楊 明，袁 悅，李憲臻，楊 帆

（大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

【研究意義】纖維素是地球上最豐富的有機(jī)聚合物，平均占植物生物量的30%～50%[1-2]。研究纖維素降解相關(guān)菌群對(duì)于解決農(nóng)業(yè)廢棄物的回收利用、可再生能源的開發(fā)等環(huán)境和能源問題有著重要意義[3-4]。纖維素是由D-葡萄糖以β-1，4糖苷鍵連接構(gòu)成，由于聚合度高加之結(jié)晶度高的特性，導(dǎo)致其難以降解，極大地限制了纖維素在上述相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用[5]。纖維素的生物降解需要多種纖維素酶協(xié)同完成，包括內(nèi)切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶，纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶等[6-7]。纖維素酶是由纖維素降解菌合成分泌，纖維素降解菌廣泛存在于自然界中，多分布在纖維素聚集和降解的環(huán)境[8]。這些環(huán)境中多以微生物復(fù)合菌系協(xié)同作用的方式完成纖維素的降解，因此研究環(huán)境細(xì)菌多樣性對(duì)于闡明纖維素生物降解機(jī)理顯得尤為重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】瘤胃、堆肥和森林土壤等是研究的較多的纖維素降解環(huán)境[9]，其中含有大量能夠降解纖維素的微生物。目前已有很多關(guān)于纖維素酶產(chǎn)生菌的研究報(bào)道，其中大多數(shù)中篩選自動(dòng)物瘤胃、堆肥、森林土壤等環(huán)境[10-11]。然而，基于純培養(yǎng)的傳統(tǒng)分析方法存在很大的局限性，自然界中超過99%的微生物都是不可培養(yǎng)的[12]。隨著高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，16S rDNA基因擴(kuò)增子高通量測序分析技術(shù)可直接針對(duì)細(xì)菌群落進(jìn)行分析，基于16S rDNA的高變區(qū)序列信息對(duì)微生物群落中的細(xì)菌進(jìn)行物種種類和豐度的鑒定[13]，能夠更全面地分析微生物多樣性。Li等[14]應(yīng)用16S rDNA基因測序方法對(duì)牛瘤胃菌群進(jìn)行了分析，獲得了以45個(gè)核心微生物屬為主的共107個(gè)細(xì)菌屬，展現(xiàn)出豐富的菌群多樣性。Ren等[15]對(duì)牛糞堆肥中的微生物群落進(jìn)行了16S r DNA基因高通量測序分析，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢菌門包括擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門和放線菌門，并且發(fā)酵的不同階段具有不同的細(xì)菌。王志方等[16]應(yīng)用16S rDNA高通量測序技術(shù)對(duì)棉秸稈自然腐解過程中不同時(shí)間點(diǎn)的樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在第7天時(shí)細(xì)菌群落多樣性在屬水平上與腐解起始階段差異顯著（P＜0.05），隨著腐解時(shí)間延長，菌落多樣性趨于一致；在整個(gè)腐熟過程中始終存在5個(gè)優(yōu)勢屬，功能預(yù)測為降解纖維素、木質(zhì)素、果膠類物質(zhì)以及提供氮素營養(yǎng)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，測序技術(shù)以超摩爾定律的速度在不斷發(fā)展，測序成本越來越低[17]，16S rDNA基因測序數(shù)據(jù)也在不斷加速積累，且海量的數(shù)據(jù)被公開于NCBI-SRA數(shù)據(jù)庫，這其中也包括瘤胃、堆肥、土壤等不同自然環(huán)境下纖維素降解菌群數(shù)據(jù)。此外，盡管16S rDNA基因測序技術(shù)在纖維素降解菌群的結(jié)構(gòu)和多樣性研究方面取得了進(jìn)展，但這些研究多數(shù)僅僅關(guān)注的是來自某種特定環(huán)境的纖維素降解菌群，卻很少有研究對(duì)不同環(huán)境下的纖維素降解菌群進(jìn)行比較分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究選取了來自NCBI-SRA數(shù)據(jù)庫中的牛瘤胃、牛糞堆肥、森林土壤3種代表性的纖維素降解菌群和作為對(duì)照的家犬腸道微生物群落共102個(gè)的16S rDNA樣本的高通量測序數(shù)據(jù)，對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行了細(xì)菌群落多樣性的共性和差異分析，以評(píng)估不同來源的纖維素降解菌群在各個(gè)分類級(jí)別上的共性和差異特征，鑒定各類菌群的生物標(biāo)志物，對(duì)功能主導(dǎo)性菌群進(jìn)行挖掘，為進(jìn)一步探索纖維素降解菌群的功能、研究纖維素降解生物學(xué)機(jī)制以及開發(fā)有利用價(jià)值的微生物提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 數(shù)據(jù)采集 16S rDNA Illumina Miseq高通量測序數(shù)據(jù)搜索自NCBI（National Center of Biotechnology Information）的SRA（Sequence Read Archive）數(shù)據(jù)庫中收錄的牛瘤胃BR（SRA ID：SRP156364）、牛糞堆肥CDC（SRA ID：SRP074428）、森林土壤FS（SRA ID：SRP125392）和家犬糞便DF（SRA ID：SRP092477）4個(gè)項(xiàng)目的樣本數(shù)據(jù)。

