趙寶成 王振軍 韓加剛 馬華崇 禹三水

脂肪組織中存在具有自我更新和多向分化潛能的間質(zhì)干細胞，且脂肪來源廣泛，獲取容易，對機體損傷小。對脂肪干細胞(adipose derived stem cells，ADSCs)的研究是近年來干細胞研究的熱點之一。在創(chuàng)傷修復(fù)過程中，成纖維細胞在創(chuàng)傷早期遷移至創(chuàng)傷區(qū)域，促進血管的再生及肉芽組織的形成，在創(chuàng)傷修復(fù)后期，成纖維細胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細胞，利于傷口的收縮及疤痕的形成。因此，成纖維細胞的遷移與增殖是創(chuàng)傷修復(fù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究將原代培養(yǎng)豬脂肪干細胞及成纖維細胞并進行相關(guān)實驗，觀察脂肪干細胞能否促進成纖維細胞的增殖和遷移。

材料與方法

一、實驗材料

1.實驗動物：雄性長白豬1只，體重約30 kg，購于首都醫(yī)科大學(xué)。

2.實驗試劑：高糖DMEM、胎牛血清及0.05%胰蛋白酶購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞中心；FITC-CD44、FITC-CD105購于Abcom公司；FITC-CD34、FITC-CD45購于上海晶天生物有限公司；豬轉(zhuǎn)化生長因子、血小板衍生的生長因子和血管內(nèi)皮生長因子ELISA試劑盒購于上海晶天生物有限公司，兔抗HSP-47(FITC)購于上海晶天生物有限公司。

二、方法

1.脂肪干細胞的原代培養(yǎng)、鑒定：(1)脂肪取材：該實驗開展于2018年1月，動物實驗于首都醫(yī)科大學(xué)動物實驗室內(nèi)操作完成。全身麻醉成功后，備皮、消毒、鋪巾，取項背部皮下脂肪約10 g，將脂肪組織置入保鮮液中，縫合手術(shù)切口，動物送回飼養(yǎng)籠中，脂肪組織在2 小時內(nèi)送至實驗室進行細胞原代培養(yǎng)。(2)細胞原代培養(yǎng)：在超凈臺中將脂肪組織在D-Hank’s 液中漂洗3次，盡量去除結(jié)締組織及血管內(nèi)皮，將其剪成1 mm3的組織塊。將剪碎的組織置于高糖DMEM培養(yǎng)基中，加入0.075%的Ⅰ型膠原酶，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90分鐘。將消化后的液體吸出，70目濾網(wǎng)過濾，移至離心管中，2000 r/min離心6分鐘，棄上層液體，D-Hank’s液重懸細胞，離心，重復(fù)2次。離心后棄掉漂浮的脂肪細胞及脂滴，用含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，置于培養(yǎng)瓶中，調(diào)整細胞密度為每瓶1×105，放入37℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24小時細胞開始貼壁，每2天換液1次。當細胞達到80%融合時，0.05%的胰蛋白酶消化，傳代。(3)脂肪干細胞的免疫熒光檢測：先將玻片置于6孔板中，然后加入1.5 ml含有105個脂肪干細胞(第2代)的細胞懸液，置于37℃孵箱中培養(yǎng)中培養(yǎng)24小時，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。將長有細胞的玻片取出，PBS沖洗2遍，丙酮固定30分鐘，然后再用PBS沖洗2遍，滴加0.1% TritonX-100作用15分鐘破膜，滴加正常血清工作液封閉，室溫孵育15分鐘，然后滴加FITC標記的兔抗人CD34(1：100)、45(1：100)和鼠抗人CD105(1：100)、CD44(1：100)抗體，4℃過夜，PBS沖洗2遍，熒光顯微鏡下觀察。(4)脂肪干細胞的流式細胞術(shù)檢測：取106個細胞用D-Hanks液洗滌2次，分別加入FITC標記的兔抗人CD34(1：100)、45(1：100)和鼠抗人CD105(1：100)、CD44(1：100)抗體，37℃孵育半小時，1000轉(zhuǎn)離心5分鐘，棄上清，用PBS重懸，上機檢測，未標記的細胞作為對照。

