耿帥峰 褚夫江 徐天生 歐陽學琭 李 婷

(1.好易康生物科技(廣州)有限公司，廣東廣州 510320；2.廣東藥科大學，廣東廣州 510006)

隨著人民生活水平和文明程度的提高，人們對口腔的健康越來越重視。每個人要想有個良好的口腔，所以每天的口腔護理是必不可少的；但要想提高全社會的整體口腔健康水平，就應該從兒童時期引導其口腔護理，養(yǎng)成規(guī)律性的口腔清潔護理習慣。在日常生活中，兒童由于缺乏自覺性和認識，平時喜歡吃高糖食品，以及父母沒有很好引導致使其出現(xiàn)牙齒齲病、疼痛等癥狀。幼兒是牙齒發(fā)育的重要時期，兒童的口腔黏膜抵抗外界刺激能力較差，其牙齒嫩弱易受外力傷害、易于產(chǎn)生蛀牙，因此保障幼兒的口腔健康是讓其茁壯成長的關(guān)鍵。當前，兒童牙膏的主要成分是以成人牙膏為基準， 只是相應減少一些可能造成兒童身體損傷的成分。在一些功效成分牙膏中，兒童牙膏相對于成人牙膏，只是簡單的減少功效成分含量，這樣也會相應地減弱了兒童牙膏保護口腔健康的作用。

溶菌酶是一種非特異性物質(zhì)成分，可以抑制微生物生長；與抗生素或其他抑菌物質(zhì)對比，長期使用溶菌酶不會出現(xiàn)抗藥性[1]。溶菌酶能選擇性地溶解目標微生物細胞壁而使其失活，哺乳動物無細胞壁，因此，溶菌酶對口腔組織無損傷，而是起到保護作用，將其添加到口腔護理用品中抑制口腔常見致病微生物具有較好的推廣和應用前景[2]。

低聚果糖是一種益生元，低聚果糖可以選擇性的增殖雙歧桿菌，從而調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，維持腸道健康。低聚果糖作為水溶性膳食纖維，攝入后可刺激腸道蠕動，改變腸道內(nèi)容物的滲透壓，增加糞便水分，起到潤腸通便、緩解便秘的作用。低聚果糖還可有效降低體內(nèi)游離脂肪酸、甘油三脂和血清膽固醇的含量，對動脈硬化、高血壓等心血管疾病有改善作用[3-5]。低聚果糖被腸道細菌發(fā)酵，產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸和乳酸等，降低腸道環(huán)境pH值，抑制有害細菌和病原菌的生長繁殖，減少場內(nèi)毒素和腐敗物質(zhì)的產(chǎn)生和積累。優(yōu)良的理化特性和生理功效使其得到廣泛的應用[6-8]。

本研究著力從復配溶菌酶和低聚果糖的角度，去完善單一功能物質(zhì)的不足，篩選安全輔料，研制安全且能更好有益于兒童健康成長的牙膏。

1 材料與方法

1.1材料

溶菌酶樣品為好易康生物科技(廣州)有限公司實驗室提供，低聚果糖樣品為量子高科(中國)生物股份有限公司提供，山梨醇樣品為山東天力藥業(yè)有限公司，黃原膠樣品為廣州浩天新材料有限公司，其他相關(guān)輔料均由市面采購的食品級原材料。

變異鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌由廣東省微生物研究所提供；涉及的試劑均為分析純。

1.2溶液配制

1.2.1溶菌酶水溶液的制備

準確稱量0.1g、0.2g、0.4g、0.6、1g、2g溶菌酶樣品，分別溶于50mL水中，最后定容至100mL，分別得0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、1%和2%含量的溶菌酶水溶液。

1.2.2低聚果糖水溶液的制備

準確稱量0.5g、1g、2g、3g、4g和5g低聚果糖樣品，分別溶于50mL水中，最后定容至100mL，分別得0.5%、1%、2%、3%、4%和5%含量的低聚果糖水溶液。

1.3抑菌效果檢測方法

按照《日化產(chǎn)品抗菌抑菌效果的評價方法(QB2738-2012)》中7.3作為檢測依據(jù)，以對變異鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑制率為考察指標，對物質(zhì)的抑菌效果進行評價。具體操作方法如下：

①用PBS(0.03mol/L磷酸鹽緩沖液)液將變異鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌稀釋成濃度為1×104～9×104cfu/mL；

