周 英，李庚花，胡葉開，強 遙，張凱東，趙尚高，李幫明，蔣軍喜*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045；2.江西省浮梁縣瑤里農(nóng)技站，江西 浮梁 333411；3.江西省奉新縣農(nóng)業(yè)局，江西 奉新 330700）

【研究意義】‘金艷’是1984年中國科學(xué)院武漢植物園以毛花獼猴桃為母本，以中華獼猴桃作父本雜交育成的黃肉獼猴桃品種[1-2]，該品種豐產(chǎn)性好、外形美觀、果肉金黃、細嫩香甜、Vc含量高、耐貯藏，是深受獼猴桃種植者和消費者青睞的高端優(yōu)良品種之一[3-6]。近年來，為順應(yīng)市場需求，江西省奉新縣大力發(fā)展‘金艷’獼猴桃種植，但隨著種植面積的不斷擴大，在該品種上出現(xiàn)一種新的果實病害（本文命名為獼猴桃黑斑?。⒊手鹉昙又刂畡?。明確該病害的病原并篩選出有效藥劑，對及時控制該病害的發(fā)生具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】該病害目前在奉新只為害獼猴桃果實，尚未發(fā)現(xiàn)其為害葉片和枝條，幼果期開始發(fā)病，膨大期盛發(fā)，成熟期發(fā)病較輕。罹病果實不但帶有病疤和發(fā)生腐爛，而且極易脫落。該病害在癥狀特點上明顯不同于奉新已發(fā)生的獼猴桃灰霉病、果腐病等病害[7-8]，而與韓國報道的獼猴桃黑腐病和我國陜西省報道的獼猴桃褐斑病有較大的類似之處[9-10]。2011年，Kwon等[7]對韓國獼猴桃黑腐病的病原進行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，明確其病原菌為鏈格孢（Alternaria alternata）；2013年，趙金梅等[8]對陜西省周至縣獼猴桃褐斑病菌也進行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，其病原菌也被確定為鏈格孢（A.alternata），同時，還篩選到氟硅唑、異菌脲、多抗霉素和苯醚甲環(huán)唑4種有效藥劑。【本研究切入點】本文從奉新縣具有代表性果園采集大量樣品，通過組織分離獲得多個菌株，隨后對獲得的菌株進行培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)觀察，并通過基因擴增和序列測定對菌株作進一步的分子鑒定，在此基礎(chǔ)上進行藥劑篩選試驗?！緮M解決的關(guān)鍵問題】黑斑病目前在江西省奉新縣獼猴桃品種‘金艷’上普遍發(fā)生，在有些果園中造成了大量的爛果和落果現(xiàn)象，已對奉新縣金艷獼猴桃生產(chǎn)構(gòu)成了嚴重的威脅。鑒于該病害是獼猴桃生產(chǎn)中的一種新的突發(fā)病害，且具有迅速擴散蔓延之勢，本研究擬解決的關(guān)鍵問題是明確其病原菌種類和篩選出有效藥劑，為盡快控制該病害的發(fā)生提供理論依據(jù)和有效手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試病果：2017年5—7月分批從江西奉新縣新澤農(nóng)場、余會昌農(nóng)場、天成農(nóng)場和松毛山基地采集獼猴桃病果，品種為‘金艷’，共采集病果40個，病果采回后立即在室內(nèi)進行病菌分離。

供試藥劑：共22種殺菌劑，分別為75%戊唑·嘧菌酯水分散粒劑，美國世科姆（中國）公司生產(chǎn)；75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑，70%丙森鋅可濕性粉劑，均由拜耳（中國）有限公司生產(chǎn)；50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑，50%異菌脲懸浮劑，均由富美實（中國）植物保護劑有限公司生產(chǎn)；25%吡唑醚菌酯乳油，50%啶酰菌胺水分散粒劑，70%代森聯(lián)水分散粒劑，均由巴斯夫（中國）有限公司生產(chǎn)；2%春雷霉素水劑，日本北興化學(xué)工業(yè)株式會社生產(chǎn)；40.4%精甲·百菌清懸浮劑，10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑，50%嘧菌環(huán)胺水分散粒劑，25%丙環(huán)唑乳油，均由先正達（中國）有限公司生產(chǎn)；400 g/L氟硅?乳油，廣東茂名綠銀農(nóng)化有限公司；24%腈苯唑懸浮劑，美國陶氏益農(nóng)（中國）有限公司生產(chǎn)；68.75%噁酮·錳鋅水分散粒劑，美國杜邦（中國）有限公司生產(chǎn)；10%申嗪霉素懸浮劑，上海農(nóng)樂生物制品有限公司生產(chǎn)；25%己唑醇懸浮劑，山東奧勝生物科技有限公司生產(chǎn)；12%中生菌素可濕性粉劑，福建凱立生物制品有限公司生產(chǎn)；10%多抗霉素可濕性粉劑，日本科研制藥株式會社生產(chǎn)；80%已蒜素乳油，開封大地農(nóng)化生物科技有限公司生產(chǎn)；75%百菌清可濕性粉劑，利民化工股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 病原菌的分離培養(yǎng)

