀、TSQ Endura三重四極桿質(zhì)譜儀、Thermo Scientific Hypersil GOLD色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）：美國(guó)Thermo Scientific公司；菲羅門(mén)Kinetex PFP色譜柱（50 mm×2.0 mm，2.6 μm）：美國(guó)菲羅門(mén)公司；Waters UPLC TM BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）：美國(guó)Waters公司；MS2 Minshaker渦旋振蕩器：德國(guó)IKA公司；3K15高速離心機(jī)：美國(guó)Sigma公司；KDC-400低速離心機(jī)：科大創(chuàng)新公司；KQ-500E超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 檢測(cè)方法

色譜條件為色譜柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD（100mm×2.1 mm，1.9μm）；流動(dòng)相：A為含0.1%甲酸的乙腈溶液，B為0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相梯度洗脫程序：0～15 min，95%～5%B；15.1～22 min，5%B，22.1～26 min，5%～95%B；進(jìn)樣體積：5 μL；流速：0.30 mL/min；柱溫：35 ℃。

質(zhì)譜條件為離子源：電噴霧離子（electrosprayionization，ESI）源；監(jiān)測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式；電噴霧電壓：正離子4000V；離子源溫度：333℃；霧化溫度：317 ℃；鞘氣流速：40 arb；輔氣流速：12 arb。28種化合物相應(yīng)的母離子、子離子和碰撞能量（collision energy，CE）見(jiàn)表2。

表2 28種化合物的母離子、子離子和碰撞能量Table 2 Precursor ions,product ions and collision energy of 28 compounds

1.3.2 樣品的前處理

取保健藥酒樣品適量搖勻，準(zhǔn)確吸取1 mL置于50 mL容量瓶中，加適量甲醇，超聲提取15min，放冷至室溫，用甲醇定容后，轉(zhuǎn)移到高速離心管，加入吸附劑，渦旋20 s，4 000 r/min離心2 min，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜后，供測(cè)定。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

分別精密稱(chēng)取28種那非物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃貯存。分別吸取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用空白基質(zhì)液逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度分別為10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化

為進(jìn)一步去除提取液中的干擾雜質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)采用分散固相萃取吸附劑進(jìn)行凈化，分別使用分散固相萃取吸附劑PSA、GCB、C18對(duì)提取液進(jìn)行凈化，并考察凈化后各化合物的加標(biāo)回收率，結(jié)果顯示，使用吸附劑PSA時(shí)的回收率為90.3%～112.1%，使用吸附劑C18的回收率為69.9%～127.9%，而使用吸附劑GCB時(shí)，回收率很低，且各化合物的回收率差異很大。由此數(shù)據(jù)可見(jiàn)，使用吸附劑PSA的回收率較為理想，故選擇PSA為吸附劑凈化提取液。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

28種那非類(lèi)物質(zhì)含有極性化合物、中等極性化合物、非極性化合物，需要選擇合適的色譜柱將其同時(shí)分離。本實(shí)驗(yàn)考察了菲羅門(mén)Kinetex PFP（50 mm×2.0 mm，2.6 μm）、Waters UPLC TM BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Thermo Scientific Hypersil GOLD（100 mm×2.1 mm 1.9 μm）3種色譜柱的分離效果。在KinetexPFP、WatersUPLCTMBEHC18色譜柱上，由于硅羥基的作用造成峰形延展拖尾嚴(yán)重，可能是部分那非的極性基團(tuán)與色譜柱上未封尾的活性基團(tuán)產(chǎn)生次級(jí)作用；Thermo Scientific Hypersil GOLD（100 mm×2.1 mm 1.9 μm）色譜柱對(duì)硅羥基進(jìn)行雙封尾，各待測(cè)化合物在色譜柱上的峰形對(duì)稱(chēng)，基線(xiàn)平穩(wěn)。因此，選擇Thermo Scientific Hypersil GOLD（100 mm×2.1 mm 1.9 μm）色譜柱進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將質(zhì)量濃度為1 μg/mL的那非類(lèi)化合物單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，在電噴霧離子源條件下分別進(jìn)行正離子和負(fù)離子模式全掃描分析，28種化合物的電噴霧離子化效果均較好，均在正離子模式下獲得響應(yīng)最佳的準(zhǔn)分子離子峰，并且通過(guò)選擇離子監(jiān)測(cè)方式分別優(yōu)化每個(gè)化合物的碎裂電壓，然后采用子離子全掃描分析，優(yōu)化碰撞能量，經(jīng)過(guò)優(yōu)化，得出最佳質(zhì)譜條件如“1.3.1”所述。

2.4 回歸方程、線(xiàn)性關(guān)系、檢出限、定量限及方法學(xué)考察

在優(yōu)化條件下，對(duì)那非混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)試。以目標(biāo)化合物的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度（x，μg/L）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，28種化合物在10～200 μg/L范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）≥0.992 0。以3倍信噪比（S/N=3）計(jì)算檢出限（limitof detection，LOD），S/N=10計(jì)算定量限（limit of quantity，LOQ），得到28種那非類(lèi)化合物的LOD為0.01～0.12 mg/L，LOQ為0.03～0.36 mg/L，表明本方法具有較高的靈敏度。

選取陰性的保健藥酒試樣，分別添加低（0.1 mg/L）、中（0.2 mg/L）、高（0.5 mg/L）3個(gè)水平的那非混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平做6個(gè)平行樣，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 28種化合物的線(xiàn)性關(guān)系、檢出限、定量限和加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Linear relationship,detection limits,quantitation limits,adding standard recovery rate and relative standard deviation of 28 compounds

續(xù)表

由表3可知，28種化合物的平均回收率為90.3%～112.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.8%～5.3%?；厥章始熬芏染螱B/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》[20]要求。

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

對(duì)市售的10批次保健藥酒樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中6批次保健藥酒檢出西地那非，含量分別為0.02 mg/L、0.04 mg/L、0.06 mg/L、0.19 mg/L、0.19 mg/L、4.38 ml/L。

3 結(jié)論

本研究建立了保健酒中28種那非的分散固相萃取凈化超高效液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)法，實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了高效液相色譜分離條件和質(zhì)譜參數(shù)，優(yōu)選出乙醇溶液提取和PSA凈化體系。方法學(xué)評(píng)價(jià)表明該方法回收率（90.3%～112.1%）和精密度（1.8%～5.3%，n=6）良好，28種目標(biāo)化合物的方法檢出限在0.01～0.12 mg/L之間；定量限在0.03～0.36 mg/L之間。該方法準(zhǔn)確、靈敏，前處理簡(jiǎn)單、適用性好，適用于快速監(jiān)測(cè)保健藥酒中的那非類(lèi)物質(zhì)的殘留情況，為保健藥酒中的那非類(lèi)物質(zhì)的監(jiān)管和產(chǎn)品質(zhì)量的控制提供了技術(shù)支持。