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        發(fā)酵肉制品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其表皮葡萄球菌生物胺相關(guān)基因分析

        2020-03-28 08:15:32楊海鶯沈雪梅鄭曉衛(wèi)陳歷水
        中國(guó)釀造 2020年1期
        關(guān)鍵詞:脫羧酶肉制品葡萄球菌

        劉 蕾,楊海鶯,沈雪梅,倪 偉,鄭曉衛(wèi),陳 博,陳歷水

        (1.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司,北京 102209;2.老年?duì)I養(yǎng)食品研究北京市工程實(shí)驗(yàn)室,北京 102209;3.營(yíng)養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102209)

        生物胺是一類含氮的低分子質(zhì)量堿性有機(jī)化合物的總稱,普遍存在于中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中,過(guò)量攝入會(huì)引起不良反應(yīng)。在發(fā)酵食品中,具有氨基酸脫酸酶活性的微生物對(duì)生物胺的形成至關(guān)重要[1-2]。常見(jiàn)的產(chǎn)生物胺的微生物有腸桿菌屬(Enterobacter)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、鏈球菌屬(Streptococcus)、酒球菌屬(Oenococcus)、梭菌屬(Clostridium)和假單胞菌屬(Pseudomonas)等,其中乳酸菌是產(chǎn)生物胺的主要菌種[3-4]。而發(fā)酵肉制品中生物胺的產(chǎn)生主要與微球菌屬(Micrococcus)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)有關(guān),其中肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)和魚(yú)發(fā)酵葡萄球菌(Staphylococcus piscifermentans)具有高氨基酸脫羧酶活性,能夠產(chǎn)生尸胺、2-苯乙胺、腐胺和組胺[5-7]。MARTUSCELLI M等[6]從香腸中分離得到51株木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus),發(fā)現(xiàn)其中的21株有體外氨基酸脫羧酶活性,只有7株菌株的酪胺、亞精胺和精胺產(chǎn)量>10 mg/kg,未檢測(cè)到組胺的產(chǎn)生[6]。

        目前,發(fā)酵食品中生物胺含量主要通過(guò)高效液相色譜(highperformanceliquidchromatography,HPLC)法進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)方法的前處理較為繁瑣,耗時(shí)長(zhǎng)。近年來(lái)有學(xué)者利用分子生物學(xué)的方法檢測(cè)微生物中產(chǎn)生物胺的相關(guān)酶的基因判斷其是否產(chǎn)生某種特定的生物胺。此方法具有快速、可靠、不依賴于培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn),并可在生物胺形成之前,檢測(cè)出產(chǎn)生物胺的基因,因此可分析出潛在的產(chǎn)生物胺危害[8-11]。不同種類的發(fā)酵肉制品中生物胺種類和含量有一定差別[12-13]。其中,酪胺、尸胺和組胺報(bào)道較多。酪胺是由酪氨酸脫羧酶(tyrosine decarboxylase,TDC)催化酪氨酸脫羧形成的;尸胺是由賴氨酸在賴氨酸脫羧酶(lysine decarboxylase,IDC)的催化下脫羧形成的;組胺是毒性最大的生物胺,由組氨酸脫羧酶(histidine decarboxylase,HDC)催化組氨酸脫羧形成的。

        本研究以云南臘腸為研究對(duì)象,首先,采用高通量測(cè)序技術(shù)研究發(fā)酵肉制品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性。然后利用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法及雙層顯色培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵肉制品中產(chǎn)生物胺的細(xì)菌進(jìn)行分離篩選,并基于16S rRNA序列進(jìn)行鑒定。最后,利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增與測(cè)序的方法對(duì)細(xì)菌中產(chǎn)組胺、酪胺和尸胺的相關(guān)基因進(jìn)行特異性篩選,以期建立發(fā)酵肉制品中生物胺的快速篩選機(jī)制,為基因檢測(cè)技術(shù)在發(fā)酵食品安全性檢測(cè)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        1.1.1 材料