采用組織分離法[11]進行病菌分離，在超凈工作臺上，用體積分數(shù)75%的酒精對獼猴桃病果進行表面擦拭并在酒精燈上來回火焰消毒，用無菌刀片削去病斑果皮，將病健交界處的果肉組織移入含有乳酸的PDA平板上，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待組織塊周圍長出菌落后挑取菌落邊緣的菌絲體轉(zhuǎn)接PDA試管斜面培養(yǎng)基獲得純培養(yǎng)，在純培養(yǎng)試管中加入甘油于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌形態(tài)鑒定方法

將病原菌接到PDA和PCA培養(yǎng)基上，逐日觀察記載菌落的形態(tài)和顏色變化，測量菌落直徑，計算菌落生長速率。待菌落產(chǎn)孢后鏡檢分生孢子形態(tài)，隨機取100個孢子測量其大小。從PCA培養(yǎng)基上的菌落邊緣取小塊帶菌絲培養(yǎng)基，將菌絲涂抹于中間鑿有邊長約為15 mm的方孔的無菌濾紙片上，并將濾紙片置于無菌載玻片上，于25℃、12 h光照/12 h黑暗交替的培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)5～7 d，在光學(xué)顯微鏡下觀察方孔內(nèi)緣的分生孢子鏈。根據(jù)實驗結(jié)果，查閱相關(guān)文獻[12-15]，對病原菌種類歸屬進行形態(tài)鑒定。

1.4 致病性測定

參照李庚花等[14]描述的方法，對分離到的病菌進行回接，具體步驟如下：選取無病斑、無蟲傷的健康‘金艷’獼猴桃果實，用體積分數(shù)70%的酒精對要接種部位進行表面消毒，待酒精揮發(fā)后用無菌刀片削一個直徑為5 mm大小的傷口面，用直徑為5 mm的無菌打孔器在菌落邊緣打取菌餅，將菌餅的菌絲面緊貼傷口進行接種，設(shè)無菌的PDA培養(yǎng)基塊做對照，在接種處用濕棉球進行保濕，每個處理3個重復(fù)，置25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察接種果發(fā)病情況，待發(fā)病后對病斑再次進行病菌分離。

1.5 病原菌的分子鑒定

采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株的基因組DNA，用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[16-17]擴增 rDNA-ITS 序列，用引物EF-1F（5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′）/EF-1R（5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′）[18]擴增 EF-1α基因。擴增反應(yīng)體系：2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL、正反向引物各1 μL、ddH2O 8.5 μL、DNA模板2 μL至總體系25 μL。rDNA-ITS基因PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后一次循環(huán)后，72℃補平10 min。EF-1α基因PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 3 min；94℃變性 1 min，60℃退火25 s，72℃ 延伸1 min，循環(huán)5次；94℃變性1 min，58℃退火25 s，72℃延伸1 min，循環(huán)5次；94℃變性1 min，56℃退火25 s，72℃延伸1 min，循環(huán)25次；最后一次循環(huán)后，72℃補平10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，委托生工生物工程（上海）有限公司進行測序，將測得的序列在GenBank中進行BLAST搜索，與數(shù)據(jù)庫中已知序列進行同源性比對，按比對結(jié)果結(jié)合病菌的形態(tài)學(xué)特征來對病原菌進行鑒定。

1.6 藥劑室內(nèi)毒力測定

采用菌絲生長速率法[19-20]測定22種殺菌劑對獼猴桃黑斑病病菌的抑菌作用，方法如下：在超凈工作臺上，將藥劑按有效成分用無菌水稀釋成1.0×104，2.5×103，6.3×102，1.6×102，3.9×101，1.0×101，2.4×100，6.1×10-1，1.5×10-1μg/mL共9個質(zhì)量濃度梯度的藥液，取1 mL藥液加入盛有9 mL（約50℃）PDA試管中，混勻后倒入培養(yǎng)皿中制備含藥梯度平板，設(shè)空白PDA平板為對照。用直徑為5 mL的無菌打孔器在培養(yǎng)7 d的菌落邊緣打取菌餅，用無菌接種針挑取一個菌餅接至含藥PDA平板中央，每個處理3個重復(fù)，接種后置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d后用十字交叉法[21]測量菌落直徑并計算抑菌率，用DPS分析軟件進行數(shù)據(jù)分析，求出毒力回歸方程、EC50值和相關(guān)系數(shù)，并根據(jù)EC50值的大小來評價不同殺菌劑的抑菌效果。

