孫 科，馮希勇，于秋菊，耿鳳英，姜其華，李 東

（徐州生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程系，江蘇 徐州 221006）

銀杏（Ginkgo bilobaL.）為銀杏科、銀杏屬落葉喬木，素有“活化石”和“植物界熊貓”之稱[1]。其早在明朝初年就有入藥的記載，《本草綱目》記載銀杏具有“入肺經(jīng)、益脾氣、定喘咳、縮小便”功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對銀杏提取物特別是銀杏葉提取物進行大量研究發(fā)現(xiàn)，該提取物對心腦血管疾病等具有非常顯著的療效[2]，進一步研究發(fā)現(xiàn)其主要成分為萜內(nèi)酯類化合物和黃酮類化合物[3]。但銀杏提取物中黃酮的含量很低，提取難度大、成本高，很難滿足日益增長的市場需求[4]。

近年來，對植物內(nèi)生真菌的研究越來越多，研究成果日益受到重視[5]。植物內(nèi)生真菌指生活史的部分或全部時間生存在健康植物體內(nèi)，對宿主植物無害的真菌[6-7]。由于內(nèi)生真菌和藥用植物協(xié)同進化，內(nèi)生真菌可以在生命活動過程中合成某些藥用植物所具有的相同或相似的物質(zhì)[8]。內(nèi)生菌具有數(shù)量眾多、群結(jié)構(gòu)多樣的特點，是潛力巨大的微生物新資源[9-10]。采用銀杏內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)銀杏黃酮，既可以大大增加銀杏黃酮的產(chǎn)量又可以很好的保護銀杏資源。因此，有望通過銀杏內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)生大量銀杏黃酮。目前，對銀杏內(nèi)生真菌產(chǎn)黃酮的研究主要集中在對產(chǎn)生菌的分離鑒定的研究，如趙慶云等[11]利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）-紫外（ultraviolet，UV）的方法從銀杏內(nèi)生菌中篩選出8株具有產(chǎn)黃酮能力的內(nèi)生菌，其中7株為真菌，1株為放線菌。然而，對銀杏內(nèi)生菌產(chǎn)黃酮發(fā)酵工藝研究較少，張洋等[1]對產(chǎn)黃酮銀杏內(nèi)共生真菌進行分離并對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化，研究菌發(fā)酵7 d黃酮產(chǎn)量可達6.4 μg/mL。

本研究以前期從銀杏葉中分離出的一株產(chǎn)黃酮能力較強的內(nèi)共生真菌卷枝毛霉（Mucor circinelloides）SN2017為研究對象，總黃酮產(chǎn)量為響應(yīng)值，采用單因素試驗及響應(yīng)面法優(yōu)化其產(chǎn)黃酮的發(fā)酵工藝條件，以期提高銀杏黃酮產(chǎn)量，為規(guī)模化生產(chǎn)提供了理論和實踐的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

卷枝毛霉（Mucor circinelloides）SN2017：實驗室保藏菌種。

1.1.2 試劑

麥精：山東天驕生物技術(shù)有限公司；玉米漿：金克隆（北京）生物技術(shù)有限公司；麥芽糖、糊精（均為分析純）：廣州億源生物科技科技有限公司；蛋白胨（分析純）：廣州西楚生物技術(shù)有限公司；NaNO3、K2HPO4、KCl、FeSO4（均為分析純）：山東嘉穎華工科技有限公司；瓊脂粉（生化試劑）：合肥博美生物科技有限公司；消泡劑（食品級）：上海海域化工有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基[12]：麥芽糖20 g/L，蛋白胨5 g/L，NaNO31.0 g/L，F(xiàn)eSO40.01 g/L，K2HPO40.05 g/L，瓊脂粉18 g/L。121 ℃高壓滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基[13]：玉米漿8 g/L，糊精40 g/L，NaNO31.0 g/L，KCl 0.5 g/L，消泡劑0.1 g/L。121 ℃高壓滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基[14]：麥精60g/L，玉米漿15g/L，消泡劑0.1 g/L。121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

VD-850臺式超凈工作臺：杭州旭清科技有限公司；LHPYX3M生化培養(yǎng)箱：常州金南儀器制造有限公司；HNY-200B恒溫搖床：上海喬躍電子科技有限公司；FC-ZD-20 L機械攪拌通風(fēng)式發(fā)酵罐：武漢金榜輕工機械設(shè)備有限公司；TDZ4離心機：青島諾凱達機械制造有限公司；Agilent1260型高效液相色譜儀：美國Agilent Technologies公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 卷枝毛霉（Mucor circinelloides）SN2017種子液制備

