張 含 ，劉一博，孔令華，付賢德，徐歡成，何旭江*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 蜜蜂研究所，江西 南昌 330045；2.江西省上饒縣農(nóng)業(yè)局，江西 上饒 334100）

【研究意義】中華蜜蜂是我國(guó)寶貴的蜂種資源，不僅可提供優(yōu)質(zhì)的蜂產(chǎn)品，也對(duì)我國(guó)的生態(tài)系統(tǒng)起著重要作用。我國(guó)自漢代開始，采用樹筒（如棒棒巢）、圓桶和草編蜂箱等方式飼養(yǎng)中蜂[1-2]。這類蜂箱十分適合中蜂的生長(zhǎng)與繁衍，許多傳統(tǒng)蜂箱沿用至今。但其缺點(diǎn)也十分明顯，即巢脾不能移動(dòng)，取蜜時(shí)需切下巢脾，也無(wú)法進(jìn)行人工育王和日常生產(chǎn)管理[2]。自朗氏蜂箱發(fā)明以來(lái)，西方蜜蜂一直沿用朗氏活框蜂箱進(jìn)行飼養(yǎng)，形成了標(biāo)準(zhǔn)蜂箱。活框蜂箱利于蜂群管理和檢查，取蜜后巢脾可重復(fù)利用，還可進(jìn)行人工育王、蜂群并群與分群等工作[2-3]。因此，利用活框蜂箱來(lái)飼養(yǎng)中蜂是促進(jìn)中蜂發(fā)展的重要舉措?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】我國(guó)自引入朗氏活框蜂箱后，也開始采用朗氏標(biāo)準(zhǔn)蜂箱飼養(yǎng)中蜂。然而，相較于西方蜜蜂，中蜂的群勢(shì)較小，很難利用朗氏蜂箱內(nèi)部的全部空間，難以形成繁殖區(qū)和生產(chǎn)區(qū)的分區(qū)管理。同時(shí)，中蜂野性較強(qiáng)，在朗氏標(biāo)準(zhǔn)蜂箱中并不能很好的生長(zhǎng)與繁育，往往出現(xiàn)滋生巢蟲和飛逃等現(xiàn)象。我國(guó)也設(shè)計(jì)了各類中蜂活框蜂箱。方文富[4]在1991年研發(fā)了FWF型中蜂蜂箱，該類蜂箱尺寸小，分為平箱與繼箱兩層淺箱（箱高21 cm）；秦裕本[5]根據(jù)中蜂習(xí)性設(shè)計(jì)了Q-82型中蜂蜂箱，蜂箱為單個(gè)高箱（箱高45 cm）；龔鳧羌與寧守容設(shè)計(jì)了GN中蜂蜂箱，蜂箱內(nèi)徑為37 cm×33 cm×18 cm，含有繼箱，其高度為16 cm；杜海明等[6]發(fā)明了中蜂多層疊式蜂箱；胡軍軍等[7]調(diào)查了廣西地區(qū)各種地域型活框蜂箱，箱長(zhǎng)從35～43 cm，高度從20～25 cm不等。如此多樣的中蜂蜂箱類型，但仍未形成如朗氏蜂箱般可廣泛應(yīng)用的中蜂蜂箱。與此同時(shí)，蜂箱的結(jié)構(gòu)和尺寸可直接影響蜂群的生產(chǎn)力、蜂蜜品質(zhì)和繁殖力等。方文富[4]在1991年研發(fā)了FWF型中蜂蜂箱，該蜂箱保溫效果好，可形成滿子脾，且可進(jìn)行中蜂產(chǎn)漿。徐祖蔭等[8]研究發(fā)現(xiàn)，中蜂短框箱（12框箱）比朗氏蜂箱蜂蜜產(chǎn)量高，保溫保濕效果好，繁蜂快。劉曼等[9]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，中蜂蜂箱的類型可顯著影響蜂蜜的淀粉酶活性、氨基酸和蛋白質(zhì)含量等蜂蜜品質(zhì)指標(biāo)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究團(tuán)隊(duì)前期研究[10]發(fā)現(xiàn)中蜂多層活框蜂箱更有利于蜂群的群勢(shì)增長(zhǎng)，其蜂蜜產(chǎn)量與品質(zhì)也優(yōu)于朗氏標(biāo)準(zhǔn)蜂箱的蜂群。此外，巢蟲是中蜂的重要敵害之一，可侵蝕巢脾，造成大量白頭蛹，甚至逼迫整群蜂飛逃[11-12]。蜂箱類型是否會(huì)影響中蜂抗巢蟲性能未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究對(duì)中蜂多層活框蜂箱的溫濕度維持能力和繁殖性能進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)其抗巢蟲性能及兩個(gè)抗氧化相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，以評(píng)估該蜂箱的生產(chǎn)特性，為我國(guó)中蜂標(biāo)準(zhǔn)蜂箱的研究提供科學(xué)借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)蜂群

