劉 萍 伍 鵬 寧科功

(云南白藥集團(tuán)股份有限公司 云南 昆明650217)

引言

酪蛋白磷酸肽( casein phosphopeptide，CPP)是由牛乳酪蛋白經(jīng)胰蛋白酶降解產(chǎn)生的富含成簇磷酸絲氨?；亩嚯摹Ｑ芯勘砻鰿PP 通過(guò)自身結(jié)構(gòu)中大量的磷?；鶊F(tuán)，在中性或堿性條件下可結(jié)合亞穩(wěn)定狀態(tài)的無(wú)定型磷酸鈣( amorphous calcium phosphate，ACP) ，形成酪蛋白磷酸肽-無(wú)定型磷酸鈣復(fù)合物( casein phosphopeptide-amorphous calcium phosphate，CPPACP)，顯著增強(qiáng)磷酸鈣的溶解能力[1]，增加牙釉質(zhì)表面鈣離子和磷酸離子濃度，有利于牙齒表層再礦化。

羥基磷灰石(HAP Ca10(PO4)6(OH)2)是人牙釉質(zhì)的主要無(wú)機(jī)成分，約占總成分的97%以上,基本單元是針狀和柱狀的磷灰石晶體[1], 長(zhǎng)約40nm, 寬約20nm.牙釉質(zhì)再礦化的化學(xué)本質(zhì)是磷酸鈣體系的結(jié)晶過(guò)程；HAP生成經(jīng)歷由磷酸八鈣〔Ca8H2(PO4)6·5H2O〕→非晶態(tài)磷酸鈣〔Ca8(PO4)2·XH2O〕→缺鈣磷灰〔Ca10-Z(HPO4)Z(PO4)6-Z(OH)2-Z·XH2O→羥基磷灰石〔Ca10(PO4)6(OH)2·XH2O〕的復(fù)雜的相轉(zhuǎn)變過(guò)程[2,5]；鑒于納米羥基磷灰石特殊作用, 而其形狀和尺寸是其顯示納米效應(yīng)的關(guān)鍵, 因此,對(duì)納米HAP晶體的生成進(jìn)行有效調(diào)控, 以制備出與牙釉質(zhì)相同結(jié)晶形態(tài)，并能夠生長(zhǎng)于原釉質(zhì)上的HAP就可以修復(fù)受損牙釉質(zhì)；盡管羥基磷灰石同牙釉質(zhì)中的無(wú)機(jī)成分相似, 具有優(yōu)良的生物學(xué)性能。但是羥基磷灰石在牙表面降解緩慢, 因此采用非結(jié)晶形態(tài)的無(wú)定型磷酸鈣來(lái)直接代替穩(wěn)定的羥基磷灰石作為牙釉質(zhì)再礦化的鈣、磷源，可以改善降解性能及增強(qiáng)釉質(zhì)再礦化速度。

本研究以CPP為誘導(dǎo)劑，分別將羥基磷灰石及無(wú)定型磷酸鈣作為鈣、磷源，分別對(duì)受損牛齒牙釉質(zhì)進(jìn)行再礦化比較；以期找出能夠修復(fù)受損牛牙釉質(zhì)的方法；并展望了該技術(shù)在修復(fù)人牙釉質(zhì)中的應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要試劑和儀器

CPP( WAKO，日本)；羥基磷灰石(上海紫臨生物科技有限公司)；JSM-6460掃描電鏡(SEM)(日本JEOL會(huì)社); 維氏硬度計(jì)(THVS-5Z)。

1.2實(shí)驗(yàn)樣本制備

選取同一環(huán)境下同一批次的牛牙，收集新拔除的牛下切牙，體視顯微鏡(×10) 選唇側(cè)釉質(zhì)完整、表面光滑、顏色正常、無(wú)白斑、無(wú)裂痕、無(wú)磨損的牙;去凈軟組織，超聲洗滌，切取冠部釉質(zhì)塊。每個(gè)釉質(zhì)塊的唇側(cè)用800目砂紙磨出小平面，超聲洗滌，取3mm×2mm開窗區(qū)，其余部分用抗酸指甲油封閉，生理鹽水冷藏(4℃) 保存?zhèn)溆肹3]。