②將試驗樣品用無菌標準硬水稀釋至合適低濃度；

③吸取試驗樣品原液5.0mL放入滅菌試管中，20℃恒溫5min；

④吸取試驗菌液0.1mL加入到含5.0mL樣品的試管中，迅速混勻，并立即計時；

⑤作用3min后，取試驗菌與樣品混合液0.5mL，加入到含4.5mL經(jīng)滅菌的PBS試管中，充分混勻；

⑥放置10min后，吸取樣液1mL，置于滅菌平皿內(nèi)，每個樣液接種兩個滅菌平皿，用涼至40～45℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15mL作傾注，轉(zhuǎn)動平皿，使其充分均勻，瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿，(35±2)℃培養(yǎng)48h后，做活菌菌落計數(shù)；

⑦以PBS替代試驗樣品，同時按以上步驟操作，作為對照樣品；

⑧實驗重復3次，求其平均值。計算公式如式1所示。式中，α為對照樣品平均菌落數(shù)，β為試驗樣品平均菌落數(shù)，結(jié)果保留整數(shù)。

1.4抑菌效果測定

1.4.1溶菌酶水溶液

將以上制得的0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、1.0%、2.0%溶菌酶水溶液共計6個樣品按照1.3方法，對變異鏈球菌(G-)、牙齦卟啉單胞菌(G-)、金黃色葡萄球菌(G+)、大腸桿菌(G+)4種口腔致病菌進行抑菌檢測。

1.4.2低聚果糖水溶液

將以上制得的0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%低聚果糖水溶液共計6個樣品按照1.3方法，對變異鏈球菌(G-)、牙齦卟啉單胞菌(G-)、金黃色葡萄球菌(G+)、大腸桿菌(G+)4種口腔致病菌進行抑菌檢測。

1.4.3溶菌酶復配低聚果糖溶液

在不增加抑菌物用量的前提下，即控制抑菌物質(zhì)的總量為5%，測試溶菌酶和低聚果糖在復配比例分別為5∶1、1∶1、1∶5、1∶10、1∶20和1∶50的抑菌效果，從而優(yōu)選最佳的復配比例。

1.5溶菌酶和低聚果糖復配物在牙膏用的應用

選定目前比較主流的碳酸鈣、磷酸氫鈣2種配方體系作為驗證配方，為了盡量避免其他原料的影響，配方中不添加任何其他的功能劑，同時不添加任何防腐劑。配方設計見表1。

表1 配方設計

1.6人體腸道菌群的影響實驗方法

1.6.1受試人群和分組

經(jīng)體檢指標全部正常的60名兒童(6～12歲)。

將其隨機分成試驗組1、試驗組2和對照組，每組20人，男女各半；其中試驗組1使用的樣品為二氧化硅體系牙膏，試驗組2使用的樣品為磷酸氫鈣體系牙膏，對照組使用的樣品為市售某品牌牙膏(不含溶菌酶、低聚果糖等非功效類普通牙膏)。

1.6.2刷牙方式

受試者統(tǒng)一發(fā)放牙膏及牙刷，按BASS刷牙法，每日早晚各刷牙1次，共2次，每次1min。

1.6.3實驗步驟

在給予受試樣品之前，無菌采取受試者糞便，檢查雙歧桿菌、乳桿菌等數(shù)量指標；連續(xù)刷牙30d，最后一次刷牙24h后，無菌采取受試者糞便，再次檢驗雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量指標。

1.6.4腸道菌群檢測方法

收集受試者新鮮糞便于便盆中，立即送檢。定量稱取標本，10倍稀釋并均漿后，分別接種至各選擇性培養(yǎng)基。

雙歧桿菌：BLL培養(yǎng)基37℃、48h厭氧培養(yǎng)。

乳桿菌：MRS培養(yǎng)基37℃、48h培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1溶菌酶水溶液的抑菌效果測定

將上述制得含量為0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、1.0%、2.0%溶菌酶溶液，按照1.3抑菌效果檢測方法，對變異鏈球菌(G-)、牙齦卟啉單胞菌(G-)、金黃色葡萄球菌(G+)、大腸桿菌(G+)4種口腔致病菌進行抑菌檢測。檢測結(jié)果如下，見表2。

表2 不同濃度溶菌酶抑菌效果

溶菌酶抑菌結(jié)果顯示：隨著溶菌酶水溶液濃度的上升，樣品抑菌率也隨之上升，但當濃度上升至0.4%后，抑菌能力提高緩慢，特別溶菌酶濃度為0.6%、1.0%、2.0%的樣品抑菌效果達到90%以上，且沒有顯著差異；同時還可以看出，革蘭氏陽性菌對溶菌酶較革蘭氏陰性菌更加敏感。