1.1.2 數(shù)據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn) 將搜索到的數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，保留16S rDNA數(shù)據(jù)篩選均需符合下列生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和相應(yīng)的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)：（1）牛瘤胃菌群來自愛爾蘭米斯郡歐洲農(nóng)業(yè)食品有限公司的健康牛瘤胃；（2）牛糞堆肥菌群來自加拿大農(nóng)業(yè)與食品學(xué)會(huì)的牛糞好氧堆肥；（3）森林土壤菌群FS采集自中國遼寧省撫順市林場的針葉林表層土（深度不超過10 cm）細(xì)菌；（4）家犬糞便DF微生物樣本為未作處理的健康狀態(tài)下家犬的新鮮糞便樣本，來自密蘇里大學(xué)（美國密蘇里州哥倫比亞）。技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)：（1）16S rDNA基因擴(kuò)增序列為V4區(qū)；（2）測序平臺(tái)為Illumina Miseq測序平臺(tái)；（3）測序數(shù)據(jù)量不小于30 Mbp。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

應(yīng)用SRA Toolkit軟件中的fastq-dump命令將sra格式的文件轉(zhuǎn)換為FastQ格式[18]。FastQ格式的雙末端reads經(jīng)過濾獲得高質(zhì)量reads[19]。應(yīng)用FLASH軟件[20]將雙末端reads拼接成Tags，并去除沒有overlap關(guān)系的reads，低質(zhì)量的Tags（雙末端reads最小重疊長度為15 bp，其重疊區(qū)域錯(cuò)配率＞10%）以及攜帶的引物序列的Tags，從而得到高質(zhì)量Tags。應(yīng)用SRA Toolkit軟件中的fastq-dump命令下載SRA格式的文件并轉(zhuǎn)換為FastQ格式。應(yīng)用USEARCH GLOBAL方法，將Tags重新比對(duì)回OTU序列得到每個(gè)樣品在每個(gè)OTU的豐度統(tǒng)計(jì)表[24]。應(yīng)用RDP classifier（v2.2）[25]將OTU與Greengenes數(shù)據(jù)庫[26]比對(duì)進(jìn)行物種注釋（如果Tag長度大于等于250 bp，置信度閾值設(shè)置為0.8，否則設(shè)置為0.5），去除沒有注釋結(jié)果和非細(xì)菌物種的OTU，并根據(jù)注釋結(jié)果計(jì)算每個(gè)樣本組在各分類水平（門、綱、目、科和屬）的群落組成結(jié)構(gòu)信息。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