1.3實(shí)驗(yàn)溶液配制

1.3.1配制CPP-ACP礦化液:2g CPP溶解于144mmol /L磷酸鈉緩沖液( pH=7.0)50ml中，電磁力攪拌器攪拌，逐滴加入1mol /L的CaCl2溶液12ml，用KOH 維持恒定pH值; 用去離子水調(diào)整溶液體積至100ml。最終配制含2%CPP，120mmoL/L CaCl2，72mmoL/L磷酸鈉( pH=7.0) 的CPP-ACP溶液[4]。經(jīng)倍比稀釋得到1%CPP-ACP和0.5% CPP-ACP溶液。

1.3.2羥基磷灰石礦化液：分別將0.5g、1g、2g CPP溶解于100ml水中，并分別加入2g的固體羥基磷灰石粉末，磁力攪拌混合2h備用。

1.3.3配制人工唾液:0.07g CaCl2，0.04g MgCl2，2.23g KCl,0.54g KH2PO4，4.76g羥乙基哌嗪乙磺酸溶于800mL去離子水中，用NaOH調(diào)pH值至7.0，去離子水定容至1000mL。

1.4牙釉質(zhì)修復(fù)實(shí)驗(yàn)

取56個(gè)釉質(zhì)塊標(biāo)本隨機(jī)分為7組，每組8個(gè)樣本，分別置于0.5% CPP-ACP溶液、1.0% CPP-ACP溶液、2.0% CPP-ACP溶液、0.5% CPP-HAP混合液、1% CPP-HAP混合液、2% CPP-HAP混合液和去離子水7種溶液中;37℃水浴振蕩15min后取出；放入按1∶1的比例配制的人工唾液中，37℃恒溫保存。每日(24h)取出釉質(zhì)塊，重復(fù)以上步驟，共15天。然后取出牙釉質(zhì)塊，吹干，通過(guò)掃描電鏡觀察受損牙釉質(zhì)再礦化情況。

1.5礦化修復(fù)后牙釉質(zhì)硬度的測(cè)定

在維氏顯微硬度計(jì)測(cè)定各實(shí)驗(yàn)樣品的表面硬度，載荷50g，保荷15s。每個(gè)釉質(zhì)塊表面每個(gè)區(qū)域測(cè)3個(gè)點(diǎn)，各點(diǎn)相距200～300μm，結(jié)果取平均值[6]。

2 結(jié)果與討論

2.1CPP-ACP對(duì)牙釉質(zhì)修復(fù)的影響

圖1～圖4是牛牙釉質(zhì)及其在不同濃度的CPP-ACP中的再生情況的SEM圖片。

圖1 牛牙釉質(zhì)表面SEM

圖2 0.5%CPP-ACP對(duì)牛牙釉質(zhì)修復(fù)的SEM

圖3 1% CPP-ACP對(duì)牛牙釉質(zhì)修復(fù)的SEM

圖1.1 牛牙釉質(zhì)表面EDS Ca:P=1.95

圖2.1 0.5%CPP-ACP對(duì)牛牙釉質(zhì)修復(fù)的EDS Ca:P=1.83

圖3.1 1% CPP-ACP對(duì)牛牙釉質(zhì)修復(fù)的EDS Ca:P=1.99

圖4 2% CPP-ACP對(duì)牛牙釉質(zhì)修復(fù)的SEM

圖4.1 2% CPP-ACP對(duì)牛牙釉質(zhì)修復(fù)的EDS Ca:P=1.99

圖1.1是空白牛齒的EDS,空白受損牛齒表面為柱狀羥基磷灰石結(jié)晶，其鈣磷比為Ca:P=1.95；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.5%～2.0% CPP-ACP均可促進(jìn)受損牛牙釉質(zhì)沿固有方向生長(zhǎng)，相同時(shí)間內(nèi)0.5%、1%、2%的CPP-ACP誘導(dǎo)牙釉質(zhì)沿固有方向生長(zhǎng)的長(zhǎng)度分別是：小于10nm、介于10nm～50nm、大于50nm; 高濃度的CPP-ACP能更好的誘導(dǎo)受損牛齒表面的羥基磷灰石沿固有方向生長(zhǎng)；且當(dāng)濃度大于1%以后，其鈣磷比Ca:P=1.99與原釉質(zhì)的Ca:P=1.95更接近；對(duì)受損牛牙釉質(zhì)修復(fù)效果更好。