        云南臘腸:云南市場(chǎng)購(gòu)買。

        1.1.2 培養(yǎng)基

        MRS液體培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g,牛肉膏10.0 g,葡萄糖20.0 g,酵母浸粉5.0 g,檸檬酸氫二銨2.0 g,無(wú)水乙酸鈉5.0 g,磷酸氫二鉀2.0 g,吐溫80 1.0 mL,MgSO4·7H2O 0.58 g,MnSO4·4H2O 0.2 g,蒸餾水1 000 mL,調(diào)節(jié)pH值至6.80。121 ℃高壓滅菌15 min。

        MRS固體培養(yǎng)基:在MRS液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加20.0 g瓊脂。121 ℃高壓滅菌15 min。

        雙層顯色下層培養(yǎng)基[14]:蛋白胨5.0 g,酵母浸粉5.0 g,牛肉膏5.0 g,NaCl 2.5 g,葡萄糖0.5 g,吐溫80 1.0 mL,MgSO40.4 g,MnSO40.03 g,K2HPO42.0 g,檸檬酸三銨2.0 g,CaCO30.1 g,F(xiàn)eSO40.04 g,維生素B1(vitamin B1,VB1)0.01 g,磷酸吡哆醛0.05 g,瓊脂20.0 g,色氨酸、精氨酸、賴氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸各5.0 g,蒸餾水1 000 mL,pH值5.2。雙層顯色上層培養(yǎng)基:溴甲酚紫0.06 g,瓊脂20.0 g,蒸餾水1 000 mL,pH值5.2。121 ℃高壓滅菌15 min,以不加氨基酸的雙層顯色培養(yǎng)基為對(duì)照。

        1.1.3 引物

        PCR引物見(jiàn)表1[10,15-17],由北京美吉桑格生物醫(yī)藥科技有限公司合成。

        表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequences used in the study

        1.1.4 化學(xué)試劑

        脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)提取試劑盒、KOD高保真酶、引物、DNA Marker:上海生工生物工程有限公司;Axy Prep DNA凝膠回收試劑盒:德國(guó)AXYGEN公司;Quant-iTPicoGreen熒光定量試劑盒:美國(guó)Life Technologies公司;TruSeq DNA建庫(kù)試劑盒、MiSeq上機(jī)試劑盒:美國(guó)Illumina公司。FastPfu Polymerase(5.0 U)、EXTaq酶(5.0 U)、脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTP)、5×FastPfu buffer、10×EXTaqBuffer:日本TaKaRa公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        ZDX35BI滅菌鍋:上海申安醫(yī)療器械廠;DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;H1650-W醫(yī)用離心機(jī):湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;SW-CJ-2D超凈工作臺(tái):蘇州凈化設(shè)備有限公司;MG96+型PCR儀:杭州郎基科學(xué)儀器有限公司;JY04S-3C凝膠成像儀、JY300C電泳系統(tǒng):北京君意電泳設(shè)備有限公司;HH-2恒溫水浴鍋:上海比郎儀器有限公司;625-00203730XL測(cè)序儀:美國(guó)ABI公司;810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī):德國(guó)Eppendorf公司;SpectraMax M5酶標(biāo)儀:美國(guó)MolecularDevice公司;Miseq基因組測(cè)序儀:美國(guó)Illumina 公司;QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng):美國(guó)Promega公司。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1 發(fā)酵肉制品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

        (1)PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)序列

        采用DNA提取試劑盒提取臘腸的總DNA,以其為模板,采用上游引物338F和下游引物806RPCR擴(kuò)增細(xì)菌16SrRNA的V3-V4區(qū)序列。PCR擴(kuò)增體系:5×FastPfu buffer 4.0 μL,2.5 mmol/L dNTPs Mix 2.0 μL,上下游引物(5 μmol/L)各0.8 μL,F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL,BSA 0.2 μL,模板DNA 10.0 ng,加雙蒸水(ddH2O)補(bǔ)至終體積為20 μL。PCR擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,共27個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸10 min。使用Axy Prep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,采用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

        (2)文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序

        根據(jù)電泳結(jié)果,對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量分析,采用TruSeq DNA建庫(kù)試劑盒構(gòu)建文庫(kù)。采用Miseq平臺(tái)雙端PE 300測(cè)序策略,使用上機(jī)試劑盒將文庫(kù)加入Miseq測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