Alpha多樣性反映了單個(gè)樣本內(nèi)物種的多樣性。mothur軟件計(jì)算Alpha多樣性的觀察指數(shù)（observed species index）、趙氏指數(shù)（chao1 index）、艾斯指數(shù)（abundance-based coverage estimator index，ACE index）、香農(nóng)-維納指數(shù)（shannon-wiener index）和辛普森指數(shù)（simpson index）。觀察指數(shù)反映的是已經(jīng)檢測到的物種數(shù)量；趙氏指數(shù)和艾斯指數(shù)則是基于物種和豐度值對(duì)真實(shí)物種數(shù)的推測；香農(nóng)-維納指數(shù)和辛普森指數(shù)則反映群落的多樣性，是物種數(shù)量和豐度分布均一性的綜合反映。Beta多樣性分析用于評(píng)估樣品在物種復(fù)雜性上的差異距離。通過QIIME（v1.80）[27]計(jì)算加權(quán)和非加權(quán)Unifrac距離[28]，主坐標(biāo)分析（PCoA）使用的是R軟件（v3.0.3）的WGCNA，stats和ggplot2軟件包，即將加權(quán)或非加權(quán)UniFrac距離矩陣轉(zhuǎn)化為一組新的正交軸，其中最大變異的因子作為第一主坐標(biāo)，第二大變異因子作為第二主坐標(biāo)表示。R軟件的VennDiagram包用于繪制Venn圖，ggplot2包用于繪制箱線圖和柱狀圖。Metastats軟件（http://metastats.cbcb.umd.edu）用于組間顯著性差異分析。統(tǒng)計(jì)假設(shè)檢驗(yàn)均以α=0.05為標(biāo)準(zhǔn)界定是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LEfSe（v1.0）[29]用于發(fā)現(xiàn)各組中物種生物標(biāo)志物（Biomarker），其LDA分?jǐn)?shù)的閾值設(shè)為4。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同纖維素降解環(huán)境菌群多樣性分析與比較

牛瘤胃BR、牛糞堆肥CDC、森林土壤FS和家犬糞便DF 4個(gè)組共102個(gè)樣本的16S rDNA基因擴(kuò)增子測序數(shù)據(jù)經(jīng)過前處理，共獲得8 122 885條高質(zhì)量16S rDNA標(biāo)簽序列，平均每個(gè)樣本的數(shù)量約為79 636，在97%的相似水平上進(jìn)行操作分類單元（OTU）序列聚類，共獲得80 386個(gè)OTU類群。觀察物種指數(shù)（observed species index）結(jié)果顯示物種平均豐富度由高到低為牛糞堆肥、家犬糞便、牛瘤胃，森林土壤僅顯著低于牛糞堆肥，但與其他兩組無顯著差異。趙氏指數(shù)（chao1 index）和艾斯指數(shù)（ACE index）結(jié)果均顯示平均物種豐富度最高為牛糞堆肥，其次為家犬糞便和牛瘤胃，而森林土壤與其他環(huán)境未表現(xiàn)出顯著差異。香農(nóng)-維納指數(shù)（shannon-wiener index）和辛普森指數(shù)（simpson index）均可以用來估算細(xì)菌多樣性。香農(nóng)-維納指數(shù)值越大，細(xì)菌多樣性越高；辛普森指數(shù)介于0和1之間，與香農(nóng)-維納指數(shù)相反，數(shù)值越低細(xì)菌的多樣性越高。因此，這兩個(gè)細(xì)菌多樣性指數(shù)均顯示牛糞堆肥菌群多樣性顯著高于其他環(huán)境，且牛瘤胃的香農(nóng)-維納指數(shù)顯著高于家犬糞便。

本研究對(duì)4個(gè)群落的Unifrac Beta多樣性進(jìn)行分析并用主坐標(biāo)分析（PCoA）的可視化方式進(jìn)行展示，以評(píng)估各樣本之間的相似度和差異。如圖2所示，非加權(quán)Unifrac PCoA的第一主坐標(biāo)貢獻(xiàn)率達(dá)19.6%，第二主坐標(biāo)貢獻(xiàn)率達(dá)15.2%，共代表總變量的34.8%；加權(quán)Unifrac PCoA的第一主坐標(biāo)貢獻(xiàn)率達(dá)31.2%，第二主坐標(biāo)貢獻(xiàn)率達(dá)16.3%，共代表總變量的47.5%?；贠TU豐度數(shù)據(jù)可以把同一個(gè)樣本組的菌群樣本聚集在一定區(qū)域內(nèi)，而不同樣本組間獲得了很好的分離。