將卷枝毛霉CN2017接種于斜面培養(yǎng)基，于28 ℃條件下活化培養(yǎng)7 d。取卷枝毛霉CN2017的孢子，制備孢子懸液（1×108個/mL）。吸取2 mL孢子懸液接種于裝有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，于28 ℃、210 r/min條件下培養(yǎng)38 h，即為種子液。

1.3.2 卷枝毛霉SN2017產(chǎn)黃酮發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

按10%（V/V）接種量將種子液接種于20 L機械攪拌通風(fēng)式發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為14 L，初始pH值為5.5，在發(fā)酵溫度28 ℃、通氣量為6.0 L/min條件下培養(yǎng)8 d。

在此基礎(chǔ)上，依次考察初始pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、發(fā)酵溫度（26 ℃、27 ℃、28 ℃、29 ℃、30 ℃、31 ℃）、接種量（8%、9%、10%、11%、12%、13%）和通氣量（3.0 L/min、4.0L/min、5.0L/min、6.0L/min、7.0 L/min、8.0 L/min）對卷枝毛霉SN2017產(chǎn)黃酮的影響。

1.3.3 卷枝毛霉SN2017產(chǎn)黃酮發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取初始pH值（X1）、發(fā)酵溫度（X2）、接種量（X3）、通氣量（X4）為考察因素，以銀杏總黃酮產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，采用Box-Behnken試驗水平設(shè)計[15-17]，進行4因素3水平響應(yīng)面試驗，因素與水平見表1。

表1 卷枝毛霉SN2017產(chǎn)黃酮發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests for fermentation conditions optimization of flavonoids production by Mucor circinelloides SN2017

1.3.4 總黃酮含量測定方法

采用氯化鋁比色法測定發(fā)酵液中總黃酮含量[1，18]。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert 8.0.6軟件[19-20]對響應(yīng)面試驗得到的數(shù)據(jù)進行線性回歸和方差分析，通過SPSS 19.0軟件分析顯著性（P＜0.05），所有試驗均做3個重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 卷枝毛霉SN2017產(chǎn)黃酮發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗結(jié)果

2.1.1 初始pH值對卷枝毛霉SN2017產(chǎn)黃酮的影響

初始pH值對卷枝毛霉SN2017產(chǎn)黃酮的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，隨著初始pH值的升高，總黃酮產(chǎn)量呈先升高后下降的趨勢。當(dāng)初始pH值為6.0時，總黃酮產(chǎn)量最高，為52.39 mg/L。卷枝毛霉通過一定的代謝路徑產(chǎn)生銀杏黃酮，受到一系列酶的催化影響，初始pH值過低或過高均會抑制酶的活性。因此，確定卷枝毛霉SN2017產(chǎn)黃酮的最適的初始pH值為6.0。

圖1 初始pH值對卷枝毛霉SN2017產(chǎn)黃酮的影響Fig.1 Effect of initial pH on flavonoids production by Mucor circinelloides SN2017

2.1.2 發(fā)酵溫度對卷枝毛霉SN2017產(chǎn)黃酮的影響

發(fā)酵溫度對卷枝毛霉SN2017產(chǎn)黃酮的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，總黃酮產(chǎn)量呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)發(fā)酵溫度為29 ℃時，總黃酮產(chǎn)量最高，為54.69 mg/L。分析原因可能是發(fā)酵溫度過低或過高均會抑制酶的活性，進而影響黃酮產(chǎn)量。因此，確定卷枝毛霉SN2017產(chǎn)黃酮的最適發(fā)酵溫度為29 ℃。

圖2 發(fā)酵溫度對卷枝毛霉SN2017產(chǎn)黃酮的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on flavonoids production by Mucor circinelloides SN2017

2.1.3 接種量對卷枝毛霉SN2017產(chǎn)黃酮的影響

接種量對卷枝毛霉SN2017產(chǎn)黃酮的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著接種量的增加，總黃酮產(chǎn)量呈先升高后下降的趨勢。當(dāng)接種量為11%時，總黃酮產(chǎn)量最高，為53.96 mg/L。

圖3 接種量對卷枝毛霉SN2017產(chǎn)黃酮的影響Fig.3 Effect of inoculum on flavonoids production by Mucor circinelloides SN2017

接種量的大小取決于菌種生長速率，接種量大可以縮短發(fā)酵時間，并減少發(fā)酵過程染菌。但如果接種量過大，會造成溶氧不足，降低發(fā)酵產(chǎn)量。因此，確定卷枝毛霉SN2017產(chǎn)黃酮的最適接種量為11%。

