王 強，王玉榮，陳江紅，張振東，蔡 偉，郭 壯

（湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053）

豆豉是黑豆或黃豆等在細菌、真菌以及酶的作用下發(fā)酵而成的一類特色食品[1]。據(jù)記載，豆豉在我國的制作歷史可追溯至秦漢時期，目前在我國湖南、湖北、四川、重慶、云南和貴州等地依然保留著制作和食用豆豉的習(xí)慣[2]。傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉制作方法較為粗放，產(chǎn)品品質(zhì)除受原料和工藝的影響外，環(huán)境中的微生物對豆豉滋味、氣味、色澤和營養(yǎng)成分的形成也發(fā)揮著獨特的作用[3-5]。

杜霞等[6-7]采用傳統(tǒng)方法從江西發(fā)酵型豆豉和貴州三穗細菌型豆豉中均分離出芽孢桿菌屬（Bacillus）菌株；任璐等[8]從永川和三臺毛霉型豆豉中分離出產(chǎn)β-葡萄糖苷酶、纖維素酶和蛋白酶能力不同的2株總狀毛霉（Mucor racemosus）；LIU C J等[9]采用分離純化的方法從云南省六個不同地區(qū)采集的30份傳統(tǒng)發(fā)酵咸豆豉中分離出隸屬于乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、片球菌屬（Pediococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）和芽孢桿菌屬等不同細菌屬的226株菌株。這些研究均采用的是基于純培養(yǎng)的微生物學(xué)分離鑒定方法，易受微生物種類、操作方法及培養(yǎng)條件的限制而不能全面反映豆豉中微生物多樣性。近年來，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gel gradient electrophoresis，PCR-DGGE）和高通量測序等非培養(yǎng)技術(shù)因具有操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確、直觀的特點逐漸被應(yīng)用到豆豉微生物多樣性的研究中。CHEN T等[10-11]分別使用DGGE和高通量測序技術(shù)對江西地區(qū)豆豉中微生物進行研究，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)細菌主要為乳酸球菌屬（Lactococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和乳桿菌屬，真菌主要為橫梗霉屬（Lichtheimia）；CHEN C等[12]采用PCR-DGGE技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，吉林地區(qū)豆豉中的優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬。

為了進一步探討不同地區(qū)產(chǎn)豆豉細菌多樣性的差異，本研究從湖南省湘西土家族苗族自治州龍山縣采集了5份細菌型豆豉，在前期研究[13]基礎(chǔ)上，使用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對其中的細菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)組成進行解析，并采用多元統(tǒng)計學(xué)手段對其與當(dāng)陽豆豉細菌多樣性間的差異進行分析，以期為后續(xù)細菌型豆豉微生物研究提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

龍山豆豉：采集自湖南省湘西土家苗族自治州龍山縣（109°10′～110°53′E，28°45′～29°30′N），共5份，編號為LSDC1、LSDC2、LSDC3、LSDC4和LSDC5。所有的豆豉均為細菌型豆豉，制作時間為25～30 d。采樣時取30 g左右樣本分裝于無菌離心管中運回實驗室，并置于-80 ℃冰箱中備用。

1.1.2 化學(xué)試劑

QIAGEN脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphates，dNTPs）Mix、5×Trans StartTM、高保真DNA聚合酶（5 U/μL）、Fast Pfu Buffer：北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA 1000分析試劑盒：美國Agilent公司；111860瓊脂糖：香港基因有限公司；DL 15 000 DNA Marker、6×Lodding Buffer：武漢天一輝遠生物科技有限公司；DP214通用型DNA純化回收試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DW-86L626醫(yī)用低溫保存箱：青島海爾特種電器有限公司；5810R臺式高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；ABI Veriti 96孔梯度PCR儀：美國Applied Biosystems公司；DCodeTMSystem梯度凝膠電泳儀、PowerPacTMBasic穩(wěn)壓穩(wěn)流儀、UVP CDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國Bio Rad公司；ND-2000C微量紫外分光光度計：美國Thermo公司；DYY-12電泳儀：北京六一儀器廠；MiSeq PE300高通量測序平臺：美國Illumina公司；HBM-400B拍擊式無菌均質(zhì)器：天津市恒奧科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 龍山豆豉樣本前處理及總DNA提取

取豆豉樣品10 g加入40 mL無菌蒸餾水，使用拍擊器拍擊5 min后在4 ℃、300 r/min條件下離心10 min，去除雜質(zhì)，取上清液。采用DNA基因組提取試劑盒提取樣本的總DNA，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整度。