抑菌率=（對照組凈菌落直徑-處理組凈菌落直徑）/對照組凈菌落直徑×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

2017年，江西省奉新縣多個果園的‘金艷’獼猴桃發(fā)生一種新的果實病害。該病主要發(fā)生于5—7月獼猴桃果實生長發(fā)育前期，果面出現(xiàn)褐色圓形或不規(guī)則形凹陷病斑，隨著病斑的擴大，病斑顏色逐漸加深變黑，病斑凹陷程度更加顯著，病斑上有大量的黑色霉層（圖1a），后期，病斑凹陷處開裂并木栓化、空心、內(nèi)部布滿菌絲（如圖1b，1c），病果隨之脫落。

圖1 ‘金艷’獼猴桃黑斑病癥狀Fig.1 Symptoms of black spot disease on‘Jinyan’kiwifruit

2.2 病菌培養(yǎng)及形態(tài)特征

對4個果園采集的40個病果進行病菌分離純化，共獲得35個真菌分離物，這些分離物在PDA平板上的培養(yǎng)性狀基本一致。選取其中代表性分離物HB-1，對其進行培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征觀察，25℃培養(yǎng)條件下，該菌在PDA平板上菌落圓形，初為白色，后轉(zhuǎn)為灰黑色，基內(nèi)菌絲和氣生菌絲均較發(fā)達、絨毛狀，培養(yǎng)5 d后菌落變成墨綠色，邊緣一圈為白色（圖2a，圖2b）；菌落平均生長速率為10 mm/d；顯微鏡下，分生孢子卵形，倒棍棒形，倒梨形或橢圓形，褐色或淡褐色，表面光滑，具2～5個橫隔膜和1～3個縱、斜隔膜，分隔處不隘縮或微隘縮，大小為（15～50）μm×（7.5～12.5）μm，孢身偶有柱狀或錐狀的假喙（圖2c）。在PCA+濾紙上，25℃光暗交替培養(yǎng)5 d，在細長的分生孢子梗上部形成特征性的具短分生孢子鏈（圖2d），其分生孢子假喙可多次產(chǎn)孢，作合軸式延伸（圖2e），分生孢子側(cè)面與基部易萌生次生分生孢子梗而產(chǎn)孢并形成支鏈（圖2f），分生孢子鏈較短，支鏈一般長1～5個孢子，最長也未達到10個孢子。查閱文獻《中國真菌志-鏈格孢屬》[10]，發(fā)現(xiàn)本菌株的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征與其中對鏈格孢（Alternaria alternata）的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征描述相符，因此，在形態(tài)上我們將分離物HB-1鑒定為鏈格孢（A.alternata）。

圖2 病原菌的形態(tài)學(xué)特征Fig.2 Morphological characteristics of the pathogenic fungus

2.3 致病性測定

圖3 ‘金艷’獼猴桃接種HB-1菌株的發(fā)病癥狀Fig.3 Symptoms of‘Jinyan’kiwifruit inoculated with the fungal strain HB-1

將分離得到的菌株進行室內(nèi)和田間致病性測定，結(jié)果表明，室內(nèi)接種HB-1菌株后，3 d開始發(fā)病，刺傷處出現(xiàn)深褐色小病斑，逐天觀察，病斑不斷擴大并逐漸變黑，果實內(nèi)部為深褐色（圖3a，圖3b），對照接種未見發(fā)?。▓D3c，圖3d）；田間接種HB-1菌株后，3 d開始發(fā)病，病斑褐色，凹陷，后期病斑逐漸擴大（圖3e），10 d后出現(xiàn)落果現(xiàn)象，對照接種不表現(xiàn)發(fā)病癥狀（圖3f）。對接種病斑進行病菌再分離，獲得了與原接種菌培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征一致的菌株。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

以供試分離物HB-1的基因組DNA為模板，分別用引物ITS1/ITS4和EF-1F/EF-1R擴增rDNA-ITS和EF-1α基因序列（圖4），擴增產(chǎn)物測序后去除兩端引物，其序列長度各為531 bp和240 bp，其在GenBank中的登錄號分別為MH715974和MH708309。將此序列與GenBank中已有序列進行同源性比較，結(jié)果與鏈格孢（Alternaria alternata）和細級鏈格孢（Alternaria tenuissima）對應(yīng)序列的同源性均為100%。細極鏈格孢與鏈格孢的分生孢子鏈明顯不同，前者孢子鏈長度一般超過10個孢子，孢子鏈很少有分支，后者孢子鏈長度不超過10個孢子，且常常有支鏈。根據(jù)此同源性比較結(jié)果，結(jié)合上述形態(tài)學(xué)特征，進一步將分離物HB-1鑒定為鏈格孢（A.alternata）。