2.2 不同纖維素降解環(huán)境菌群的組成差異

所有樣本組中總共檢測出55個(gè)門，其中Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria是4個(gè)最優(yōu)勢門，他們均在牛瘤胃和牛糞堆肥中均占有很大比例（圖3a）。作為對(duì)照的家犬糞便菌群以Bacteroidetes、Firmicutes、梭桿菌門（Fusobacteria）和Proteobacteria為最優(yōu)勢門，F(xiàn)usobacteria是其特有門，另外存在極少量的Actinobacteria。牛糞堆肥中Bacteroidetes相對(duì)豐度顯著低于其他菌群（圖3d），而Actinobacteria的相對(duì)豐度顯著高于其他菌群（圖3e）。與牛瘤胃和牛糞堆肥不同，森林土壤環(huán)境中的Proteobacteria顯著高于其他纖維素降解環(huán)境（圖3b），僅存在極低豐度的Firmicutes（圖3c）。

屬水平上所有樣本中總共檢測到1 936個(gè)屬，選取相對(duì)豐度最高的前17個(gè)屬（不包括Unclassified、Others和Uncultured）進(jìn)行了比較（圖4a）。家犬糞便中的優(yōu)勢屬包括梭桿菌屬（Fusobacterium）、擬桿菌屬（Bacteroides）、糞桿菌屬（Faecalibacterium）、Prevotella-9和乳酸菌屬（Lactobacillus），除了Lactobacillus外其余均為家犬糞便中的特有菌屬。牛瘤胃中相對(duì)豐度較高的屬有琥珀酸弧菌UCG-001屬（SuccinivibrionaceaeUCG-001）、Prevotella-7、甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）、Succiniclasticum、Prevotella-1和少量的Lactobacillus，其中SuccinivibrionaceaeUCG-001和Succiniclasticum僅在牛瘤胃中被觀察到，而Prevotella在動(dòng)物消化道來源的環(huán)境中均有發(fā)現(xiàn)，不同的是Prevotella-7和Prevotella-1存在于牛瘤胃中，而Prevotella-9存在于家犬糞便中。Methanobrevibacter在牛瘤胃和牛糞堆肥中均被檢測到，牛糞堆肥中的相對(duì)豐度較低。牛糞堆肥中的觀察到的特有菌屬包括Halocella、Limnochordaceae-ge和氫孢菌屬（Hydrogenispora）。另外，Pseudomonas僅在牛糞堆肥和森林土壤中被檢測到，且在前者中相對(duì)豐度極顯著低于后者（P＜0.01）。此外，黃桿菌屬（Flavobacterium）、NS3a海洋菌屬（NS3amarine group）和假噬纖維菌屬（Pseudarcicella）屬為森林土壤中所特有。

圖3 不同環(huán)境菌群門水平相對(duì)豐度分布和優(yōu)勢菌門差異比較Fig.3 Relative abundance distribution at phylum level and the difference of relative abundance of dominant phylum in different environments

圖4 不同環(huán)境菌群下屬水平優(yōu)勢菌群相對(duì)豐度分布和Venn圖Fig.4 Relative abundance distribution and Venn diagram at genus level in different environments

韋恩圖分析（圖4b）表明僅有73（4.44%）個(gè)屬是4類菌群共有的，86個(gè)屬是3類纖維素降解菌群共有的。而森林土壤和牛糞堆肥中的特有屬較多，分別為677和224個(gè)；牛瘤胃和家犬糞便中的特有的屬分別僅觀察到10和56個(gè)。屬水平統(tǒng)計(jì)的物種豐富度從高到低表現(xiàn)為森林土壤、牛糞堆肥、牛瘤胃、家犬糞便，分別檢測到1 413、1 044、414和269個(gè)屬。

圖5 不同環(huán)境菌群的LEfSe分析Fig.5 LEfSe analysis of bacterial communities from different environments

