楊佩斯，李 祝，唐婧紅，趙妗頤，張 素

（1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

微生物絮凝劑（microbial flocculant）是由微生物細(xì)胞成分提取或新陳代謝產(chǎn)生，能使廢水中污染顆粒物、膠體懸浮物、有害微生物等微粒發(fā)生凝集、沉淀的一類特殊活性有機(jī)物[1]，其主要成分為脂類[2]、蛋白質(zhì)[3]、多糖[4]、核酸[5]等。具有安全無污染、材料環(huán)保、容易降解等優(yōu)點(diǎn)[6]，在綠色環(huán)保、農(nóng)業(yè)安全、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域具有無限良好的應(yīng)用前景。法國生物學(xué)家微生物學(xué)之父PASTEUR L最早在酵母菌中發(fā)現(xiàn)微生物的絮凝特性[7]；NAKAMURA J等[8-9]陸續(xù)從自然界分離到具有絮凝特性的醬油曲霉（Aspergillus sojae）AJ 7002和紅平紅球菌（Rhohococcus erthropolis），分離提取活性物并制成絮凝劑，用于處理污泥、畜產(chǎn)廢水、廢水脫色及磚場生產(chǎn)廢水，取得了良好的治理效果；LEE S H等[10]采用多步沉淀法從Archuadendronsp.TS-49中分離得到絮凝劑，檢測其成分為己糖胺和蛋白質(zhì)；HE J等[11]培養(yǎng)鹽單胞菌（Halomonassp.）制備絮凝劑HBF-3并研究其絮凝橋聯(lián)作用；YIN Y J等[12]從克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）中提取到絮凝劑ZZ-3，并證實(shí)其多糖成分和絮凝機(jī)理。目前，科研人員已從不同環(huán)境中分別分離出多種具有絮凝特性的微生物，涵蓋微生物種屬數(shù)十個(gè)[13-16]。目前主要問題是高產(chǎn)菌株難獲得、不穩(wěn)定、微生物絮凝劑的產(chǎn)量太低，導(dǎo)致生產(chǎn)應(yīng)用成本過高，限制了的商業(yè)的實(shí)際應(yīng)用。選育微生物高產(chǎn)絮凝劑菌株是微生物絮凝劑可以得以早日應(yīng)用和產(chǎn)量增加的方法，已成為環(huán)境微生物領(lǐng)域研究的新熱點(diǎn)。

常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變技術(shù)是近年來開發(fā)應(yīng)用的一種新生物育種技術(shù)，利用激發(fā)態(tài)物質(zhì)在強(qiáng)電場中產(chǎn)生的等離子體使生物細(xì)胞胞內(nèi)遺傳物質(zhì)突變，從而讓生物體產(chǎn)生新性狀和穩(wěn)定遺傳的特性[17]。與其他育種技術(shù)相比，該技術(shù)具有輻射均勻、工作溫度低（＜40 ℃）、操作安全簡便等特點(diǎn)，現(xiàn)已應(yīng)用于農(nóng)作物玉米[18]、大豆[19]、小麥[20]等生長抗逆性研究。此外，大量研究顯示，采用ARTP技術(shù)對(duì)酵母[21-22]、細(xì)菌[23-24]、真菌[25-26]等進(jìn)行誘變選育，突變菌株發(fā)酵后酶和激素等代謝物的產(chǎn)量均有所提高。但是，以ARTP技術(shù)選育高絮凝菌株的研究鮮見報(bào)道。

本研究采用ARTP誘變技術(shù)對(duì)黑曲霉（Aspergillus niger）xj進(jìn)行誘變，旨在研究ARTP對(duì)微生物產(chǎn)絮凝劑的影響，以期篩選出絮凝活性高、遺傳穩(wěn)定的菌株，為ARTP在微生物絮凝菌株選育方面提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

黑曲霉（Aspergillus niger）xj：貴州大學(xué)生命科學(xué)院微生物所分離、鑒定，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（China center for type culture collection，CCTCC）（保藏號(hào)：CCTCC NO.M 206021）。

1.1.2 試劑

高嶺土、吐溫80、葡萄糖、鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基[27]：馬鈴薯200 g切碎成塊狀煮20 min，紗布過濾加葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值7.0，121 ℃高壓滅菌30 min。馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基中不添加瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

ⅡS型ARTP誘變育種儀：江蘇無錫源清天木生物科技有限公司；DP-350漩渦振蕩儀：北京亞歐德鵬科技有限公司；TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；PHS-3C精密酸堿計(jì)：上海大普儀器有限公司；BIOMATE 3S紫外可見光分光光度計(jì)：賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑曲霉xj孢子懸液的制備