1.3.2 16S rDNA基因的PCR擴增及測序

以檢測合格的DNA為模板，338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）為引物進行PCR擴增，PCR擴增體系和程序參照YANG F等[14]的方法并略作改動。PCR擴增體系：模板10 ng，2.5 mmol/L dNTPs mix 2 μL，5×PCR Buffer 4 μL，5 μmol/L正向和反向引物各0.8 μL，5 U/μL DNA 聚合酶0.4 μL以及無菌雙蒸水（ddH2O）11 μL。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共循環(huán)30次；72 ℃再延伸10 min。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產(chǎn)物進行測定，將合格的產(chǎn)物進行清潔后使用Illumina Miseq系統(tǒng)進行測序。

1.3.3 生物信息學(xué)分析

參照文獻[15]的方法將從Illumina MiSeq平臺中獲得的成對序列合成一條完整序列，根據(jù)相應(yīng)標(biāo)記將各序列分配至不同樣本中，然后切除正反引物并進行序列質(zhì)量控制。將質(zhì)控合格的有效序列上傳至QIIME（V1.9.1）分析平臺[16]，使用兩步UCLUST算法[17]分別根據(jù)100%和97%相似度為標(biāo)準(zhǔn)將序列歸類至不同的操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）中，然后挑選代表性序列與Greengenes數(shù)據(jù)庫[18]進行比對，明確其微生物學(xué)分類地位。

將平均相對含量＞1.0%的細菌門或?qū)俣x為優(yōu)勢細菌門或優(yōu)勢細菌屬，將在各樣品中均存在的細菌屬或OTU定義為核心細菌屬或核心OTU，未鑒定出的序列定義為unclassifiled。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

使用主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）和非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）等Beta多樣性指數(shù)分析龍山豆豉與當(dāng)陽豆豉細菌差異性；利用R3.5.0中的ggplot和reshape包對龍山豆豉優(yōu)勢細菌門和屬進行分析并繪制優(yōu)勢細菌門屬相對含量圖；使用Origin 2017繪制核心OTU相對含量堆積柱狀圖及龍山和當(dāng)陽兩組豆豉差異箱型圖，并使用曼惠尼（Mann-Whitney）分析中的蒙特卡羅置換檢驗（Monte Carlo permutation test）判斷兩組樣本差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍山豆豉細菌多樣性分析

通過質(zhì)控，從5個龍山豆豉樣本中共檢測出326 820條高質(zhì)量序列，平均每個樣品65 364條序列。在100%序列相似性下，采用UCLUST算法將所有序列劃分為162 887個OTU，在97%序列相似性下又進一步將所有序列歸入15 641個OTU，經(jīng)比對這些OTU可劃分為18個門、49個綱、75個目、148個科以及249個屬。

2.2 龍山豆豉細菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 基于門水平龍山豆豉細菌群落結(jié)構(gòu)分析

圖1 龍山豆豉樣品中優(yōu)勢細菌門及其相對含量Fig.1 Dominant bacteria phyla and its relative content in Longshan douchi samples

由圖1可知，龍山豆豉中的優(yōu)勢細菌門為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和擬桿菌門（Bacteroidetes），其中，F(xiàn)irmicutes的平均相對含量（77.43%）最高，占絕對優(yōu)勢。除含有較多的Firmicutes外，樣品LSDC2中含有41.48%的細菌隸屬于Proteobacteria，樣品LSDC3中有26.91%的細菌隸屬于Actinobacteria，且在樣品LSDC2中，Proteobacteria的相對含量高于Firmicutes（35.98%）。值得一提的是，在樣品LSDC5中僅檢測出兩個細菌門，即Firmicutes和Proteobacteria，相對含量分別為99.99%和0.01%，說明在龍山豆豉發(fā)酵過程中起主導(dǎo)作用的細菌隸屬于厚壁菌門。

2.2.2 基于屬水平龍山豆豉細菌群落結(jié)構(gòu)分析

圖2 龍山豆豉樣品中優(yōu)勢細菌屬及其相對含量Fig.2 Dominant bacteria genera and its relative content in Longshan douchi samples