2.3 不同纖維素降解環(huán)境菌群生物標(biāo)志物分析

為了更進(jìn)一步考察不同環(huán)境中纖維素降解菌的差異尋找不同環(huán)境的關(guān)鍵菌群，本研究對(duì)物種注釋后獲得的OTUs豐度譜進(jìn)行了線性判別分析效應(yīng)值（LEfSe）分析（圖5）。LEfSe為最近出現(xiàn)的一種基于線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）效應(yīng)量（effect size）的分析方法，其本質(zhì)是將非參數(shù)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis多組檢驗(yàn)與Wilcoxon秩和檢驗(yàn)）與線性判別分析相結(jié)合，從而篩選關(guān)鍵的生物標(biāo)志物（比如關(guān)鍵功能類群/物種）[30]。結(jié)果顯示，牛瘤胃、牛糞堆肥、森林土壤及家犬糞便組間具有顯著差異的不同級(jí)別分類單元重要的生物標(biāo)志物數(shù)量分別為12、5、9和13。由于不同分類級(jí)別的生物標(biāo)志物之間存在從屬關(guān)系，表1對(duì)LEfSe分析結(jié)果進(jìn)行了整理，并對(duì)各個(gè)生物標(biāo)志物的相對(duì)豐度進(jìn)行標(biāo)識(shí)，以直觀展示不同環(huán)境中重要生物標(biāo)志性物種及其相對(duì)豐度。生物標(biāo)志物將以門水平和最低級(jí)別分類水平加以描述。對(duì)照組家犬糞便的生物標(biāo)志物包括Bacteroidetes的Bacteroides、Fusobacteria的Fusobacterium以及來自Firmicutes的Faecalibacterium。與對(duì)照組同為動(dòng)物消化系統(tǒng)直接來源菌群，牛瘤胃組中的生物標(biāo)志物包括廣古菌門（Euryarchaeota）、來自Proteobacteria的SuccinivibrionaceaeUCG-001、來自Bacteroidetes的Prevotella-7、來自Firmicutes的Selenomonadales和Lachnospiraceae；作為動(dòng)物消化系統(tǒng)和體外環(huán)境來源的混合菌群，牛糞堆肥組的生物標(biāo)志物為來自Actinobacteria門Actinobacteria綱和來自Firmicutes的Bacillales；作為體外環(huán)境來源菌群森林土壤組生物標(biāo)志物以Proteobacteria為主，包括Pseudomonas、Alphaproteobacteria、伯克氏菌科（Burkholderiaceae）以及Bacteroidetes門的Flavobacteriaceae。

表1 不同環(huán)境菌群的生物標(biāo)志物及其相對(duì)豐度*Tab.1 Relative abundance of biomarkers from different environments

3 討論

隨著二代測序技術(shù)成本逐漸降低和技術(shù)的不斷更新，16S rDNA擴(kuò)增子測序技術(shù)被廣泛用于纖維素降解菌群多樣性的研究中，加強(qiáng)了人們對(duì)纖維素降解菌群結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)知。然而大多數(shù)研究者僅關(guān)注于單一環(huán)境類型中的纖維素降解菌群，卻鮮有對(duì)不同環(huán)境下的纖維素降解菌群進(jìn)行分析。本研究以家犬糞便菌群16S rDNA序列數(shù)據(jù)為對(duì)照，選擇來自牛瘤胃、牛糞堆肥、森林土壤的3類菌群數(shù)據(jù)作為不同環(huán)境條件下的纖維素降解菌群，對(duì)其菌群結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行對(duì)比分析，旨在闡明菌群的結(jié)構(gòu)和功能，為進(jìn)一步挖掘有潛在應(yīng)用價(jià)值的纖維素降解菌以及解析纖維素降解功能奠定理論基礎(chǔ)。

菌群多樣性分析發(fā)現(xiàn)，牛糞堆肥菌群在物種種類和物種豐度的均一性上均高于其他組別，牛糞堆肥菌群是來自于厭氧牛體內(nèi)環(huán)境和體外環(huán)境的混合菌群，這可能是造成上述現(xiàn)象的一個(gè)原因。森林土壤組內(nèi)樣本的alpha多樣性指數(shù)之間差異較大，可能與其復(fù)雜多變的環(huán)境和采樣的時(shí)間地點(diǎn)有關(guān)，菌群多樣性高可能更有利于應(yīng)對(duì)復(fù)雜多變環(huán)境，比如對(duì)溫差、濕度等的適應(yīng)性。此外，物種豐度分析顯示森林土壤中屬的數(shù)量高于牛糞堆肥，可能是由森林土壤組內(nèi)樣本差異大造成。PCoA分析結(jié)果充分說明了樣本分組的可靠性，同時(shí)表明來源于不同環(huán)境的菌群之間的群落多樣性存在較大差異。