2.2CPP-HAP對(duì)受損牛牙釉質(zhì)修復(fù)的影響

圖5、圖6、圖7分別是不同濃度CPP-HAP對(duì)受損牛牙釉質(zhì)修復(fù)情況的SEM及EDS圖，圖片顯示各個(gè)濃度下CPP-HAP皆能在受損牛牙釉質(zhì)表面形成不規(guī)則的結(jié)晶，且致密程度比CPP-ACP更緊密，新長(zhǎng)出的礦物質(zhì)呈層狀堆積；鈣磷比與未礦化的牛牙釉質(zhì)(Ca:P=1.95)相近分別是1.96、1.83、1.93；說(shuō)明在受損牛牙釉質(zhì)表面形成的磷酸鈣鹽結(jié)合形式也是羥基磷灰石形態(tài)，但其結(jié)晶生長(zhǎng)形態(tài)與原牛牙釉質(zhì)完全不同，隨CPP濃度增加，再礦化的牛牙釉質(zhì)厚度增加，但呈非有序、非連續(xù)狀態(tài)。

圖5 0.5%CPP-HAP對(duì)牛牙釉質(zhì)修復(fù)的SEM

圖6 1%CPP- HAP對(duì)牛牙釉質(zhì)修復(fù)的SEM

圖 5.1 0.5%CPP-HAP對(duì)牛牙釉質(zhì)修復(fù)的EDS Ca:P=1.96

圖6.1 1%CPP-HAP對(duì)牛牙釉質(zhì)修復(fù)的EDS Ca:P=1.83

圖7 2%CPP-HAP對(duì)牛牙釉質(zhì)修復(fù)的SEM圖

圖7.1 2%CPP-HAP對(duì)牛牙釉質(zhì)修復(fù)的EDS Ca:P=1.93

2.3硬度

表1是受損牛牙釉質(zhì)在不同再礦化液中生長(zhǎng)15天后，吹干，并用維氏顯微硬度計(jì)測(cè)定各實(shí)驗(yàn)樣品的表面硬度，載荷50g，保荷15s。每個(gè)釉質(zhì)塊表面每個(gè)區(qū)域測(cè)3個(gè)點(diǎn)，各點(diǎn)相距200～300μm，結(jié)果取平均值，從表1可知，無(wú)論是CPP-ACP還是CPP-HAP再生的牙釉質(zhì)硬度都無(wú)法直接達(dá)到原釉質(zhì)的硬度293HV；CPP-ACP誘導(dǎo)原釉質(zhì)有序生長(zhǎng)，新長(zhǎng)出的釉質(zhì)硬度與原釉質(zhì)接近，且隨CPP濃度增加釉質(zhì)硬度增強(qiáng)，最大硬度為252HV;而CPP-HAP誘導(dǎo)再生的牙釉質(zhì)硬度下降較大，其硬度依然隨CPP濃度的增大而增強(qiáng),最大硬度為182HV。