由圖2可知，龍山豆豉樣品中的優(yōu)勢細菌屬為芽孢桿菌屬（Bacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、片球菌屬（Pediococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、棒狀桿菌屬（Corynebac-terium）、腸球菌屬（Enterococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、解硫胺素芽孢桿菌屬（Aneurinibacillus）和Bavariicoccus，其平均相對含量分別為21.46%、15.83%、8.69%、8.38%、7.62%、7.14%、6.69%、4.65%、1.19%、1.10%。其中Bacillus、Pediococcus和Staphylococcus為核心優(yōu)勢細菌屬。不同樣品中各優(yōu)勢細菌屬的相對含量不同，樣品LSDC1中以Staphylococcus和Bacillus為主，樣品LSDC2中以Pseudomonas為主，樣品LSDC3中以Weissella和Corynebacterium為主，樣品LSDC4中以Weissella和Pediococcus為主，特別地，樣品LSDC5中Bacillus的相對含量高達83.47%，占絕對優(yōu)勢。各樣品中不可鑒定到屬水平的序列的相對含量較為相近，平均相對含量為9.55%，說明龍山豆豉中仍有大量細菌未被發(fā)掘。李世瑞等[19]采用454焦磷酸測序技術(shù)分析采集自湖南的曲霉型豆豉不同發(fā)酵階段細菌多樣性，發(fā)現(xiàn)Weissella、Bacillus、Staphylococcus、Lactococcus、Enterococcus和Pseudomonas都有檢測出，與本研究結(jié)果較為相似。

豆豉樣品中的核心OTU有12個，僅占OTU總數(shù)的0.08%，而其包含的序列有43 069條，占總序列數(shù)的13.18%，說明龍山豆豉中含有較多核心菌群。因此，進一步對核心OTU分類及其在各樣品中的分布情況進行分析，結(jié)果見圖3。

圖3 豆豉樣品中核心OTU及其相對含量Fig.3 Core OTU and its relative content in Longshan douchi samples

由圖3可知，12個核心OUT為OTU13900、OTU9433、OTU14842、OTU1238、OTU6072、OTU8697、OTU12939、OTU7293、OTU436、OTU8673、OTU2592和OTU15057，其主要為隸屬于Firmicutes 的Bacillus、Enterococcus、Lactobacillus、Staphylococcus和Weissella，隸屬于Proteobacteria的腸桿菌屬（Enterobacter）和Pseudomonas，以及隸屬于Actinobacteria的假桿菌屬（Pseudoclavibacter）。核心OTU在各樣品中的分布差異較大，樣品LSDC1中的OTU8673（Staphylococcus）、樣 品LSDC2 中 的OTU436（Pseudomonas）、樣 品LSDC4中的OTU1238（Enterobacter）和樣品LSDC5 中的OTU13900（Bacillus）的相對含量明顯高于其他樣本，這與圖1和圖2分析結(jié)果基本一致。樣品LSDC1～LSDC5中，核心OTU占各樣品中OTU總數(shù)的比例分別為0.27%、0.23%、0.27%、0.29%和0.59%，其所包含的序列在各樣本中的累積相對含量分別為23.19%、9.90%、4.92%、10.77%和17.48%，說明不同樣品中除含有大量核心細菌外還含有多種特有細菌菌群。

2.3 龍山豆豉與當(dāng)陽豆豉間細菌差異性分析

有研究表明，地理因素對豆豉中微生物豐度可能存在一定影響[20]。采用基于UniFrac距離矩陣的主坐標(biāo)分析對采集自湖南龍山和湖北當(dāng)陽的豆豉進行分析，結(jié)果見圖4。

圖4 基于非加權(quán)（A）和加權(quán)（B）UniFrac距離兩個地區(qū)豆豉樣品細菌菌群主坐標(biāo)分析結(jié)果Fig.4 Principal coordinates analysis results of bacterial community in douchi samples from two regions based on unweighted (A)and weighted (B) UniFrac distance

由圖4可知，當(dāng)不考慮各樣本中的菌群豐度時（圖4A），第一和第二主成分的貢獻率分別為32.34%和14.13%，龍山豆豉樣本（LSDC1～LSDC5）分布在第一、三和四象限，且除樣品LSDC5外，其他樣本較集中，而當(dāng)陽豆豉樣本（DC1～DC6）全部分布在第二象限，在PC1維度上能將當(dāng)陽豆豉與除LSDC5以外的龍山豆豉樣本很好的區(qū)分開，兩個地區(qū)樣本間無交疊現(xiàn)象。將細菌在各樣本中的相對含量納入考慮范圍對樣本差異進行分析時（圖4B），第一主成分的貢獻率為63.77%，第二主成分的貢獻率為27.75%，二者累積貢獻率高達91.52%，龍山豆豉樣本較非加權(quán)的算法更為分散，在四個象限中均有分布，而當(dāng)陽豆豉樣本更為集中，仍只分布在第二象限，兩類樣本間有交疊部分。說明兩類豆豉樣本細菌群落結(jié)構(gòu)存在差異，且龍山豆豉樣本間距離比當(dāng)陽豆豉樣本間距離更大。進一步使用基于UniFrac的UPGMA對樣本間距離遠近進行分析，結(jié)果見圖5。