本研究檢測到Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria 4個(gè)來自纖維素降解菌群的優(yōu)勢門，這與先前的許多報(bào)道一致[31-34]。Firmicutes存在大量纖維素降解菌[35]，可能是牛瘤胃和牛糞堆肥菌群中降解纖維素的主要門。Bacteroidetes對(duì)多糖等碳水化合物具有較好的降解能力[36]，在4個(gè)菌群中均大量存在，是家犬腸道中的生物標(biāo)志物。有研究表明，Actinobacteria是降解木質(zhì)素與纖維素的主要功能菌門[2，37]。在土壤有機(jī)層中豐度最高的門為Proteobacteria和Bacteroidetes，而Firmicutes則更多的存在于礦物土壤中[38]，這與本研究結(jié)果一致，說明Proteobacteria是森林土壤中纖維素降解重要門。此外，Euryarchaeota常被發(fā)現(xiàn)于牛瘤胃中，然而很少有證據(jù)證明其纖維素降解能力，盡管Sorokin等[39]首次鹽古菌（Haloarchaea）具備降解幾丁質(zhì)和纖維素的能力，然而本研究中并未檢出鹽古菌。

LEfSe分析可幫助研究者發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物，但也存在靈敏度不足的情況導(dǎo)致一些特異性的功能性細(xì)菌漏檢，因此對(duì)LEfSe分析結(jié)果和環(huán)境特異性屬進(jìn)行整合可作為一種優(yōu)化的方法鑒定環(huán)境特異性纖維素降解菌。家犬糞便以Fusobacterium、Bacteroides和Faecalibacterium為生物標(biāo)志物，其特有優(yōu)勢菌屬為Prevotella-9和Lactobacillus，均為雜食性哺乳動(dòng)物腸道常見菌株[40]。牛瘤胃的生物標(biāo)志物包括Lachnospiraceae、Euryarchaeota、SuccinivibrionaceaeUCG-001、Prevotella-7和Selenomonadales，除此之外其特有優(yōu)勢菌屬還包括Prevotella-1，Succiniclasticum和Methanobrevibacter。Clostridiales是瘤胃中纖維小體的主要生產(chǎn)者[41]。Lachnospiraceae屬于Clostridiales，是牛瘤胃中的優(yōu)勢菌，存在能夠降解纖維素的細(xì)菌，如丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）和互養(yǎng)球菌屬（Syntrophococcus）等[42]。另外，Seshadri等[43]在410個(gè)瘤胃細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中發(fā)現(xiàn)大量參與形成纖維素體的Clostridiales細(xì)菌。SuccinivibrionaceaeUCG-001是Aeromonadales中的最優(yōu)勢屬，Succinivibrionaceae可發(fā)酵淀粉等碳水化合物產(chǎn)生琥珀酸和醋酸鹽，有可能參與纖維素代謝中間產(chǎn)物的降解，但尚未發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)報(bào)道該科可降解纖維素。Prevotella是纖維素降解過程中的優(yōu)勢屬[44-46]，Prevotella的細(xì)菌（如P.ruminicola等）可直接生產(chǎn)纖維素酶，厭氧環(huán)境中可與其他纖維素降解菌協(xié)同降解纖維素[35，47]。Selenomonadales來自厭氧菌綱（Negativicutes）最優(yōu)勢的屬為月形單胞菌屬（Selenomonas），以降解淀粉為主[48]，但某些菌株（如S.ruminantium）具備纖維素降解功能[49]。Succiniclastium是典型的纖維降解菌，能發(fā)酵降解纖維素或纖維二糖產(chǎn)生琥珀酸、乙酸和二氧化碳等[50]。Methanobrevibacter是Euryarchaeota門的最優(yōu)勢屬，是一類產(chǎn)甲烷菌[51]。牛糞堆肥中的生物標(biāo)志物為Actinobacteria和Bacillales。Bacillales中存在較多纖維素降解菌，比如常見的來源于堆肥或土壤纖維素降解菌Bacillus等[52]。Actinobacteria（綱）有著基因組GC含量高以及細(xì)胞壁厚的特點(diǎn)，能適應(yīng)高溫、強(qiáng)堿等極端環(huán)境，其中很多細(xì)菌具有纖維素降解能力，如Actinanyces cellulose、諾卡氏菌屬（Nocardia）和鏈霉菌屬（Streptomyces）等[53-55]，因此Actinobacteria可能是牛糞堆肥中重要的纖維素降解菌。另外，牛糞堆肥中特有優(yōu)勢菌屬包括Halocella、Limnochordaceae-ge和Hydrogenispora，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Halocella包括H.cellulosilytica和H.sp.SP3-1，可在高鹽環(huán)境下生存，均具備降解纖維素和纖維二糖的能力[56-57]。Hydrogenispora來自梭菌綱（Clostridia），與Clostridiumsp.6-31較為近緣，能夠發(fā)酵降解多種碳水化合物[58]，但尚無充分證據(jù)支持其纖維素降解能力。有關(guān)Limnochordaceae-ge屬的相關(guān)報(bào)道并不多，有待于進(jìn)一步研究。森林土壤組的生物標(biāo)志物包括Alphaproteobacteria、Pseudomonas、Flavobacteriaceae以及Burkholderiaceae。Pseudomonas屬于嚴(yán)格好氧型纖維素降解菌，可產(chǎn)生纖維素酶[59-60]，在牛糞堆肥中的豐度低于森林土壤，可能是森林土壤和牛糞堆肥的重要的纖維素降解菌。Flavobacteriaceae的優(yōu)勢屬為NS3amarine group和Flavobacterium，僅發(fā)現(xiàn)于森林土壤。Flavobacterium能夠降解復(fù)雜有機(jī)物質(zhì)如纖維素、半纖維素、幾丁質(zhì)等有機(jī)聚合物[61-63]。NS3amarine group常常在海洋藻類中與Flavobacterium一起被發(fā)現(xiàn)[64]，推測其可能具備纖維素降解功能。Alphaproteobacteria在森林土壤中被大量發(fā)現(xiàn)，最優(yōu)勢屬包括Brevundimonas、生絲單胞菌屬（Hyphomonas）和紫桿菌屬（Porphyrobacter）等，物種種類較為豐富，但各屬的相對(duì)豐度較低，但其中也存在纖維素降解菌，比如Rhodobacterales中Brevundimonas和Hyphomonas均具備降解纖維素能力，其中Brevundimonas可在低溫環(huán)境下產(chǎn)生纖維素酶[65-66]。森林土壤樣本中的Burkholderiaceae的諸多細(xì)菌具備降解纖維素的能力如伯克氏菌屬（Burkholderia）[67]。Pseudarcicella屬是2012年K?mpfer等[68]在醫(yī)用水蛭皮膚上發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新屬，被歸屬于噬纖維菌科（Cytophagaceae），其中絕大多數(shù)物種均有纖維素降解功能[69]，故推測其具備纖維素降解功能。

