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        豬脂肪來(lái)源干細(xì)胞促成纖維細(xì)胞增殖、遷移的研究

        2020-03-26 07:55:42趙寶成王振軍韓加剛馬華崇禹三水
        臨床外科雜志 2020年2期
        關(guān)鍵詞:原代纖維細(xì)胞培養(yǎng)液

        趙寶成 王振軍 韓加剛 馬華崇 禹三水

        脂肪組織中存在具有自我更新和多向分化潛能的間質(zhì)干細(xì)胞,且脂肪來(lái)源廣泛,獲取容易,對(duì)機(jī)體損傷小。對(duì)脂肪干細(xì)胞(adipose derived stem cells,ADSCs)的研究是近年來(lái)干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)之一。在創(chuàng)傷修復(fù)過程中,成纖維細(xì)胞在創(chuàng)傷早期遷移至創(chuàng)傷區(qū)域,促進(jìn)血管的再生及肉芽組織的形成,在創(chuàng)傷修復(fù)后期,成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞,利于傷口的收縮及疤痕的形成。因此,成纖維細(xì)胞的遷移與增殖是創(chuàng)傷修復(fù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究將原代培養(yǎng)豬脂肪干細(xì)胞及成纖維細(xì)胞并進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn),觀察脂肪干細(xì)胞能否促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和遷移。

        材料與方法

        一、實(shí)驗(yàn)材料

        1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雄性長(zhǎng)白豬1只,體重約30 kg,購(gòu)于首都醫(yī)科大學(xué)。

        2.實(shí)驗(yàn)試劑:高糖DMEM、胎牛血清及0.05%胰蛋白酶購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心;FITC-CD44、FITC-CD105購(gòu)于Abcom公司;FITC-CD34、FITC-CD45購(gòu)于上海晶天生物有限公司;豬轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、血小板衍生的生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子ELISA試劑盒購(gòu)于上海晶天生物有限公司,兔抗HSP-47(FITC)購(gòu)于上海晶天生物有限公司。

        二、方法

        1.脂肪干細(xì)胞的原代培養(yǎng)、鑒定:(1)脂肪取材:該實(shí)驗(yàn)開展于2018年1月,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作完成。全身麻醉成功后,備皮、消毒、鋪巾,取項(xiàng)背部皮下脂肪約10 g,將脂肪組織置入保鮮液中,縫合手術(shù)切口,動(dòng)物送回飼養(yǎng)籠中,脂肪組織在2 小時(shí)內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)。(2)細(xì)胞原代培養(yǎng):在超凈臺(tái)中將脂肪組織在D-Hank’s 液中漂洗3次,盡量去除結(jié)締組織及血管內(nèi)皮,將其剪成1 mm3的組織塊。將剪碎的組織置于高糖DMEM培養(yǎng)基中,加入0.075%的Ⅰ型膠原酶,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90分鐘。將消化后的液體吸出,70目濾網(wǎng)過濾,移至離心管中,2000 r/min離心6分鐘,棄上層液體,D-Hank’s液重懸細(xì)胞,離心,重復(fù)2次。離心后棄掉漂浮的脂肪細(xì)胞及脂滴,用含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,置于培養(yǎng)瓶中,調(diào)整細(xì)胞密度為每瓶1×105,放入37℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24小時(shí)細(xì)胞開始貼壁,每2天換液1次。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí),0.05%的胰蛋白酶消化,傳代。(3)脂肪干細(xì)胞的免疫熒光檢測(cè):先將玻片置于6孔板中,然后加入1.5 ml含有105個(gè)脂肪干細(xì)胞(第2代)的細(xì)胞懸液,置于37℃孵箱中培養(yǎng)中培養(yǎng)24小時(shí),顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。將長(zhǎng)有細(xì)胞的玻片取出,PBS沖洗2遍,丙酮固定30分鐘,然后再用PBS沖洗2遍,滴加0.1% TritonX-100作用15分鐘破膜,滴加正常血清工作液封閉,室溫孵育15分鐘,然后滴加FITC標(biāo)記的兔抗人CD34(1:100)、45(1:100)和鼠抗人CD105(1:100)、CD44(1:100)抗體,4℃過夜,PBS沖洗2遍,熒光顯微鏡下觀察。(4)脂肪干細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè):取106個(gè)細(xì)胞用D-Hanks液洗滌2次,分別加入FITC標(biāo)記的兔抗人CD34(1:100)、45(1:100)和鼠抗人CD105(1:100)、CD44(1:100)抗體,37℃孵育半小時(shí),1000轉(zhuǎn)離心5分鐘,棄上清,用PBS重懸,上機(jī)檢測(cè),未標(biāo)記的細(xì)胞作為對(duì)照。