圖4 供試菌株HB-1的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoresis of PCR amplified products of the strain HB-1

表1 22種殺菌劑對獼猴桃黑斑病菌的毒力回歸方程Tab.1 Toxicity regression equation of 22 fungicides against Alternaria alternata

2.5 不同藥劑對獼猴桃黑斑病菌的抑制作用

室內(nèi)毒力測定結(jié)果表明，22種殺菌劑對獼猴桃黑斑病菌菌絲生長表現(xiàn)出不同程度的抑制作用（表1），其中10%申嗪霉素、50%咪鮮胺錳鹽、25%已唑醇、75%肟菌·戊唑醇、25%丙環(huán)唑、10%苯醚甲環(huán)唑、75%戊唑·嘧菌酯和400 g/L氟硅?8種殺菌劑的抑制作用大，即毒力強，EC50值分別為0.182 1，0.198 2，0.242 1，0.286 5，0.455 9，0.500 2，0.598 7，0.763 3 μg/mL，均小于1 μg/mL；其次為12%中生菌素、50%嘧菌環(huán)胺、25%吡唑醚菌酯、50%異菌脲、68.75%噁酮·錳鋅、10%多抗霉素、70%丙森鋅、70%代森聯(lián)和24%腈苯唑，這9種殺菌劑對獼猴桃黑斑病菌的抑制作用較大，即毒力較強，EC50值1～10 μg/mL，相比較而言，本組前6種殺菌劑的抑菌作用又明顯大于后3種；50%啶酰菌胺、80%乙蒜素、2%春雷霉素、40.4%精甲·百菌清和75%百菌清5種殺菌劑的抑菌作用則較小或不明顯，EC50值均大于25 μg/mL。

3 結(jié)論與討論

本文對近年來在江西省奉新縣獼猴桃產(chǎn)區(qū)出現(xiàn)的一種新病害獼猴桃黑斑病進行了病原鑒定，鑒定結(jié)果與他人對韓國獼猴桃黑腐病和陜西省獼猴桃褐斑病的病原鑒定結(jié)果[6-7]相同，均為鏈格孢（A.alternata）。因此，這3種病害應(yīng)屬于同一種病害。然而，這3種病害雖然癥狀較為一致，但發(fā)病部位和發(fā)生時期不盡相同。奉新獼猴桃黑斑病在果實的生長發(fā)育前期為害，發(fā)病部位主要在果身；韓國獼猴桃果腐病也在果實生長發(fā)育前期為害，但為害部位主要在果臍部[8]；陜西獼猴桃褐斑病除在果實的生長發(fā)育期為害外，還可在貯藏期繼續(xù)為害，發(fā)病部位主要在果身，此外，還可為害葉片[9]。造成三者差異的原因究竟是病菌致病性不同還是其他因素引致有待進一步研究。

鏈格孢屬（Alternaria）真菌是一類常見的植物病原菌[22-23]，其有效藥劑較多，但具體到該屬中的某種真菌或同一種真菌不同來源的分離物，其有效藥劑并不完全相同[24-25]。為了篩選出對奉新獼猴桃黑斑病具有高效的藥劑，本研究有針對性地選用了22種殺菌劑進行室內(nèi)毒力測定，結(jié)果表明10%申嗪霉素、50%咪鮮胺錳鹽、25%已唑醇、75%肟菌·戊唑醇、25%丙環(huán)唑、10%苯醚甲環(huán)唑、75%戊唑·嘧菌酯和400 g/L氟硅?8種殺菌劑對獼猴桃黑斑病菌具有強烈的抑制作用。在這8種藥劑中，氟硅唑和苯醚甲環(huán)唑曾被趙金梅等[8]篩選為對陜西周至獼猴桃上鏈格孢菌（A.alternata）的高效藥劑，但咪酰胺錳鹽被認為效果不顯著，其余5種研究人員則未進行藥效測定。對這8種高效藥劑，最值得推薦的為申嗪霉素，該藥不但對獼猴桃黑斑病菌毒力最強，而且屬生物農(nóng)藥。當然，上述結(jié)果僅代表殺菌劑對獼猴桃黑斑病菌的室內(nèi)抑菌作用，要獲得其對該病害的實際防效，還有待于后續(xù)的田間藥效試驗。

本研究對江西奉新縣金艷獼猴桃黑斑病進行了病菌分離，對分離病菌進行了形態(tài)學(xué)和基于rDNAITS和EF-1α序列分析的分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果表明引起江西省奉新縣‘金艷’獼猴桃黑斑病的病原菌鏈格孢（Alternaria alternata），屬半知菌類鏈格孢屬真菌。22種殺菌劑對獼猴桃黑斑病菌室內(nèi)毒力強弱不同，8種毒力強，9種毒力較強，5種毒力較弱或不明顯。