2.成纖維細胞的原代培養(yǎng)和鑒定：取豬皮膚全層，約2 cm×3 cm大小，剪去皮膚及皮下組織，將真皮層剪成1 mm3左右的小塊，用彎頭吸管吸取組織塊接種于培養(yǎng)皿上，組織塊間留約0.3～0.5 cm的間距。37℃孵箱中培養(yǎng)2小時，使其微干涸，然后小心加入含10% FBS 和100 U/mL 青霉素、鏈霉素的DMEM的完全培養(yǎng)基中，放入含5% CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)。1周后更換培養(yǎng)液，以后每3～4 d更換1次完全培養(yǎng)液。當細胞長成梭形，融合至約85%，將細胞用0.05%胰蛋白酶消化傳代。將長有細胞的玻片取出，PBS沖洗2遍，丙酮固定30min，然后再用PBS沖洗2遍，滴加0.1%TritonX-100作用15分鐘破膜，滴加正常血清工作液封閉，室溫孵育15分鐘，然后滴加FITC標記的兔抗人Hsp-47(1：100)抗體，4℃過夜，PBS沖洗2遍，熒光顯微鏡下觀察。

3.脂肪干細胞促成纖維細胞增殖及遷移實驗：(1)脂肪干細胞和成纖維細胞共培養(yǎng)實驗：取等量的脂肪干細胞和成纖維細胞(1×105)置于6孔板中，加入干細胞培養(yǎng)液過夜，使細胞黏附到板底，然后將培養(yǎng)液換成無血清的DMEM，培養(yǎng)1天，分別加入等量的DiI標記的成纖維細胞(1×104)，培養(yǎng)液換為含有2%胎牛血清的DMEM，3天后在熒光顯微鏡下隨機選取5個視野觀察熒光標記的成纖維細胞的增殖情況。(2)脂肪干細胞和成纖維細胞的Transwell板共培養(yǎng)：將相同數(shù)量的脂肪干細胞和成纖維細胞(1×104)置于96孔板Transwell的下室內(nèi)，上室內(nèi)放置相同數(shù)量的成纖維細胞(1×104)，加入含有2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。3天后將上室內(nèi)的成纖維細胞固定，HE染色，隨機選取5個視野進行細胞計數(shù)。(3)脂肪干細胞培養(yǎng)上清對成纖維細胞的促增殖作用：首先將4×105個脂肪干細胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中過夜，然后將培養(yǎng)基換為無血清的DMEM/F12，培養(yǎng)3天后，收集培養(yǎng)液，在300×g下離心5分鐘，然后用0.22 μm注射器式濾器過濾。將上述收集到的培養(yǎng)液分別用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋成不同濃度(0%、10%、25%、50%、100%)，然后加入胎牛血清使血清濃度為2%。將相同數(shù)量的成纖維細胞(1×104)并種植于96孔板中，培養(yǎng)72小時后收集上清待用，成纖維細胞用MTT法測定其增殖情況。(4)脂肪干細胞培養(yǎng)上清促成纖維細胞遷移作用：分別將1×105個成纖維種植于6孔板中，待其100%融合后將培養(yǎng)液換為無血清DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時后，用無菌微量加液器槍頭在6孔板表面劃一創(chuàng)面，PBS沖洗，對照組培養(yǎng)基換為無血清DMEM，實驗組脂肪干細胞培養(yǎng)液上清濃度分別為50%和100%。每24小時在顯微鏡下觀察并拍照，沿著創(chuàng)面隨機選取5個點并標記，然后測量遷移的成纖維細胞與原始創(chuàng)面的水平距離。

4.ELISA法檢測脂肪干細胞培養(yǎng)上清中各因子含量：將96孔板培養(yǎng)72小時后收集的上清用ELISA方法檢測血管內(nèi)皮生長因子、血小板衍生的生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子的含量，實驗重復(fù)3次。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料比較采用獨立樣本t檢驗和隨機區(qū)組的方差分析，對非參數(shù)連續(xù)數(shù)據(jù)進行Kruskal-Wallis檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 流式細胞術(shù)結(jié)果顯示分離培養(yǎng)的脂肪干細胞不表達CD34和CD105，而陽性表達CD44和CD105