        (3)生物信息學(xué)分析和數(shù)據(jù)分析

        對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾拼接處理后,得到優(yōu)化序列。在97%的相似水平下,利用vsesion 7.1 Usearch(http://drive5.com/uparse/)軟件平臺(tái),劃分可操作分類單元(operational taxonomicunit,OTU),并挑取OTU的代表序列。采用RDPclassifier貝葉斯算法,設(shè)置置信度閾值為0.7,基于Silva數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.arb-silva.de)對(duì)OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析,并在屬水平上統(tǒng)計(jì)樣品的細(xì)菌群落組成。

        1.3.2 發(fā)酵肉制品中產(chǎn)生物胺細(xì)菌的篩選與鑒定

        (1)細(xì)菌的分離純化

        取臘腸1.0 g于9.0 mL無(wú)菌生理鹽水中,充分振蕩,用無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7),并涂布于MRS固體培養(yǎng)基上,37 ℃條件下培養(yǎng)48 h。根據(jù)菌落形態(tài)、大小、顏色等挑取單菌落,-20 ℃保藏。

        (2)產(chǎn)生物胺細(xì)菌的篩選

        將分離純化的菌株接種到雙層顯色下層培養(yǎng)基上,37℃條件下培養(yǎng)48 h,無(wú)菌條件下,在下層培養(yǎng)基上倒一層上層培養(yǎng)基(50 ℃),顯色,并在5 min內(nèi)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。以不接種菌株的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照,顯紫色的為陽(yáng)性(產(chǎn)生物胺菌),不變色即黃色為陰性(不產(chǎn)生物胺菌)[18-19]。

        (3)產(chǎn)生物胺細(xì)菌的鑒定

        將產(chǎn)生物胺菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃條件下培養(yǎng)12 h,取1 mL菌液,10 000 r/min離心1 min,棄上清,取菌體沉淀,參照DNA提取試劑盒的步驟提取基因組DNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),于-20 ℃條件下保存。以提取的DNA為模板,采用引物27F及1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系:10×ExTaqbuffer 5.0 μL,2.5 mmol/L dNTPs Mix 4.0 μL,上下游引物各2.0 μL,ExTaq酶0.5 μL,模板DNA 2.0 μL,ddH2O補(bǔ)至終體積為50μL。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性3min;94℃變性30s,54℃退火30s,72℃延伸1.5min,共24個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后,送去北京美吉桑格生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)搜索。

        1.3.3 產(chǎn)生物胺細(xì)菌功能基因的擴(kuò)增及測(cè)序

        選擇產(chǎn)生物胺能力較強(qiáng)的菌株(選擇雙層顯色培養(yǎng)基中紫色較深的菌株),進(jìn)行功能基因檢測(cè)。PCR擴(kuò)增:以提取的細(xì)菌基因組DNA為模板,采用表1中的引物PCR擴(kuò)增ldc、hdc和tdc基因片段。PCR擴(kuò)增體系:10×ExTaqBuffer 5.0 μL,2.5 mmol/L dNTPs Mix 4.0 μL,上下游引物各2.0 μL,ExTaq酶0.5 μL,模板DNA 2.0 μL,ddH2O補(bǔ)至終體積為50 μL。PCR擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性45 s,hdc基因48 ℃退火45 s、ldc基因50 ℃退火45 s、tdc基因50 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,共35個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

        系統(tǒng)進(jìn)化分析:將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送去北京美吉桑格生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)搜索,選取與序列具有同源性該菌屬內(nèi)有代表性的多種模式菌株基因序列,利用MEGA7.0軟件中的鄰接(neighbor joining,NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),其中Bootsdrap 1 000次檢驗(yàn)進(jìn)化樹(shù)置信度。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 發(fā)酵肉制品中微生物群落結(jié)構(gòu)分析

        通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分別對(duì)發(fā)酵肉制品樣本中細(xì)菌的16S rRNA V3-V4區(qū)序列進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)濾拼接處理后得到細(xì)菌序列72 835條,樣品質(zhì)控Q20>96%,Q30>89%(Q20和Q30是堿基質(zhì)量值,其中Q20為堿基識(shí)別出錯(cuò)率為1/100,堿基識(shí)別精度為0.99;Q30為堿基識(shí)別出錯(cuò)率為1/1 000,堿基識(shí)別精度為0.999),發(fā)酵肉制品樣品稀釋曲線見(jiàn)圖1。

