王夢園 左維維 夏雨佳 胡明

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)發(fā)病率和死亡率分別高居所有惡性腫瘤的第3位和第2位[1]。有研究表明，CRC的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移是一個多基因參與的過程，原癌基因和抑癌基因的失調(diào)扮演著重要角色[2]。Sirtuins(SIRTs)由SIRT1-7七個成員組成，廣泛參與多種細胞過程[3]。有研究表明，SIRTs的異常表達與包括惡性腫瘤在內(nèi)的多種人類疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。SIRT4作為去乙酰化酶家族中特征最不明顯的成員之一，已被證實在包括乳腺癌、食管癌、胃癌和膀胱癌等多種實體惡性腫瘤中下調(diào)表達，且其表達強度與腫瘤的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6]。我們對SIRT4在CRC組織中的表達進行檢測，并分析其與CRC病人臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。

對象與方法

一、對象

2013年1月～2013年12月我院住院并接受手術(shù)治療的CRC病人組織標本85例。入組標準：(1)均經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為結(jié)直腸癌；(2)術(shù)前未接受過任何抗腫瘤治療；(3)根據(jù)NCCN指南推薦，對術(shù)后病理分期為ⅡB和Ⅲ期的病人進行術(shù)后輔助治療；(4)具有完整的臨床病理資料和5年隨訪信息。排除標準：有遠處轉(zhuǎn)移；手術(shù)為非根治性手術(shù)。收集組織包括癌及其配對的癌旁組織(距離癌組織5 cm以上)，所有標本分成2份：1份放入液氮并迅速轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱凍存用于總RNA的提?。涣?份放入10%的福爾馬林溶液中固定用于免疫組化切片染色。85例CRC病人中，男性46例，女性39例；年齡38～81歲，平均年齡為(63.0±2.31)歲；按照UICC第7版CRC分期系統(tǒng)進行術(shù)后病理分期，其中Ⅰ期9例，Ⅱ期33例，Ⅲ期43例。體臨床病理特征見表1。本研究已獲得我院倫理委員會批準并獲得病人知情同意。

二、方法

1.逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)：Trizol法提取細胞及組織中RNA，-80℃冰箱保存。取1ugRNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成互補脫氧核糖核酸(cDNA)，加入SYBR green染料(Qiagen)進行PCR擴增。實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)的條件為：95℃預(yù)變性30秒，之后95℃ 5秒，60℃ 30秒，共38個循環(huán)后進行溶解曲線檢測，數(shù)據(jù)處理采用2-△△Ct法。

2.Western blot：細胞培養(yǎng)48小時后，吸棄上清液，收集細胞，加入細胞裂解液，提取總蛋白，應(yīng)用BCA試劑盒對蛋白濃度進行檢測。配制10%分離膠和5%濃縮膠，電泳轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，置于鼠抗人SIRT4抗體(1∶3000稀釋)或鼠抗人GAPDH(1∶1000稀釋)中4℃孵育過夜孵育結(jié)束后，洗膜，再滴加兔抗鼠二抗室溫搖床孵育1小時，再洗滌。將洗滌千凈的PVDF膜置于ChemiDoc MP全能型凝膠成像分析系統(tǒng)儀器中掃膜，用Image Lab軟件系處理圖像即得到最終結(jié)果。

3.免疫組織化學(xué)染色：取組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2去離子水(無色液體)孵育10～30分鐘，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。山羊血清封閉15～30分鐘，孵SIRT4一抗(1∶200稀釋)，37℃孵育2～3小時，次日滴加標記有HRP的二抗室溫孵育30分鐘，顯色劑顯色(DAB)，顯微鏡下控制反應(yīng)時間。蘇木素復(fù)染，逐級脫水、透明、中性樹膠封片染色。根據(jù)每個高倍鏡視野中陽性細胞所占比例進行評分。

表1 結(jié)直腸癌組織SIRT4表達與病人臨床病理特征的關(guān)系(85例)