2.2低聚果糖水溶液的抑菌效果測定

將上述制得含量為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%低聚果糖溶液，按照1.3抑菌效果檢測方法，對變異鏈球菌(G-)、牙齦卟啉單胞菌(G-)、金黃色葡萄球菌(G+)、大腸桿菌(G+)4種口腔致病菌進行抑菌檢測。檢測結(jié)果如下，見表3。

表3 不同濃度低聚果糖抑菌效果

表3顯示不同含量的低聚果糖溶液對4種口腔致病菌基本沒有抑菌能力。不論是菌種的差異，還是低聚果糖濃度的高低，四種口腔致病菌表現(xiàn)對低聚果糖均不敏感。

2.3溶菌酶復配低聚果糖的抑菌效果

將溶菌酶和低聚果糖按比例為5∶1、1∶1、1∶5、1∶10、1∶20和1∶50的6個復配組方，且復配功效成分的總含量均為5%，將上述配方對4種口腔致病菌病進行抑菌檢測，結(jié)果見表4。

表4 不同比例的溶菌酶和低聚果糖復配抑菌效果

從表4可以看出，溶菌酶和低聚果糖復配組方抑菌率高低基本與溶菌酶含量相關(guān)，低聚果糖的添加既不會形成增效作用，也不能形成明顯的拮抗作用。因溶菌酶可以抑制口腔致病菌，低聚果糖可以使口腔、腸道有益菌快速增殖，所以總體而言，溶菌酶和低聚果糖復配具有現(xiàn)實可行性。

2.42種配方體系的抑菌效果測定

在二氧化硅體系和磷酸氫鈣體系的牙膏中添加0.45%的溶菌酶復配4.55%的低聚果糖(比例為1∶10)后，將這兩種體系的牙膏對4種口腔致病菌的進行抑菌檢測，結(jié)果見表5。

表5 不同配方體系牙膏的抑菌效果

從表5中可以看出，不含任何其他功能劑和防腐劑的兩種牙膏配方體系具有良好抑菌性能。同表4數(shù)據(jù)對比，此組方應用于牙膏中表現(xiàn)出更強的抑菌效果。

2.5腸道菌群檢測結(jié)果

依照1.6人體腸道菌群的影響實驗方法，對受試者腸道中雙歧桿菌和乳酸菌進行測定，測定結(jié)果見表6。

表6 腸道菌群檢測結(jié)果

從表6的結(jié)果可以看出，使用本組方的牙膏受試者的腸道有益菌雙歧桿菌和乳酸菌相比與使用不添加溶菌酶和低聚果糖的普通牙膏的對照組顯著增加，表明本組方的牙膏可有效增殖腸道有益菌，促進兒童和機體健康良好的發(fā)育。

3 結(jié)論及展望

①溶菌酶具有很好的抑菌效果，0.40%的溶菌酶對變異鏈球菌(G-)、牙齦卟啉單胞菌(G-)、金黃色葡萄球菌(G+)、大腸桿菌(G+)4種口腔致病菌已具有良好的抑菌效果；革蘭氏陽性菌對溶菌酶較革蘭氏陰性菌更加敏感。

②低聚果糖對變異鏈球菌(G-)、牙齦卟啉單胞菌(G-)、金黃色葡萄球菌(G+)、大腸桿菌(G+)4種口腔致病菌基本沒有抑制生長的能力。

③溶菌酶與低聚果糖比例在1∶10時，即溶菌酶含量0.45%，低聚果糖含量4.55%，該組方在二氧化硅體系和磷酸氫鈣體系的牙膏中表現(xiàn)出良好的抑菌效果，同時抑菌效果明顯強于兩組方單純復配的抑菌效果。這也充分說明牙膏基料中的成分也具有一定的抑菌效果。

④溶菌酶與低聚果糖比例在1∶10時，即溶菌酶含量0.45%，低聚果糖含量4.55%，該組方在二氧化硅體系和磷酸氫鈣體系的牙膏，在使用過程中均能很好地促進有益菌(雙歧桿菌和乳酸菌)的增殖。

⑤工作的不足之處在于，理論上溶菌酶具有抑菌效果，低聚果糖可以有益菌增殖，該組方使用過程中一方面溶菌酶呈現(xiàn)抑菌效果，一方面低聚果糖通過有益菌增殖與致病菌形成競爭關(guān)系，間接抑制口腔致病菌。本實驗抑菌效果驗證方法為體外單一菌種實驗，未進行臨床效果驗證，無法證明低聚果糖的間接抑菌效果。