        2.成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)和鑒定:取豬皮膚全層,約2 cm×3 cm大小,剪去皮膚及皮下組織,將真皮層剪成1 mm3左右的小塊,用彎頭吸管吸取組織塊接種于培養(yǎng)皿上,組織塊間留約0.3~0.5 cm的間距。37℃孵箱中培養(yǎng)2小時(shí),使其微干涸,然后小心加入含10% FBS 和100 U/mL 青霉素、鏈霉素的DMEM的完全培養(yǎng)基中,放入含5% CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)。1周后更換培養(yǎng)液,以后每3~4 d更換1次完全培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)成梭形,融合至約85%,將細(xì)胞用0.05%胰蛋白酶消化傳代。將長(zhǎng)有細(xì)胞的玻片取出,PBS沖洗2遍,丙酮固定30min,然后再用PBS沖洗2遍,滴加0.1%TritonX-100作用15分鐘破膜,滴加正常血清工作液封閉,室溫孵育15分鐘,然后滴加FITC標(biāo)記的兔抗人Hsp-47(1:100)抗體,4℃過夜,PBS沖洗2遍,熒光顯微鏡下觀察。

        3.脂肪干細(xì)胞促成纖維細(xì)胞增殖及遷移實(shí)驗(yàn):(1)脂肪干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn):取等量的脂肪干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞(1×105)置于6孔板中,加入干細(xì)胞培養(yǎng)液過夜,使細(xì)胞黏附到板底,然后將培養(yǎng)液換成無(wú)血清的DMEM,培養(yǎng)1天,分別加入等量的DiI標(biāo)記的成纖維細(xì)胞(1×104),培養(yǎng)液換為含有2%胎牛血清的DMEM,3天后在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察熒光標(biāo)記的成纖維細(xì)胞的增殖情況。(2)脂肪干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的Transwell板共培養(yǎng):將相同數(shù)量的脂肪干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞(1×104)置于96孔板Transwell的下室內(nèi),上室內(nèi)放置相同數(shù)量的成纖維細(xì)胞(1×104),加入含有2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。3天后將上室內(nèi)的成纖維細(xì)胞固定,HE染色,隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。(3)脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)成纖維細(xì)胞的促增殖作用:首先將4×105個(gè)脂肪干細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中過夜,然后將培養(yǎng)基換為無(wú)血清的DMEM/F12,培養(yǎng)3天后,收集培養(yǎng)液,在300×g下離心5分鐘,然后用0.22 μm注射器式濾器過濾。將上述收集到的培養(yǎng)液分別用無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋成不同濃度(0%、10%、25%、50%、100%),然后加入胎牛血清使血清濃度為2%。將相同數(shù)量的成纖維細(xì)胞(1×104)并種植于96孔板中,培養(yǎng)72小時(shí)后收集上清待用,成纖維細(xì)胞用MTT法測(cè)定其增殖情況。(4)脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)上清促成纖維細(xì)胞遷移作用:分別將1×105個(gè)成纖維種植于6孔板中,待其100%融合后將培養(yǎng)液換為無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)24小時(shí)后,用無(wú)菌微量加液器槍頭在6孔板表面劃一創(chuàng)面,PBS沖洗,對(duì)照組培養(yǎng)基換為無(wú)血清DMEM,實(shí)驗(yàn)組脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)液上清濃度分別為50%和100%。每24小時(shí)在顯微鏡下觀察并拍照,沿著創(chuàng)面隨機(jī)選取5個(gè)點(diǎn)并標(biāo)記,然后測(cè)量遷移的成纖維細(xì)胞與原始創(chuàng)面的水平距離。

        4.ELISA法檢測(cè)脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)上清中各因子含量:將96孔板培養(yǎng)72小時(shí)后收集的上清用ELISA方法檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血小板衍生的生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的含量,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

        三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        應(yīng)用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和隨機(jī)區(qū)組的方差分析,對(duì)非參數(shù)連續(xù)數(shù)據(jù)進(jìn)行Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        圖2 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示分離培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞不表達(dá)CD34和CD105,而陽(yáng)性表達(dá)CD44和CD105