        圖1 發(fā)酵肉制品中細(xì)菌多樣性測(cè)序稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve for the bacteria diversity sequencing of fermented meat sample

        由圖1可知,隨著測(cè)序數(shù)量的增加,OUT數(shù)先急劇增加后趨于平緩,說(shuō)明測(cè)序質(zhì)量和測(cè)序深度均滿足實(shí)驗(yàn)需求,可用于后續(xù)結(jié)果分析。在97%的相似水平下對(duì)OTU進(jìn)行分類學(xué)分析,結(jié)果見(jiàn)圖2。

        由圖2可知,發(fā)酵肉制品樣本中細(xì)菌98.59%為厚壁菌門(Firmicutes)的葡萄球菌屬(Staphylococcus)。傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品的加工過(guò)程均有微生物參與,但由于不同發(fā)酵肉制品的不同原料、地區(qū)來(lái)源、加工工藝、貯藏條件等使最終產(chǎn)品中微生物組成有較大差別。我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中較常見(jiàn)的微生物有腸細(xì)菌(Enterobacteria)、乳酸菌、葡萄球菌(Staphylococcus)和嗜冷桿菌(Psychrobacter)的某些種,國(guó)外的發(fā)酵香腸中分離出的微生物主要有腸細(xì)菌、乳酸菌、葡萄球菌、肉桿菌(Carnobacterium)以及酵母菌的某些種[20-21]。

        圖2 基于屬水平發(fā)酵肉制品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Bacterial community structure in fermented meat based on genus level

        2.2 發(fā)酵肉制品中產(chǎn)生物胺細(xì)菌的篩選與鑒定

        通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法從發(fā)酵肉制品中共分離得到52株細(xì)菌,通過(guò)雙層顯色培養(yǎng)基從中篩選到43株產(chǎn)生物胺的陽(yáng)性菌株。通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得43株菌株的16S rRNA序列,在NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì),結(jié)果見(jiàn)表2。

        表2 發(fā)酵肉制品中產(chǎn)生物胺細(xì)菌16S rRNA序列比對(duì)結(jié)果Table 2 Alignment results of 16S rRNA sequences of biogenic amines-producing bacteria in fermented meat

        續(xù)表

        由表2可知,發(fā)酵肉制品中產(chǎn)生物胺的細(xì)菌主要為表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。有報(bào)道稱,葡萄球菌在發(fā)酵肉制品中主要產(chǎn)生蛋白酶和脂肪酶,對(duì)發(fā)酵肉制品的風(fēng)味形成和色澤穩(wěn)定起重要作用[22]。另外,有報(bào)道稱,表皮葡萄球菌可產(chǎn)生生物胺氧化酶,對(duì)已產(chǎn)生的生物胺進(jìn)行降解,從而降低生物胺的積累[20]。在本研究中,表皮葡萄球菌可能對(duì)發(fā)酵肉制品的品質(zhì)有促進(jìn)作用,同時(shí)也是產(chǎn)生物胺的主要微生物。

        2.3 發(fā)酵肉制品中產(chǎn)生物胺細(xì)菌功能基因檢測(cè)

        2.3.1 賴氨酸脫羧酶編碼基因ldc的確定與分析

        在產(chǎn)生物胺微生物的分離過(guò)程中,利用的是雙層顯色培養(yǎng)基法。在顯色過(guò)程中,不同產(chǎn)生物胺的微生物顯示紫色的能力有顯著差別,選擇產(chǎn)紫色較深的微生物即生物胺產(chǎn)生能力較強(qiáng)的微生物(菌株5、8、10、12、21、31和45),進(jìn)行功能基因檢測(cè)。采用革蘭氏陽(yáng)性菌的賴氨酸脫羧酶引物L(fēng)DC1和LDC2 PCR擴(kuò)增以上7株菌株的ldc基因,結(jié)果見(jiàn)圖3。

        由圖3可知,7株細(xì)菌PCR擴(kuò)增后均出現(xiàn)陽(yáng)性條帶。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序及序列比對(duì)顯示,7株細(xì)菌的ldc基因序列與表皮葡萄球菌賴氨酸脫羧酶基因序列的一致性>97%。選取同源性較高的該菌屬內(nèi)有代表性的多種模式菌株的ldc基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),結(jié)果見(jiàn)圖4。