取斜面保存的黑曲霉xj劃線接種于PDA培養(yǎng)基平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，待平板表面長滿黑曲霉菌體，用接種環(huán)輕輕刮取表面的孢子，加入1 g/L吐溫80沖洗2～3次。吸取孢子懸液轉(zhuǎn)移至裝有少量玻璃珠的錐形瓶中，室溫振蕩10 min使孢子充分分散，脫脂棉過濾，得到黑曲霉菌絲。繼續(xù)采用吐溫80稀釋孢子懸浮液，通過血球計(jì)數(shù)板[28]計(jì)算黑曲霉孢子濃度，調(diào)整孢子懸浮液終濃度為1×107CFU/mL。

1.3.2 常壓室溫等離子體誘變方法

取10 μL黑曲霉xj孢子懸浮液，均勻涂布于無菌金屬載片表面，風(fēng)干，將金屬載片置于ARTP誘變育種儀內(nèi)分別誘變30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s、210 s、240 s、270 s、300 s，其他誘變條件為誘變功率120 W、氦氣（He）通氣量10 L/min、輻射距離2 mm。誘變結(jié)束后將金屬載片轉(zhuǎn)移至裝有無菌水的EP管中，在漩渦振蕩儀上充分振蕩以形成新的黑曲霉孢子懸液，用無菌涂布棒將不同處理時(shí)間下的黑曲霉孢子懸浮液稀釋涂布于PDA培養(yǎng)基平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。以未處理樣品（0 s）為對(duì)照，通過平板菌落計(jì)數(shù)法[29]計(jì)算誘變致死率，繪制菌株致死率曲線，其計(jì)算公式如下：

同時(shí)，考察誘變菌株所產(chǎn)絮凝劑對(duì)高嶺土懸液的絮凝率，并計(jì)算正突變率，其計(jì)算公式如下：

最后，根據(jù)致死率及正突變率確定最佳誘變時(shí)間。

1.3.3 絮凝率的測定

絮凝劑的制備：取5mL孢子懸浮液（1×107CFU/mL）接種于PDB培養(yǎng)基中，裝液量為100 mL/250 mL，30 ℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)72 h，過濾，取發(fā)酵液，10 000 r/min冷凍離心10 min，上清液即為絮凝劑。

絮凝率的測定：取4 mL絮凝劑滴加入95 mL 0.4%的高嶺土懸液中，以1 mL 1%CaCl2作為助凝劑，室溫?cái)嚢瑁?00 r/min攪拌1 min，200 r/min攪拌5 min，80 r/min攪拌1 min），靜置10 min，以滴加去離子水為對(duì)照，吸取液面1～2 cm處的液體，采用紫外分光光度計(jì)在波長550 nm處測定吸光度值，計(jì)算絮凝劑對(duì)高嶺土懸液的絮凝率，其計(jì)算公式如下：

式中：A為對(duì)照的OD550nm值；B為樣品的OD550nm值。

1.3.4 菌株絮凝活性的篩選

初篩：選取誘變菌株，制備絮凝劑，并計(jì)算其對(duì)高嶺土懸液的絮凝率。

復(fù)篩：選取初篩誘變菌株中絮凝率≥80%的菌株，培養(yǎng)制備絮凝劑，并計(jì)算其對(duì)高嶺土懸液的絮凝率，選取絮凝率≥80%菌株作為研究對(duì)象[30]。

1.3.5 菌株生物量的測定

選取復(fù)篩誘變菌株中絮凝率≥80%的菌株，對(duì)其進(jìn)行同期發(fā)酵培養(yǎng)，通過測定菌體生長量來觀測菌株生長狀況[30]。

1.3.6 遺傳穩(wěn)定性分析

微生物的突變或退化極不穩(wěn)定，為檢驗(yàn)突變株在生產(chǎn)過程中的遺傳穩(wěn)定性，選取高絮凝突變株與原始黑曲霉xj接種于PDB培養(yǎng)基，裝液量為100 mL/250 mL，30 ℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)72 h，測定絮凝率，傳代培養(yǎng)7次后，考察發(fā)酵液絮凝活性的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP誘變致死率和突變率曲線

大量研究表明，在常壓室溫等離子體誘變儀誘變育種過程中，氣流量、照射距離、放電強(qiáng)度和照射時(shí)間是影響菌株誘變效率的顯著因素[31]。為保證等離子體在40 ℃以下進(jìn)行，設(shè)定氦氣（He）通氣量10 L/min、輻射距離2 mm、誘變功率100 W，在此條件下，等離子體誘變的輻射強(qiáng)度由工作時(shí)長決定[12，17]。不同誘變時(shí)間（0～300 s）條件下，黑曲霉xj的正突變率和致死率見圖1。