4 結(jié)論

本研究對(duì)4組來自于不同環(huán)境的共102個(gè)環(huán)境微生物群落樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。Alpha多樣性顯示，牛糞堆肥中物種種類和豐度的alpha多樣性指數(shù)顯著高于其他兩種纖維素降解菌群。基于非加權(quán)和加權(quán)Unifrac距離的PCoA分析說明不同環(huán)境中的纖維素降解菌群的微生物多樣性差異較大。Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria是本研究在各類環(huán)境菌群間檢測到的最具優(yōu)勢的4個(gè)門，不同環(huán)境間在門水平就存在著顯著差異，表現(xiàn)出了特異性。各類環(huán)境菌群間在屬水平上差異極大，絕大多數(shù)屬表現(xiàn)出有和無的定性差異，進(jìn)一步說明不同樣本的纖維素降解菌群多樣性的不同。LEfSe分析鑒定到了牛瘤胃、牛糞堆肥、森林土壤中的生物標(biāo)志物分別有5、2和4個(gè)。最后，LEfSe結(jié)果、屬水平相對(duì)豐度信息以及先前的文獻(xiàn)報(bào)道的綜合分析和討論，鑒定到牛瘤胃、牛糞堆肥、森林土壤中同時(shí)具備環(huán)境特異性和纖維素降解功能的細(xì)菌分類單元分別有4，3和5個(gè)。本研究從宏觀層面即來自不同環(huán)境的纖維素降解菌群的多樣性和差異進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步闡明天然細(xì)菌群落的纖維素降解的協(xié)同作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為構(gòu)建具備相應(yīng)環(huán)境適應(yīng)性的纖維素降解菌群以及篩選在生產(chǎn)生活中有應(yīng)用價(jià)值的菌株提供了理論指導(dǎo)。