        結(jié) 果

        1.豬脂肪干細(xì)胞的形態(tài)和鑒定:豬脂肪干細(xì)胞接種4小時(shí)后開始貼壁,細(xì)胞呈小圓形,48小時(shí)后逐漸開始伸展,呈梭形,和成纖維細(xì)胞形態(tài)類似,生長(zhǎng)有一定方向性,達(dá)到融合后成漩渦狀。免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)的脂肪來(lái)源干細(xì)胞CD44、CD105為陽(yáng)性表達(dá),熒光顯微鏡下顯示綠色,而CD34、CD45為陰性表達(dá),熒光顯微鏡下不顯色(圖1)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD44、CD105的陽(yáng)性率分別為90.2%和99.2%, CD34、CD45的陽(yáng)性率分別為0.3%和1.2%,符合脂肪來(lái)源干細(xì)胞的表型標(biāo)記(圖2)。

        圖1 細(xì)胞免疫熒光顯示豬脂肪干細(xì)胞CD44和CD105染色呈陽(yáng)性表達(dá),而CD34和CD45染色為陰性表達(dá)(10×)

        2.成纖維細(xì)胞的形態(tài)和鑒定:豬皮膚組織塊培養(yǎng)7天后有細(xì)胞向外生長(zhǎng),細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,大致呈平行排列,核較大,胞質(zhì)較多,為典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)(圖3A)。取出組織塊后,大約2周后細(xì)胞融合成單層細(xì)胞。免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)的豬成纖維細(xì)胞表達(dá)HSP47,熒光顯微鏡下顯示為綠色(圖3B)。證實(shí)原代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞成功。

        圖3 A:成纖維細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),呈梭形或多角形(10×); B:細(xì)胞免疫熒光顯示成纖維細(xì)胞Hsp47呈陽(yáng)性表達(dá)(10×)

        3.豬脂肪干細(xì)胞促成纖維細(xì)胞增殖和遷移實(shí)驗(yàn)

        (1)脂肪干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組(干細(xì)胞-成纖維細(xì)胞組)及對(duì)照組(成纖維細(xì)胞-成纖維細(xì)胞組),脂肪干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)3天后,在熒光顯微鏡下觀察,可以發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)組紅色熒光染料標(biāo)記的成纖維細(xì)胞比對(duì)照組明顯增多(25.5±7.3 v 18.4±8.6),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

        圖4 通過計(jì)算視野下成纖維細(xì)胞的數(shù)量,發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞+成纖維細(xì)胞組的成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05

        (2)Transwell板共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組(201.5±31.8 v 104.9±19.9),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5),說(shuō)明脂肪干細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子具有促成纖維細(xì)胞增殖的作用。

        (3)脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)成纖維細(xì)胞的促增殖、遷移作用:將不同濃度的培養(yǎng)液上清加入成纖維細(xì)胞,培養(yǎng)3d后用MTT法測(cè)定成纖維細(xì)胞增殖情況,發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)成纖維細(xì)胞具有促增殖作用,隨著濃度升高,促增殖能力逐漸加強(qiáng)(圖6)。在無(wú)血清DMEM組,成纖維細(xì)胞幾乎停止生長(zhǎng),且有部分細(xì)胞死亡;而在含50%和100%脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)液上清組,成纖維細(xì)胞數(shù)量增多,且逐漸向創(chuàng)面遷移,隨著濃度升高,遷移的成纖維細(xì)胞數(shù)量增多,創(chuàng)面兩側(cè)間距離減少。

        4.ELISA法檢測(cè)脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)上清中各因子含量:通過ELISA 方法檢測(cè),發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞能分泌VEGF、TGF-β1和PDGF-AA,其濃度分別為(765.63±56.23)pg/ml、(133.42±24.35)pg/ml和(78.43±16.56)pg/ml。

        圖5 通過計(jì)算視野下成纖維細(xì)胞的數(shù)量,發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞+成纖維細(xì)胞組的成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05

        圖6 ADSCs培養(yǎng)液上清對(duì)成纖維細(xì)胞的促增殖作用:隨著培養(yǎng)液濃度的升高,成纖維細(xì)胞的數(shù)量明顯增多,培養(yǎng)液濃度為100%時(shí),促增殖能力最強(qiáng)

        嚴(yán)重外傷、大面積燒傷、壓瘡、糖尿病足等常造成皮膚黏膜創(chuàng)面的形成,由于創(chuàng)傷面積大、多發(fā)、異物存留感染等導(dǎo)致創(chuàng)面愈合較慢,促進(jìn)創(chuàng)面的盡早愈合對(duì)于預(yù)防感染的發(fā)生和改善愈合十分重要。