2.1.4 通氣量對卷枝毛霉SN2017產(chǎn)黃酮的影響

圖4 通氣量對卷枝毛霉SN2017產(chǎn)黃酮的影響Fig.4 Effect of ventilation on flavonoids production by Mucor circinelloides SN2017

通氣量對卷枝毛霉SN2017產(chǎn)黃酮的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著通氣量的增加，總黃酮產(chǎn)量呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)通氣量為6.0 L/min時，總黃酮產(chǎn)量最高，為54.62 mg/L。卷枝毛霉是一種好氧絲狀真菌，發(fā)酵過程需要在發(fā)酵液中通入一定濃度的氧氣。發(fā)酵液中溶氧會影響卷枝毛霉的酶活，過大或過小的溶氧濃度都會抑制酶的活性。因此，確定卷枝毛霉SN2017產(chǎn)黃酮的最適通氣量為6.0 L/min。

2.2 卷枝毛霉SN2017產(chǎn)黃酮發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 回歸模型建立

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取初始pH值（X1）、發(fā)酵溫度（X2）、接種量（X3）、通氣量（X4）為考察因素，以銀杏總黃酮產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，采用Box-Behnken試驗水平設(shè)計[15-17]，進行4因素3水平響應(yīng)面試驗，響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析見表2。

表2 卷枝毛霉SN2017產(chǎn)黃酮發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of Box-Behnken tests for fermentation conditions optimization of flavonoids production by Mucor circinelloides SN2017

使用統(tǒng)計軟件Design Expert 8.0.6對表2結(jié)果進行多元回歸擬合，所得二次多項式回歸方程為：

2.2.2 回歸模型方差分析

回歸模型的方差分析結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

續(xù)表

由表3可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），表明回歸模型的擬合度較好。模型的決定系數(shù)R2=0.973 8，校正決定系數(shù)R2adj=0.948 5，表明所建模型和實際情況擬合程度高，可以用于卷枝毛霉SN2017產(chǎn)黃酮發(fā)酵條件的預(yù)測。一次項X2、X3、X4、交互項X1X2、X1X4、X2X3、X2X4對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）；二次項X42對結(jié)果影響顯著（P＜0.05）；其他項對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

2.2.3 響應(yīng)面試驗分析及驗證試驗

發(fā)酵溫度、初始pH值、接種量及通氣量交互作用對卷枝毛霉SN2017產(chǎn)黃酮影響的響應(yīng)面及等高線見圖5。

由圖5可知，除交互項X1X3外，隨著各因素水平的增大，響應(yīng)值呈先升高后減小的趨勢。交互項X1X2、X1X4、X2X3、X2X4對卷枝毛霉SN2017產(chǎn)黃酮影響的響應(yīng)面均呈現(xiàn)拋物面，即說明4個交互項所在選取的試驗范圍內(nèi)，響應(yīng)值均存在極大值。等高線均呈橢圓形，即說明4個交互項對結(jié)果影響顯著，與方差分析結(jié)果一致。

圖5 各交互作用對卷枝毛霉SN2017產(chǎn)黃酮影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on flavonoids production by Mucor circinelloides SN2017

使用Design Expert 8.0.6軟件對二次多項式回歸方程求解，求得卷枝毛霉SN2017產(chǎn)黃酮的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為：初始pH值5.39，發(fā)酵溫度29.83 ℃、接種量9.67%、通氣量6.46 L/min，預(yù)測總黃酮產(chǎn)量為55.0 mg/L?？紤]實際操作可行性，最終確定最優(yōu)發(fā)酵工藝為初始pH值5.5、發(fā)酵溫度30 ℃、接種量9.7%、通氣量6.5 L/min。在此最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下，總黃酮產(chǎn)量為56.63 mg/L，與預(yù)測值接近，說明回歸模型和實際情況可以較好的擬合，總黃酮產(chǎn)量較優(yōu)化前（52.39 mg/L）提高8.09%，比目前文獻報道的最高銀杏總黃酮發(fā)酵產(chǎn)量提高142%[18]。

3 結(jié)論

通過單因素及響應(yīng)面試驗優(yōu)化確定銀杏內(nèi)共生菌卷枝毛霉（Mucor circinelloides）SN2017產(chǎn)黃酮的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為：初始pH值5.5、發(fā)酵溫度30 ℃、接種量9.7%、通氣量6.5 L/min。在此最優(yōu)發(fā)酵條件下，總黃酮產(chǎn)量為56.63 mg/L，較優(yōu)化前提高8.09%。由此可見，本研究所構(gòu)模型可顯著提高銀杏總黃酮發(fā)酵產(chǎn)量，為規(guī)?；a(chǎn)提供了理論和實踐的基礎(chǔ)。