圖5 兩地區(qū)豆豉樣本UPGMA分析結(jié)果Fig.5 UPGMA analysis results of douchi samples from two regions

由圖5可知，龍山豆豉樣品中除樣品LSDC3和LSDC4外，其余樣本各據(jù)一個分支，且樣品LSDC2的分支長度最長，樣品LSDC1和LSDC5較近，說明樣品LSDC2與其他樣本間距離最遠，這與圖4（B）分析結(jié)果一致。由圖5可知，當(dāng)陽豆豉全部集中在聚類樹末端且各樣本分支長度遠小于龍山豆豉，這說明龍山豆豉樣本間距離要大于當(dāng)陽豆豉，為了對這一結(jié)論進行驗證，對兩個地區(qū)豆豉樣品間的差異性進行分析，結(jié)果見圖6。

圖6 兩個地區(qū)豆豉樣品間差異性分析結(jié)果Fig.6 Difference analysis results of douchi samples from two regions

由圖6可知，龍山豆豉各樣本間的距離為0.39±0.09，當(dāng)陽豆豉各樣本間的距離為0.03±0.01，表明龍山豆豉組內(nèi)各樣本細菌群落結(jié)構(gòu)差異性要比當(dāng)陽豆豉組內(nèi)差異性大。采用Mann-Whitney分析中的Monte Carlo permutation test發(fā)現(xiàn)，兩組樣本差異極顯著（P＜0.01）。本研究進一步對不同地區(qū)豆豉中優(yōu)勢細菌屬相對含量的差異性進行了分析，結(jié)果見圖7。

由圖7可知，兩個地區(qū)豆豉中優(yōu)勢細菌屬共有10個，分別為Bacillus、Weissella、Staphylococcus、Pediococcus、Corynebacterium、Enterococcus、Pseudomonas、Leuconostoc、Aneuri-nibacillus和Bavariicoccus，其在龍山豆豉樣品中的平均相對含量分別為（21.46±35.80）%、（15.83±11.49）%、（8.38±15.38）%、（8.69±10.72）%、（7.62±9.86）%、（7.14±6.72）%、（6.69±14.37）%、（4.65±5.09）%、（1.19±2.66）%和（1.10±1.17）%，其在當(dāng)陽豆豉中的平均相對含量分別為（95.26±5.33）%、（0.23±0.51）%、（1.12±2.07）%、（0.30±0.73）%、（0.43±0.79）%、（0.06±0.12）%、（0.02±0.03）%、（0.01±0.02）%、（0.02±0.04）%和0。除Bacillus外，其余9個細菌屬在龍山豆豉中的平均相對含量都遠高于當(dāng)陽豆豉，其中Bacillus、Pediococcus和Bavariicoccus在兩組樣本中的分布情況差異極顯著（P＜0.01）。代表龍山豆豉各細菌屬分布的箱體總體較為狹長，最小值與最大值之間相隔較遠，與之相比，代表當(dāng)陽豆豉細菌屬分布的箱體更為集中。表明龍山豆豉細菌多樣性較高且個體間差異性較大，而當(dāng)陽豆豉樣本間細菌多樣性差異性更小。造成兩地區(qū)豆豉細菌群落結(jié)構(gòu)差異的主要細菌屬為Bacillus、Pediococcus和Bavariicoccus。

圖7 兩地區(qū)豆豉樣品間差異分析箱型圖Fig.7 Box diagram of difference analysis of douchi samples from two regions

3 結(jié)論

通過本研究發(fā)現(xiàn)龍山豆豉的優(yōu)勢細菌門有5個，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和擬桿菌門（Bacteroidetes），且Firmicutes為核心菌門；優(yōu)勢細菌屬有10個，分別為芽孢桿菌屬（Bacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、片球菌屬（Pediococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、腸球菌屬（Enterococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、解硫胺素芽孢桿菌屬（Aneurinibacillus）和Bavariicoccus，平均相對含量分別為21.46%、15.83%、8.69%、8.38%、7.62%、7.14%、6.69%、4.65%、1.19%和1.1%。樣本中的核心細菌屬為Bacillus、Pediococcus和Staphylococcus構(gòu)成。龍山豆豉樣本間細菌差異性要大于當(dāng)陽豆豉樣本間差異，且兩地區(qū)樣本間細菌多樣性差異極顯著（P＜0.01），在兩類樣本的優(yōu)勢細菌屬中Bacillus、Pediococcus和Bavariicoccus是造成其細菌群落結(jié)構(gòu)差異的主要細菌屬。