圖1 常壓室溫等離子體誘變時(shí)間對(duì)黑曲霉孢子致死率、正突變率的影響Fig.1 Effect of atmospheric and room temperature plasma mutation time on lethality and positive mutation rate of Aspergillus niger spore

由圖1可知，黑曲霉（Aspergillus niger）xj致死率與等離子體照射時(shí)間有明顯的劑量累積效應(yīng)，菌體的致死率隨著照射時(shí)間的延長而升高。當(dāng)照射時(shí)間＞90 s之后，黑曲霉xj致死率＞90%；當(dāng)照射時(shí)間為150～300 s，致死率接近100%。誘變時(shí)間過長容易致死，而誘變時(shí)間過短不易發(fā)生突變。黑曲霉xj正突變率對(duì)著誘變時(shí)間的延長呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)照射時(shí)間為90 s時(shí)，正突變率最高為27.8%。綜合考慮正突變率與致死率，選擇90 s為黑曲霉xj的最佳誘變時(shí)間。等離子體具有不定向性和隨機(jī)性，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[32]，菌株正突變率高，致死率＞90%時(shí)，菌落易分散、生長較好、挑選單菌落方便。因此，主要選取正突變率高、致死率＞90%的平板對(duì)絮凝劑高產(chǎn)菌株進(jìn)行篩選。

2.2 高產(chǎn)絮凝劑菌株的篩選

通過初篩共獲得416株對(duì)高嶺土懸液具有絮凝活性的菌株，部分菌株的絮凝率見表1。

由表1可知，突變菌株的絮凝率均高于出發(fā)菌株，其中30株突變菌株的絮凝率較高，均＞80%，較初始菌株提高了13.03%～25.99%。選取這30株突變菌株進(jìn)行復(fù)篩，進(jìn)一步測定絮凝率絮凝率＞80%的菌株，結(jié)果見表2。

表1 產(chǎn)絮凝劑突變菌株的初篩部分結(jié)果Table 1 Partial results of preliminary screening of flocculant-producing mutant strains

表2 產(chǎn)絮凝劑突變菌株的復(fù)篩結(jié)果Table 2 Results of secondary screening of flocculant-producing mutant strains

由表2可知，復(fù)篩后只有10株菌株絮凝率＞80%，表明初篩、復(fù)篩兩次都有較好活性。其中突變菌株A90-37的絮凝率最高，為（94.96±0.15）%，較原始菌株高27.03%；其次為突變菌株A90-34，絮凝率為（94.12±0.16）%，較原始菌株高26.19%。為進(jìn)一步研究復(fù)篩后菌株生長狀況與活性，對(duì)10株菌同步發(fā)酵，測定生物量，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，所有突變菌株的生長趨勢與原始菌株一致，且較原始菌株生長較快，其中菌株A90-34與A90-37的生長最為迅速，與其活性較高呈一定相關(guān)性。

圖2 原始菌和突變株的生長曲線Fig.2 Growth curves of original strain and mutant strain

2.3 高產(chǎn)絮凝劑菌株的遺傳穩(wěn)定性分析

微生物菌株的遺傳穩(wěn)定性在實(shí)際的發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用中至關(guān)重要，突變菌株在傳代生產(chǎn)絮凝劑過程中可能會(huì)發(fā)生回復(fù)突變，出現(xiàn)表型延遲或退化現(xiàn)象，從而導(dǎo)致高產(chǎn)誘變的菌株傳代后出現(xiàn)生產(chǎn)性能衰退[33]，因此需對(duì)菌株傳代過程進(jìn)行考察，確定其遺傳過程中是否具有穩(wěn)定性。為驗(yàn)證突變株遺傳穩(wěn)定性，對(duì)突變菌株進(jìn)行7代連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，并檢測每一代發(fā)酵液的絮凝活性，結(jié)果見表3。

由表3可知，突變菌株A90-34和A90-37的P值＞0.05，即菌株連續(xù)傳代7次，絮凝率無顯著差異（P＞0.05），具有較良好的遺傳穩(wěn)定性，且絮凝率較高，為92%～95%。

表3 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性Table 3 Genetic stability of mutant strains

3 結(jié)論

本研究采用常壓室溫等離子體（ARTP）技術(shù)誘變黑曲霉（Aspergillus niger）xj，最佳誘變照射時(shí)間為90 s，通過搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)篩選出2株高產(chǎn)絮凝劑的突變菌株A90-34和A90-37，其對(duì)高嶺土懸液的絮凝率分別為94.12%和94.96%，與原始菌株相比，分別提高26.19%、27.03%，連續(xù)傳代7次仍具有良好的遺傳穩(wěn)定性，絮凝率維持在92%～95%。