本試驗(yàn)選取了10群健康的中華蜜蜂Apis cerana cerana蜂群，飼養(yǎng)于江西省上饒縣華壇山鎮(zhèn)葉家村。將5群蜂放入中蜂多層活框蜂箱飼養(yǎng)，蜂箱長(zhǎng)寬均為37 cm、內(nèi)徑33 cm，高度20 cm，配隔王柵和繼箱（高度20 cm），詳細(xì)結(jié)構(gòu)可參見本團(tuán)隊(duì)已發(fā)表論文[13]。另外5群放入朗氏標(biāo)準(zhǔn)蜂箱飼養(yǎng)。試驗(yàn)前，調(diào)整群勢(shì)，使所有蜂群群勢(shì)相近。

1.2 儀器與試劑

主要儀器設(shè)備：指針式溫濕度儀（天津美達(dá)時(shí)儀器儀表有限公司）、熒光定量PCR（美國(guó)ABI，7500）冷凍離心機(jī)（湖南湘立），移液器（德國(guó)Eppendorf），制冰機(jī)（北京長(zhǎng)流），三洋超低溫冰箱等（日本三洋），全套R(shí)Nase-free的槍頭和EP管（AXYGEN），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化），微量核酸蛋白分析測(cè)定儀（德國(guó)IMPLEN）。

主要試劑：TransZol（北京全式金）、酶抑制劑（Ribonuclease Inhibitor，北京全式金）、dNTP Mixture（Takara，2.5 mmol），oligo（dT）（上海英杰合成，5.97 nmol/OD）、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV（Takara，200 U/μL）、熒光染料SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（Takara）、無(wú)水乙醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蜂群封蓋子數(shù)測(cè)定 試驗(yàn)蜂群首先進(jìn)行調(diào)整群勢(shì)，每群3足脾（意蜂標(biāo)準(zhǔn)脾）。因多層活框蜂箱巢脾大小約為標(biāo)準(zhǔn)脾的一半，因此起始蜂群群勢(shì)為6足脾。將兩組蜂箱的蜂群交叉排列于蜂場(chǎng)。自2018年8月7日起對(duì)每群蜂進(jìn)行封蓋子數(shù)測(cè)定，每隔12 d測(cè)定1次，總計(jì)測(cè)定5次。測(cè)定時(shí)，將一張意蜂標(biāo)準(zhǔn)脾大小的透明塑料片畫成4.5 cm×4.5 cm的方格，每格含100個(gè)封蓋子。取脾，抖去成年蜂，將塑料片覆于巢脾上，數(shù)封蓋子格數(shù)。不足格的封蓋子，可多個(gè)方格組合，記為一格，并記錄數(shù)據(jù)。

1.3.2 蜂箱溫濕度測(cè)定 在上述蜂群的蜂箱底部放入指針式溫濕度計(jì)，蓋好蜂箱蓋。于8月7日、9月19日和9月26日07：00、11：00、13：00和17：00對(duì)每個(gè)蜂群的箱內(nèi)溫濕度進(jìn)行采集，并記錄數(shù)據(jù)。