表1 受損牛牙釉質(zhì)在不同再礦化液中再礦化15天后的硬度表

2.4討論

從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，盡管牛牙釉質(zhì)中的主要無(wú)機(jī)物是羥基磷灰石，然而在修復(fù)受損牛牙釉質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中，酪蛋白磷酸肽(CPP)誘導(dǎo)無(wú)定型磷酸鈣可以更好的修復(fù)牙釉質(zhì)，且可以誘導(dǎo)新長(zhǎng)出的釉質(zhì)沿其固有方向生長(zhǎng)，形成的新釉質(zhì)硬度與原釉質(zhì)硬度更接近，酪蛋白磷酸肽也可以直接誘導(dǎo)結(jié)晶型羥基磷灰石再礦化修復(fù)受損牛牙釉質(zhì)，但是不能夠誘導(dǎo)原釉質(zhì)沿固有方向結(jié)晶，而是在受損牛牙釉質(zhì)表面形成片層結(jié)構(gòu)，且硬度比原釉質(zhì)小100HV以上；二者相比CPP-ACP效果更好的原因，牙釉質(zhì)再礦化的化學(xué)本質(zhì)是磷酸鈣體系的結(jié)晶過(guò)程；從晶體結(jié)晶過(guò)程需要三個(gè)階段，一是過(guò)飽和溶液形成，二是形成晶核，第三是形成晶體[1,7,8]；在牛牙釉質(zhì)再生這個(gè)過(guò)程中晶核的形成過(guò)程是取決定性作用的過(guò)程和勢(shì)能最大的過(guò)程，CPP-ACP體系過(guò)飽和溶液中鈣和磷都是以離子的形態(tài)存在；晶核的形成是以受損牛齒釉質(zhì)本身的晶體為晶核來(lái)生長(zhǎng)的，加上CPP本身通過(guò)電荷吸附于牛齒釉質(zhì)表面[5,8]誘導(dǎo)新形成的羥基磷灰石生長(zhǎng)，隨著CPP-ACP濃度的增加，其維持鈣磷離子濃度的能力提高，再礦化效果亦增加。所以形成的新釉質(zhì)與原釉質(zhì)層性狀及硬度都更加接近；而在CPP-HAP體系中，雖然體系中的HAP與原釉質(zhì)的組成一致，但是要修復(fù)牙釉質(zhì)，則需讓已經(jīng)結(jié)晶的HAP經(jīng)歷溶解形成過(guò)飽和鈣、磷離子體系，再經(jīng)過(guò)CPP誘導(dǎo)成核再結(jié)晶的過(guò)程[9,10]，因?yàn)镠AP在該體系的溶解度很低，所以很難形成高濃度的過(guò)飽和溶液，再加上本來(lái)HAP具有一定的結(jié)晶形態(tài)，當(dāng)溶解以后，過(guò)飽和離子因其成核需要的勢(shì)能過(guò)高，更傾向于在原來(lái)的HAP晶核上再結(jié)晶，雖然經(jīng)CPP誘導(dǎo)其再礦化過(guò)程也發(fā)生在受損牛齒的表面，但其結(jié)晶形態(tài)則受到添加的HAP自身的結(jié)晶形態(tài)影響，形成了片層結(jié)構(gòu)，其結(jié)晶形態(tài)的不同亦導(dǎo)致硬度與固有釉質(zhì)的硬度差異。

3 結(jié)論與展望

在人工唾液及37℃培養(yǎng)箱中，CPP-ACP體系及CPP-HAP體系均可以誘導(dǎo)受損牛齒釉質(zhì)礦化再生；且再生程度隨CPP濃度增加而增加；CPP-ACP體系誘導(dǎo)再生牛牙釉質(zhì)的能力大于CPP-HAP體系，與原釉質(zhì)結(jié)晶形態(tài)、鈣磷比及硬度都更加結(jié)近，CPP-ACP可以提供更有利于牛牙釉質(zhì)再生所需要的鈣、磷離子，且沒有其它晶核影響再礦化晶體生長(zhǎng)，在CPP的誘導(dǎo)下再礦化的新釉質(zhì)更傾向于沿固有晶體結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)，更有利于新釉質(zhì)的形成；本實(shí)驗(yàn)采用的是與人齒結(jié)近的牛齒為研究對(duì)象，雖然研究結(jié)果中新生的牛牙釉質(zhì)與原釉質(zhì)還有一定的差別，但基本達(dá)到了受損牛牙釉質(zhì)再生的目的；由于采用的原料安全，該實(shí)驗(yàn)也有望在人牙釉質(zhì)再生中實(shí)現(xiàn)，可以徹底改變通過(guò)氟化物來(lái)強(qiáng)化牙釉質(zhì)的現(xiàn)狀，從而解決氟化物可能引起的中毒等問(wèn)題，同時(shí)牙釉質(zhì)是牙齒第一層保護(hù)基質(zhì)，牙釉質(zhì)修復(fù)技術(shù)可以解決牙齒的敏感、蛀牙、美白等問(wèn)題，其應(yīng)用前景非常廣闊。