注：aP<0.05；bAJCC/UICC第七版TNM分期系統(tǒng)；CEA，癌胚抗原；CA199

4.隨訪：85例病人均獲隨訪。采取門診復(fù)查或電話隨訪方式，隨訪時間截止至2018年12月或者病人死亡。主要觀察指標為無復(fù)發(fā)生存期(recurrence-free survival，RFS)和總生存期(overall survival，OS)。RFS：從接受根治性手術(shù)開始至疾病復(fù)發(fā)的時間；OS：從明確診斷為結(jié)直腸癌開始至因任何原因引起死亡的時間。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。用配對Wilcoxon秩和檢驗比較SIRT4mRNA在癌與癌旁組織中的表達差異，用χ2檢驗分析CRC組織中SIRT4蛋白表達水平與病人臨床病理特征的相關(guān)性，用Kaplan-Meier計算生存率并繪制生存曲線，組間生存差異采用Log-Rank檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.SIRT4在結(jié)直腸細胞中的表達：RT-qPCR結(jié)果顯示，CRC細胞中SIRT4 mRNA的表達水平低于正常結(jié)直腸上皮細胞(P<0.05)(圖1A)。Western blot檢測結(jié)果表明，CRC細胞中SIRT4蛋白的表達水平也低于正常細胞(圖1B)，與mRNA水平相符。同樣，我們驗證了SIRT4在CRC組織及癌旁組織中的表達情況，結(jié)果與細胞系中相似，SIRT4 mRNA 蛋白在CRC組織中的表達水平均低于相應(yīng)的癌旁正常組織(P<0.05)(圖1C和1D)。

2.SIRT4蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達：免疫組化檢測結(jié)果顯示，SIRT4蛋白定位于細胞質(zhì)，根據(jù)表達強度的不同，可呈淺棕色至棕褐色顆粒(圖2)。根據(jù)上述判定標準，在85例CRC病人中，SIRT4低表達49例，占57.6%。

3.SIRT4表達與結(jié)直腸癌病人臨床病理特征的關(guān)系見表1。根據(jù)免疫組化染色結(jié)果，將85例結(jié)直腸癌病人分為高表達和低表達組，分析SIRT4表達水平與病人臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果表明，SIRT4蛋白的低表達與結(jié)直腸癌的組織分化程度、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤、神經(jīng)侵犯及TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)，與病人性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小及術(shù)前CEA水平無關(guān)(P>0.05)。

A，B：SIRT4 mRNA和蛋白在結(jié)直腸癌細胞和正常結(jié)直腸細胞中的表達；C，D：SIRT4 mRNA和蛋白在結(jié)直腸癌及對應(yīng)的癌旁組織中的表達

A：低表達；B：高表達

4.SIRT4表達與結(jié)直腸癌病人預(yù)后的關(guān)系：所有85例CRC病人均獲隨訪，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移57例(67.1%)，死亡53例(62.4%)。Kaplan-Meier 生存分析及Log-Rank檢驗結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，SIRT4蛋白表達水平越低，CRC病人的復(fù)發(fā)率和死亡率越高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示結(jié)直腸癌組織中SIRT4的低表達與病人的不良預(yù)后顯著相關(guān)。

討 論

近年來，隨著手術(shù)、放化療及分子靶向治療等治療手段的不斷發(fā)展與進步，從一定程度上改善了CRC的治療效果和臨床預(yù)后，但病人的5年生存率仍較低[7]。目前，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移仍是導(dǎo)致CRC病人死亡的首要原因[11]。當前已發(fā)現(xiàn)多個基因和信號通路在CRC的發(fā)生、進展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但CRC的病因仍不明確[8]。因此，探究CRC潛在的分子機制可能為理解其發(fā)病機理提供新的見解，有助于發(fā)現(xiàn)新的潛在的生物標志物和治療靶點。

A：復(fù)發(fā)；B：生存

圖3結(jié)直腸癌組織中SIRT4表達強度與病人預(yù)后的關(guān)系

本研究結(jié)果表明，SIRT4在CRC細胞中的表達水平低于正常結(jié)直腸上皮細胞，同時，其在CRC組織中表達也低于鄰近正常結(jié)直腸黏膜組織。進一步分析發(fā)現(xiàn)，SIRT4在CRC組織中的低表達不僅與腫瘤的分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤、神經(jīng)侵犯及TNM分期等不良病理特征顯著相關(guān)，也預(yù)示著病人的不良預(yù)后。上述研究結(jié)果提示，SIRT4可能在CRC的發(fā)生發(fā)展中扮演抑癌基因的角色。Gong等[9]通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，在非小細胞肺癌中高表達，且SIRT4高表達與更長的生存時間相關(guān)。

有研究表明，腫瘤細胞的谷氨酰胺代謝和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10-11]。Jeong等[12]揭示SIRT4可通過抑制線粒體的谷氨酰胺代謝，調(diào)節(jié)腫瘤細胞對DNA損傷的代謝反應(yīng)，從而發(fā)揮抑癌活性。Miyo等[13]研究表明，SIRT4可通過抑制CRC細胞的谷氨酰胺代謝調(diào)節(jié)腫瘤細胞的EMT過程，從而抑制CRC細胞的增殖、遷移和侵襲。在胃癌中，SIRT4也被證實可通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞的EMT進程進而抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲[14]。因此，我們推測SIRT4可能通過抑制腫瘤細胞的谷氨酰胺代謝和EMT進程，從而發(fā)揮抑癌活性。