        圖3 發(fā)酵肉制品中產(chǎn)生物胺細(xì)菌賴氨酸脫羧酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 PCR products of lysine decarboxylase gene of biogenic amines-producing bacteria in fermented meat

        圖4 基于賴氨酸脫羧酶基因產(chǎn)生物胺細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of biogenic amines-producing bacteria based on lysine decarboxylase gene

        由圖4可知,同一菌種來(lái)源的賴氨酸脫羧酶相似性較高,因此,本研究中采用的引物及PCR擴(kuò)增條件可用于表皮葡萄球菌中賴氨酸脫羧酶基因的檢測(cè)。

        2.3.2 組氨酸脫羧酶編碼基因hdc的確定與分析

        采用革蘭氏陽(yáng)性菌的組氨酸脫羧酶引物HDC1和HDC2 PCR擴(kuò)增菌株5、8、10、12、21、31和45的hdc基因,結(jié)果見(jiàn)圖5。

        由圖5可知,7株細(xì)菌PCR擴(kuò)增后均出現(xiàn)陽(yáng)性條帶,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序及序列比對(duì)顯示,7株細(xì)菌的hdc基因序列與表皮葡萄球菌的組氨酸脫羧酶基因序列的一致性>98%。選取同源性較高的該菌屬內(nèi)有代表性的多種模式菌株的hdc基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),結(jié)果見(jiàn)圖6。

        圖5 發(fā)酵肉制品中產(chǎn)生物胺細(xì)菌組氨酸脫羧酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.5 PCR products of histidine decarboxylase gene of biogenic amines-producing bacteria in fermented meat

        圖6 基于組氨酸脫羧酶基因產(chǎn)生物胺細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of biogenic amines-producing bacteria based on histidine decarboxylase gene

        由圖6可知,不同菌種來(lái)源的組氨酸脫羧酶的相似性較高。因此,本研究中采用的引物及PCR擴(kuò)增條件不僅可用于表皮葡萄球菌中組氨酸脫羧酶基因的檢測(cè),還可擴(kuò)展到其他菌種來(lái)源的組氨酸脫羧酶基因檢測(cè)。

        2.3.3 酪氨酸脫羧酶編碼基因tdc的確定與分析

        利用酪氨酸脫羧酶引物TDC1和TDC2 PCR擴(kuò)增菌株5、8、10、12、21、31和45的酪氨酸脫羧酶基因,結(jié)果見(jiàn)圖7。

        圖7 發(fā)酵肉制品中產(chǎn)生物胺細(xì)菌酪氨酸脫羧酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.7 PCR products of tyrosine decarboxylase gene of biogenic amines-producing bacteria in fermented meat

        由圖7可知,只有菌株12和21 PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)了陽(yáng)性條帶。陽(yáng)性條帶經(jīng)測(cè)序及序列比對(duì)顯示,上述菌株基因序列與表皮葡萄球菌酪氨酸脫羧酶基因序列的一致性>98%。由于本研究中采用的引物擴(kuò)增效果較差,因此,后期需進(jìn)行PCR擴(kuò)增引物的篩選以及擴(kuò)增條件的改變,以找到適合表皮葡萄球菌酪氨酸脫羧酶基因檢測(cè)的引物及條件。

        3 結(jié)論

        通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)發(fā)酵肉制品中細(xì)菌的16S rRNA V3-V4區(qū)序列進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明,發(fā)酵肉制品中細(xì)菌主要為厚壁菌門(Firmicutes)的葡萄球菌屬(Staphylococcus)。通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法從發(fā)酵肉制品中共分離得到52株細(xì)菌,利用雙層顯色培養(yǎng)基從中篩選出43株產(chǎn)生物胺細(xì)菌,且主要為表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis),與細(xì)菌多樣性結(jié)果一致。對(duì)7株高產(chǎn)生物胺的表皮葡萄球菌的賴氨酸脫羧酶、組氨酸脫羧酶和酪氨酸脫羧酶編碼基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果表明,7株表皮葡萄球菌均含有基因hdc和ldc,為兩種生物胺的快速檢測(cè)提供理論基礎(chǔ)。

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