結(jié) 果

1.豬脂肪干細胞的形態(tài)和鑒定：豬脂肪干細胞接種4小時后開始貼壁，細胞呈小圓形，48小時后逐漸開始伸展，呈梭形，和成纖維細胞形態(tài)類似，生長有一定方向性，達到融合后成漩渦狀。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)的脂肪來源干細胞CD44、CD105為陽性表達，熒光顯微鏡下顯示綠色，而CD34、CD45為陰性表達，熒光顯微鏡下不顯色(圖1)。流式細胞術(shù)檢測CD44、CD105的陽性率分別為90.2%和99.2%， CD34、CD45的陽性率分別為0.3%和1.2%，符合脂肪來源干細胞的表型標記(圖2)。

圖1 細胞免疫熒光顯示豬脂肪干細胞CD44和CD105染色呈陽性表達，而CD34和CD45染色為陰性表達(10×)

2.成纖維細胞的形態(tài)和鑒定：豬皮膚組織塊培養(yǎng)7天后有細胞向外生長，細胞呈長梭形，大致呈平行排列，核較大，胞質(zhì)較多，為典型的成纖維細胞形態(tài)(圖3A)。取出組織塊后，大約2周后細胞融合成單層細胞。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)的豬成纖維細胞表達HSP47，熒光顯微鏡下顯示為綠色(圖3B)。證實原代培養(yǎng)成纖維細胞成功。

圖3 A：成纖維細胞貼壁生長，呈梭形或多角形(10×)； B：細胞免疫熒光顯示成纖維細胞Hsp47呈陽性表達(10×)

3.豬脂肪干細胞促成纖維細胞增殖和遷移實驗

(1)脂肪干細胞和成纖維細胞共培養(yǎng)實驗：實驗分為實驗組(干細胞-成纖維細胞組)及對照組(成纖維細胞-成纖維細胞組)，脂肪干細胞和成纖維細胞共培養(yǎng)3天后，在熒光顯微鏡下觀察，可以發(fā)現(xiàn)在實驗組紅色熒光染料標記的成纖維細胞比對照組明顯增多(25.5±7.3 v 18.4±8.6)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 通過計算視野下成纖維細胞的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)脂肪干細胞+成纖維細胞組的成纖維細胞數(shù)量明顯多于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05

(2)Transwell板共培養(yǎng)實驗：實驗組成纖維細胞數(shù)量明顯多于對照組(201.5±31.8 v 104.9±19.9)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖5)，說明脂肪干細胞分泌的細胞因子具有促成纖維細胞增殖的作用。

(3)脂肪干細胞培養(yǎng)上清對成纖維細胞的促增殖、遷移作用：將不同濃度的培養(yǎng)液上清加入成纖維細胞，培養(yǎng)3d后用MTT法測定成纖維細胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)脂肪干細胞培養(yǎng)液對成纖維細胞具有促增殖作用，隨著濃度升高，促增殖能力逐漸加強(圖6)。在無血清DMEM組，成纖維細胞幾乎停止生長，且有部分細胞死亡；而在含50%和100%脂肪干細胞培養(yǎng)液上清組，成纖維細胞數(shù)量增多，且逐漸向創(chuàng)面遷移，隨著濃度升高，遷移的成纖維細胞數(shù)量增多，創(chuàng)面兩側(cè)間距離減少。

4.ELISA法檢測脂肪干細胞培養(yǎng)上清中各因子含量：通過ELISA 方法檢測，發(fā)現(xiàn)脂肪干細胞能分泌VEGF、TGF-β1和PDGF-AA，其濃度分別為(765.63±56.23)pg/ml、(133.42±24.35)pg/ml和(78.43±16.56)pg/ml。

圖5 通過計算視野下成纖維細胞的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)脂肪干細胞+成纖維細胞組的成纖維細胞數(shù)量明顯多于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05

圖6 ADSCs培養(yǎng)液上清對成纖維細胞的促增殖作用：隨著培養(yǎng)液濃度的升高，成纖維細胞的數(shù)量明顯增多，培養(yǎng)液濃度為100%時，促增殖能力最強

嚴重外傷、大面積燒傷、壓瘡、糖尿病足等常造成皮膚黏膜創(chuàng)面的形成，由于創(chuàng)傷面積大、多發(fā)、異物存留感染等導(dǎo)致創(chuàng)面愈合較慢，促進創(chuàng)面的盡早愈合對于預(yù)防感染的發(fā)生和改善愈合十分重要。