1.3.3 蜂群抗巢蟲性能測(cè)定 取一張蜂群中蜜脾，取出所有蜂蜜后放入蜂群隔板外側(cè)，放置6 d。其中，意蜂標(biāo)準(zhǔn)箱取1張脾，多層活框蜂箱取2脾。第7天，檢查并記錄該脾上巢蟲數(shù)及含有巢蟲卵的巢房數(shù)。同時(shí)，對(duì)蜂群其他封蓋子脾上的白頭蛹進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算每意蜂標(biāo)準(zhǔn)脾含白頭蛹數(shù)（每脾白頭蛹數(shù)=總白頭蛹數(shù)/巢脾數(shù)）。

1.3.4 GST4與SOD抗氧化基因表達(dá)分析 從上述兩種蜂箱的10蜂群中，隨機(jī)選取6群，每種蜂箱3群。從每群中采集5只剛出房工蜂幼蜂，立即液氮冷凍處死。取工蜂頭部，參照張麗珍[14]的方法，通過(guò)Trizol法進(jìn)行提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物設(shè)計(jì)參照東方蜜蜂GST4與Cu-Zn SOD基因序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列（表3），由上海生工合成。以東方蜜蜂β-actin作為內(nèi)參基因，進(jìn)行熒光定量PCR分析。每個(gè)生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行3個(gè)技術(shù)重復(fù)。熒光定量PCR反應(yīng)體系（10 μL）：cDNA 1 μL，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ddH2O 3.2 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)熱2 min，40個(gè)循環(huán)（94℃，15 s；60℃，30 s；72℃，30 s）。每個(gè)樣品進(jìn)行5個(gè)技術(shù)重復(fù)。最后，利用2-ΔΔCt公式計(jì)算各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量[15]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

蜂群封蓋子數(shù)和熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Stat view 5.01統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為差異顯著。溫濕度、巢蟲數(shù)、巢蟲卵的巢房數(shù)和白頭蛹數(shù)據(jù)采用非參數(shù)分析中的Kruskal-Wallis（SPSS Statistics Base 17.0）進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種蜂箱蜂群封蓋子數(shù)比較

通過(guò)5次封蓋子數(shù)測(cè)定，多層活框蜂箱蜂群封蓋子數(shù)成遞增趨勢(shì)，而朗氏標(biāo)準(zhǔn)蜂箱蜂群封蓋子數(shù)在后期出現(xiàn)下降趨勢(shì)，且第5次測(cè)定的封蓋子數(shù)顯著低于多層活框蜂箱組（圖1，P＜0.05），表明多層活框蜂箱更利于蜂群繁殖。

圖1 兩種蜂箱蜂群封蓋子數(shù)測(cè)定Fig.1 Comparison of capping brood amounts between two hive types

2.2 兩種蜂箱箱內(nèi)溫濕度比較

對(duì)兩種蜂箱保溫保濕效果進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明：兩種蜂箱在11:00與14:00時(shí)箱內(nèi)溫濕度均無(wú)差異，而07:00與19:00時(shí)，多層活框蜂箱的保溫和保濕效果均明顯優(yōu)于朗氏標(biāo)準(zhǔn)蜂箱（表1）。

表1 兩種蜂箱箱內(nèi)溫濕度比較Tab.1 Comparison of in-hive temperature and humidity between two hive types

2.3 兩種蜂箱蜂群抗巢蟲性能比較

蜂群抗巢蟲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，朗氏標(biāo)準(zhǔn)蜂箱的各巢蟲感染指標(biāo)均高于多層活框蜂箱，且巢蟲卵巢房的數(shù)量和每脾白頭蛹數(shù)量顯著高于多層活框蜂箱（表2）。

2.4 兩種蜂箱工蜂GST4和SOD基因表達(dá)分析

引物序列設(shè)計(jì)見表3，多層活框蜂箱飼養(yǎng)的初生工蜂SOD基因表達(dá)顯著高于朗氏標(biāo)準(zhǔn)蜂箱初生工蜂，而GST4基因表達(dá)差異不顯著（圖2）。

表2 兩種蜂箱蜂群抗巢蟲性能比較Tab.2 Comparison of wax moth defense ability between two hive-type colonies