        創(chuàng)面愈合修復(fù)過程復(fù)雜,包含表皮層和真皮層相關(guān)細(xì)胞及細(xì)胞因子間的相互作用,其中成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞是愈合過程中3種基本細(xì)胞[1],成纖維細(xì)胞的增殖及向創(chuàng)面的遷移是影響創(chuàng)面愈合的重要因素。成纖維細(xì)胞首先會(huì)以有絲分裂的方式大量增殖,4~5天后,成纖維細(xì)胞開始合成和分泌大量的膠原纖維和基質(zhì)成分,與新生毛細(xì)血管等共同形成肉芽組織填補(bǔ)創(chuàng)面處,在修復(fù)后期,可以通過分泌膠原酶參與修復(fù)后組織的改建。有研究證明了成纖維細(xì)胞在創(chuàng)面愈合中的重要作用[2-4]。

        Zuk等[5]首次從人脂肪組織中發(fā)現(xiàn)了大量類似于干細(xì)胞的細(xì)胞,這些細(xì)胞在合適誘導(dǎo)劑的作用下可向成骨、軟骨、脂肪和成肌等細(xì)胞分化,稱之為脂肪來(lái)源干細(xì)胞。有研究表明,脂肪來(lái)源干細(xì)胞條件培養(yǎng)液中存在能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖的細(xì)胞因子,可對(duì)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生促增殖作用[6-8]。應(yīng)用ELISA方法可以檢測(cè)到脂肪干細(xì)胞分泌的大量細(xì)胞因子[9-11],包括VEGF、HGF、bFFGF、IGF-Ⅰ等,同時(shí)也可檢測(cè)到相應(yīng)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá),而這些細(xì)胞因子可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移及抗凋亡作用。Rehman等[11]發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞能分泌[VEGF(1203±254)pg/106個(gè)細(xì)胞]、TGF-β1[(1247±346pg)106個(gè)細(xì)胞]。Kim 等[7]研究發(fā)現(xiàn),脂肪干細(xì)胞也能分泌VEGF[(809.53±95.98)pg/ml]、TGF-β1[(103.33±1.7)pg/ml)]及PDGF[(131.35±30.31)pg/ml]。在本實(shí)驗(yàn)中,脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)液上清中也檢測(cè)到一定量的VEGF、TGF-β1及PDGF[(765.63±56.23)pg/ml]、[133.42±24.35)pg/ml]、[78.43±16.56)pg/ml],與其他研究相比,檢測(cè)到的細(xì)胞因子含量不同,可能與細(xì)胞數(shù)量及培養(yǎng)時(shí)間不同有關(guān)。

        另外,本研究通過脂肪來(lái)源干細(xì)胞細(xì)胞-成纖維細(xì)胞直接接觸共培養(yǎng)及Transwell板共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明,脂肪干細(xì)胞能明顯促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和遷移;通過MTT及創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)液上清濃度的增加,促成纖維細(xì)胞增殖及遷移能力逐漸加強(qiáng)。結(jié)合ELISA法所得結(jié)果,我們認(rèn)為脂肪干細(xì)胞能分泌細(xì)胞因子,進(jìn)而促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和遷移。張澤敏等[12]研究證實(shí),脂肪來(lái)源干細(xì)胞可以促進(jìn)擴(kuò)張皮膚組織增殖。趙月強(qiáng)等[13]將自體脂肪干細(xì)胞應(yīng)用于糖尿病足創(chuàng)面治療,發(fā)現(xiàn)自體脂肪干細(xì)胞治療組創(chuàng)面愈合速度較對(duì)照組明顯加快,感染率明顯降低,認(rèn)為脂肪干細(xì)胞不僅可以加速糖尿病足皮膚創(chuàng)面愈合,還可以通過釋放多種細(xì)胞因子促進(jìn)血管生成,從而改善患肢的血供達(dá)到較好的治療效果。Altman 等[14]研究證實(shí)脂肪干細(xì)胞在體內(nèi)分化為成纖維細(xì)胞進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合,此機(jī)制需要更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

        本研究成功分離培養(yǎng)出ADSCs和成纖維細(xì)胞,觀察了細(xì)胞的基本生物學(xué)特性,并通過對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記證實(shí)了ADSCs具有間質(zhì)干細(xì)胞的特性。體外實(shí)驗(yàn)表明脂肪干細(xì)胞能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和遷移,這種治療模式為創(chuàng)面愈合提供了一個(gè)新思路,本實(shí)驗(yàn)也為推廣應(yīng)用此治療模式提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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