創(chuàng)面愈合修復(fù)過程復(fù)雜，包含表皮層和真皮層相關(guān)細胞及細胞因子間的相互作用，其中成纖維細胞、角質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞是愈合過程中3種基本細胞[1]，成纖維細胞的增殖及向創(chuàng)面的遷移是影響創(chuàng)面愈合的重要因素。成纖維細胞首先會以有絲分裂的方式大量增殖，4～5天后，成纖維細胞開始合成和分泌大量的膠原纖維和基質(zhì)成分，與新生毛細血管等共同形成肉芽組織填補創(chuàng)面處，在修復(fù)后期，可以通過分泌膠原酶參與修復(fù)后組織的改建。有研究證明了成纖維細胞在創(chuàng)面愈合中的重要作用[2-4]。

Zuk等[5]首次從人脂肪組織中發(fā)現(xiàn)了大量類似于干細胞的細胞，這些細胞在合適誘導(dǎo)劑的作用下可向成骨、軟骨、脂肪和成肌等細胞分化，稱之為脂肪來源干細胞。有研究表明，脂肪來源干細胞條件培養(yǎng)液中存在能促進成纖維細胞的增殖的細胞因子，可對成纖維細胞產(chǎn)生促增殖作用[6-8]。應(yīng)用ELISA方法可以檢測到脂肪干細胞分泌的大量細胞因子[9-11]，包括VEGF、HGF、bFFGF、IGF-Ⅰ等，同時也可檢測到相應(yīng)細胞因子mRNA的表達，而這些細胞因子可以促進細胞的增殖、遷移及抗凋亡作用。Rehman等[11]發(fā)現(xiàn)脂肪干細胞能分泌[VEGF(1203±254)pg/106個細胞]、TGF-β1[(1247±346pg)106個細胞]。Kim 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，脂肪干細胞也能分泌VEGF[(809.53±95.98)pg/ml]、TGF-β1[(103.33±1.7)pg/ml)]及PDGF[(131.35±30.31)pg/ml]。在本實驗中，脂肪干細胞條件培養(yǎng)液上清中也檢測到一定量的VEGF、TGF-β1及PDGF[(765.63±56.23)pg/ml]、[133.42±24.35)pg/ml]、[78.43±16.56)pg/ml]，與其他研究相比，檢測到的細胞因子含量不同，可能與細胞數(shù)量及培養(yǎng)時間不同有關(guān)。

另外，本研究通過脂肪來源干細胞細胞-成纖維細胞直接接觸共培養(yǎng)及Transwell板共培養(yǎng)實驗表明，脂肪干細胞能明顯促進成纖維細胞的增殖和遷移；通過MTT及創(chuàng)面愈合實驗發(fā)現(xiàn)隨著脂肪干細胞培養(yǎng)液上清濃度的增加，促成纖維細胞增殖及遷移能力逐漸加強。結(jié)合ELISA法所得結(jié)果，我們認為脂肪干細胞能分泌細胞因子，進而促進成纖維細胞的增殖和遷移。張澤敏等[12]研究證實，脂肪來源干細胞可以促進擴張皮膚組織增殖。趙月強等[13]將自體脂肪干細胞應(yīng)用于糖尿病足創(chuàng)面治療，發(fā)現(xiàn)自體脂肪干細胞治療組創(chuàng)面愈合速度較對照組明顯加快，感染率明顯降低，認為脂肪干細胞不僅可以加速糖尿病足皮膚創(chuàng)面愈合，還可以通過釋放多種細胞因子促進血管生成，從而改善患肢的血供達到較好的治療效果。Altman 等[14]研究證實脂肪干細胞在體內(nèi)分化為成纖維細胞進而促進創(chuàng)面愈合，此機制需要更進一步的實驗加以驗證。

本研究成功分離培養(yǎng)出ADSCs和成纖維細胞，觀察了細胞的基本生物學(xué)特性，并通過對細胞表面標記證實了ADSCs具有間質(zhì)干細胞的特性。體外實驗表明脂肪干細胞能促進成纖維細胞的增殖和遷移，這種治療模式為創(chuàng)面愈合提供了一個新思路，本實驗也為推廣應(yīng)用此治療模式提供了實驗依據(jù)。