表3 熒光定量引物序列Tab.3 Gene-specific primers used in real time quantitative PCR

3 結(jié)論與討論

蜂箱不僅是主要蜂機(jī)具，其結(jié)構(gòu)和設(shè)計(jì)可顯著影響蜂群的生產(chǎn)性能和繁殖性能等。本研究系統(tǒng)評(píng)估了一種中蜂多層活框蜂箱，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這種蜂箱可有效提高中蜂的繁殖力，其抗巢蟲和保溫保濕性能均明顯高于朗氏標(biāo)準(zhǔn)箱。

蜂箱對(duì)中蜂的繁殖性能的影響已有諸多報(bào)道。FWF型中蜂蜂箱繁蜂效果好[4]；中蜂短框箱保溫保濕效果好，繁蜂速度也優(yōu)于其他傳統(tǒng)蜂箱[8]。這些中蜂蜂箱均具有巢脾尺寸小，蜂箱小于朗氏標(biāo)準(zhǔn)蜂箱的特點(diǎn)。本研究的多層活框蜂箱也為小尺寸蜂箱，其繁蜂性能也優(yōu)于朗氏標(biāo)準(zhǔn)蜂箱。因此，小尺寸巢脾更適合中蜂蜂王產(chǎn)卵和繁殖，可形成滿子脾現(xiàn)象，更利于工蜂對(duì)幼蟲和封蓋子的哺育和照顧。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，多層活框蜂箱的保溫保濕效果也明顯優(yōu)于朗氏標(biāo)準(zhǔn)蜂箱。前人研究[16-19]表明，蜂箱內(nèi)溫度和濕度可直接影響蜂群中幼蟲的發(fā)育、存活率以及蜂群食物的消耗水平。而這些因素對(duì)蜂群內(nèi)哺育幼蟲的數(shù)量和存活率有著重要影響[17，19-20]。因此，多層活框蜂箱提高中蜂繁殖性能的主要原因很可能是其良好的保溫保濕效果為幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育提供了良好穩(wěn)定的環(huán)境基礎(chǔ)及可形成滿子脾使得繁殖區(qū)與食物貯藏區(qū)得以分開利于哺育蜂對(duì)幼蟲的照料，提高幼蟲和蛹的成活率。

圖2 兩種蜂箱蜂群兩個(gè)基因表達(dá)比較Fig.2 Comparison of GST4 and SOD gene expression between two hive types

本研究發(fā)現(xiàn)多層活框蜂箱可提高中蜂蜂群的抗巢蟲性能。當(dāng)蜂群受到巢蟲侵害時(shí)，中蜂工蜂常通過(guò)去除巢蟲和撕咬巢脾以抵御巢蟲危害[2]。蔡呈貴等[21]報(bào)道飼養(yǎng)中蜂強(qiáng)群可提高蜂群的抗巢蟲能力。多層活框蜂箱的抗巢蟲性能可能與其較強(qiáng)的群勢(shì)及較小的巢脾尺寸有關(guān)。此外，多層活框蜂箱底板為可活動(dòng)底板，在飼養(yǎng)管理中方便清理底板木屑和蠟屑等物質(zhì)，不利于巢蟲滋生，也可降低蜂群受巢蟲危害的風(fēng)險(xiǎn)。多層蜂箱飼養(yǎng)的初生工蜂SOD基因表達(dá)量顯著高于飼養(yǎng)于朗氏標(biāo)準(zhǔn)蜂箱中的工蜂，表明飼養(yǎng)于多層活框蜂箱中的工蜂其抗氧化性能較高。多數(shù)研究[22-24]發(fā)現(xiàn)飼料的營(yíng)養(yǎng)水平會(huì)影響蜜蜂體內(nèi)SOD基因的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)多層活框蜂箱可維持較強(qiáng)的群勢(shì)和較好的保溫保濕效果，提高的蜂群的內(nèi)環(huán)境水平，也可以提高蜜蜂的SOD基因表達(dá)量，提高其抗氧化能力，但其機(jī)理仍待進(jìn)一步研究。